TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Transcripción

1 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

2 Algunas preguntas (elementales): - Para que sirve? - Qué preguntas puede responder? Algunas aplicaciones: - Aislamiento o knockout de un gen de su contexto genético para ver su actividad, función, interacción, etc., en forma individual. - Producir grandes cantidades de una proteína industria - Generar un organismo genéticamente modificado (con gen/genes de interés) levaduras, plantas, bacterias, virus, etc. - Herramientas para la mejora en el diagnóstico, tratamiento, etc.

3 - Tecnología del ADN recombinante: Es la aplicación de un paquete de herramientas moleculares para obtener un microorganismo modificado genéticamente o aislar un gen. - Vector: Elemento que utilizo como soporte para contener, expresar y utilizar el material genético de interés. - Clon: Población de microorganismos (modificados genéticamente) idénticos entre sí. Solo algunas

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5 -Enzima de restricción Tipo II sitio específico de restricción: EcoRI 5 -G/AATTC-3

6 -Enzima de restricción Tipo II sitio específico de restricción: EcoRI G A A T T C C T T A A G Secuencias Palindrómicas extremos cohesivos 5 3 G A A T T C C T T A A G 3 C C G G G G C C 5 extremos romos

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9 Vectores de clonado y de expresión Vectores de clonado: - Moléculas de ADN en las cuales se pueden introducir o clonar fragmentos (genes) de ADN - Generalmente son plásmidos y bacteriófagos Vectores de expresión: - Son vectores de clonado especializados para expresar un gen en la célula hospedadora (generalmente E. coli) - Contiene secuencias reguladoras que regulan/estimulan la expresión de un gen --> Elementos necesarios: PROMOTOR, SITIO DE UNION A RIBOSOMA (RBS), INICIO TRANDUCCIÓN, TERMINACIÓN DE TRANDUCCIÓN.

10 Vector de clonado MCS (multi-cloning site) o polylinker

11 Ejemplo de clonado EcoRI Gen resistenci a ADN cromosomal ADN cortado en miles de fragmentos con extremos EcoRI EcoRI plasmido Ligación Inserto G CTTAA G AATTC CTTAAG Inserto G AATTC CTTAAG AATTC G

12 pbr322 Plásmidos BamHI SpHI SalI Amp R= MCS Cepa: S/ampR Tamaño: 4361 pb ColE1, no Relajado Tet R

13 Ejemplo de clonado Plasmido pbr322 Inserto en sitio psti

14 puc19 LACI p Lac BamHI EcoRI Plásmidos Frag LacZ 5-ATG AAT GGA TCC CCC GAA TTC CAG CAT TAG-3 5-CAT TTA CCT AGG GGG CTT AAG GTC GTA ATC-3 BamHI EcoRI O Lac Amp R ColE1, no Relajado/ relajado Cepa: complem. DH5 Xl1Blue Tamaño: 3162 pb

15 Ejemplo de clonado: - Plasmido puc19 - Placa de agar con: Ampicilina + X-gal + IPTG Sin inserto Con inserto Colonia a ser estudiada

16 Ejemplo de clonado: - Plasmido pgem-t / TOPO - Placa de agar con: Antibiótico + X-gal + IPTG (opcional) 5 Producto de PCR 5 Taq-polimerasa: deja una A extendida en extremo 3 del amplicon 5 A A T + T 5 Extremo cohesivo!!! Plásmido linealizado con T Si no hay ligación la bacteria no tiene la Resistencia del plasmido no crece Si hay ligación la bacteria crece ver si el inserto es el esperado!!!!

17 pgem-t LACI EcoRI EcoRI Cepa: complem. DH5 Xl1Blue Tamaño: 3015 pb Plásmidos p Lac O Lac sp6 -T T- Frag LacZ T3 ColE1, relajado Amp R

18 Plásmidos pcr-topo

19 Clonado para expresión de un gen Promotor regulable Gen de resistencia His-tag (opcional) RBS (sitio unión de ribosoma) Polylinker T1: terminador traducción T2: terminador traducción OriC

20 RNA polymerase lac Expression Regulation Promoter lac site RBS ATG- your gene X lac repressor IPTG (or lactose, etc) Promoter lac site RBS ATG- your gene IPTG Transcription Promoter lac site RBS ATG- your gene mrna

21 A tener en cuenta! Genes eucariotas tienen intrones-exones!!! En procariotas la secuencia del gen no debe tener intrones. Debe estar la secuencia a expresar. Modificaciones post-traduccional Cuál es la diferencia entre la expresión en procariotas y eucariotas? - Modificación post-traduccional de la mayoría de las proteínas eucariotas - Las células procariotas no pueden realizar esas modificaciones!!! Formación de uniones disulfuro correctas Clivaje proteolítico del precursor inactivo Glicosilación- agregado de residuos de azúcar Alteración de aminoácidos en la proteína fosforilación acetilación agregado de grupos sulfato Agregado de ácidos grasos

22 Codon Usage in E. coli & humans

23 A clonar!!! Metionina NcoI inicial His-Tag BtgI 51 CTTTAATAAG GAGATATACC ATGGGCAGCA GCCATCACCA TCATCACCAC M G S S H H H H H H Polylinker SacI AscI SbfI SalI NotI BamHI EcoRI EcoICRI BssHII PstI AccI HindIII 101AGCCAGGATC CGAATTCGAG CTCGGCGCGC CTGCAGGTCG ACAAGCTTGC S Q D P N S S S A R L Q V D K L A Y encima hay clonar in frame???!!!

24 Y encima hay clonar in frame???!!! NcoI BtgI 51 CTTTAATAAG GAGATATACC ATGGGCAGCAGCCATCACCATCATCACCAC M G S S H H H H H H SacI AscI SbfI SalI NotI BamHI EcoRI EcoICRI BssHII PstI AccI HindIII 101AGCCAG/GATCCGAATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAGGTCGACAAGCTTGC S Q D P N S S S A R L Q V D K L G/GATCCtccatgcaacatggatgcgatc G/GATCC D P P C N M D A I Inserto G/GATCCNtccatgcaacatggatgcgatc G/GATCC D P S M P H G C D G/GATCCNNtccatgcaacatggatgcgatc G/GATCC D P X H A T W M R

25 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE Como ingresa el vector- ADN clonado a la célula? COMPETENCIA Natural Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria Inducida Modificación artificial de la pared celular (ingeniería genética en E. coli): 1. Transformación por Calcio: cultivo en presencia de Ca +2 + shock térmico : Nº transformantes Eficiencia = = 10 6 transf./ g ADN input de ADN 2. Electroporación: formación de poros en la membrana celular por exposición a pulso eléctrico de alto voltaje: V = V - (2 mm) T = 4-5 mseg. Eficiencia = transf./ g ADN