PROCEDIMIENTO PARA IDENTIFICACION BIOQUIMICA DE CEPAS DE LISTERIA MONOCYTOGENES AISLADAS EN ALIMENTOS Y AMBIENTE

Transcripción

1 PRT Página 1 de OBJETIVO Obtener confirmación mediante la caracterización bioquímica de cepas aisladas y presuntivas de Listeria monocytogenes. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicable a todas las cepas aisladas de muestras de alimentos y ambientales. 3. FUNDAMENTO Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para la identificación presuntiva del género Listeria aislados de muestras de alimentos y ambiente puede usar ensayos convencionales o kit bioquímicos comerciales. Estos últimos basados en la demostración o verificación mediante respectivos análisis de laboratorio de una adecuada correlación entre el kit comercial y las pruebas bioquímicas convencionales. Los kits comerciales se basan en las propiedades enzimáticas que contiene el microorganismo y su actuar en los substratos deshidratados que permite que sean convertidos en productos metabólicos finales los cuales son detectados por el sistema al producir un cambio visible de color. Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.

2 PRT Página 2 de REFERENCIAS 4.1 Bacteriological Analytical Manual online. Carpeta 10, enero Official Methods of Analysis AOAC. Capìtulo 17, subcarpeta 10 edición 18, Sistema de identificación API Listeria, biomérieux SA. 5. TERMINOLOGÍA No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 Reactivos y Medios de cultivo Agar sangre Nº Sangre de cordero defibrinada Kit tinción Gram Solución de peróxido de hidrógeno al 3% (test catalasa) Solución de KOH al 40% (test acetoína) α- naftol al 5% en alcohol (test acetoína) Medio Reducción nitrato Caldo nutritivo Solución salina 0,85% Caldo base de fermentación púrpura de bromocresol SIM o medio prueba motilidad Reactivo ácido sulfanílico al 0,8% (test nitratasa) Reactivo de α- naftol al 0,5% en ácido acético al 5N o Reactivo de N-(1 naftil) etilendiamina al 0,125% en ácido acético al 5N (test nitratasa) Sistema API Listeria ( opcional)

3 PRT Página 3 de Materiales y equipos Incubadora a 30º C y a 35º C ± 1 ºC Microscopio binocular Tubos de fermentación (Durham) Asas de inoculación Asas de punta para inoculación Tubos de 16 x 160 mm con tapa a rosca Tubos de 12 x 120 mm con tapa a rosca Placas de Petri 7. DESARROLLO 7.1 Perfil bioquímico convencional De los cultivos de colonias presuntivas de Listeria monocytogenes puras y aisladas en placa de agar Soya tripticasa con extracto de levadura 6% a 30º C por 24 a 48 h, examinar sus características y realizar las pruebas siguientes: Motilidad: Picar colonias típicas y examinar motilidad formando una suspensión usando solución salina al 0,85%, emulsionar bien y observar al microscopio con objetivo de inmersión de fase de contraste. Observar: bastones delgados cortos, con suave rotación o no móviles Catalasa: En un tubo estéril agregar 0,3 ml de peróxido de hidrógeno al 3% y suspender una colonia con aplicador de madera o asa de platino ( no utilizar asa de nicrom-níquel). Observar la formación de burbujas indica prueba positiva Tinción Gram: Todas las Listerias spp son bacilos cortos Gram positivos. Sin embargo algunos cultivos pueden presentar una morfología variable y algunas pueden observarse en forma de cocos. También pueden presentar una distribución en empalizada similar a células difteriodes Hemólisis: Preparar placas de agar sangre de cordero al 5%, que contengan aproximadamente 15 ml de agar, lo ideal es obtener una profundidad inferior a 5 mm, esto se puede lograr efectuando superposición del agar en 1-2 mm. Utilizar la placa con agar sangre bien seca (comprobar que están libre de humedad antes de usar). Se puede

4 PRT Página 4 de 15 confeccionar una red de cuadrantes para sembrar en cuñas. Siempre considerar controles positivos: Listeria monocytogenes y Listeria ivanovii y control negativo: Listeria innocua. Incubar por h. Observar las placas con luz brillante y evidenciar la presencia de hemólisis. Listeria monocytogenes y Listeria seeligeri presenta una suave hemólisis (β- hemólisis). Al contrario Listeria ivanovii, presenta una hemólisis fuerte e intensa y Listeria innocua no presenta hemólisis. Resolver hemólisis dudosas con prueba de CAMP (Christie- Atkins- Munch-Peterson test) si fuera necesario Prueba de reducción nitratos a nitritos: esta prueba es opcional.inocular en caldo nitrato e incubar por 5 días a 35ºC. Agregar 0,2 ml del reactivo de α naftilamaina y del ácido sulfanílico. Observar la formación anillo rojo, reacción positiva. Si no se forma anillo rojo-violeta agregar polvos de zinc y mantener durante una hora, si se forma anillo rojo-violeta, la reacción es negativa y si no se forma color la reacción es positiva. Listeria monocytogenes no reduce nitratos a nitritos. Si utiliza α- naftol y ácido sulfanílico, la coloración que se observa es anaranjada para la reacción positiva y si no se forma color agregar polvos de Zinc y la presencia de color naranjo indica reacción negativa y la ausencia de color indica reacción positiva Movilidad: Inocular agar SIM o MTM e incubar por 7 días a temperatura ambiente. Observar diariamente. Listeria spp son móviles, dando un crecimiento en paraguas como patrón típico de crecimiento. El agar MTM es mejor para observar la movilidad. Si no dispone de estos agares observar la emulsión preparada a partir del agar TSA con extracto de levadura incubado a 30º C, con microscopía de contraste de fases (x 1000). Ver Fermentación de carbohidratos: Inocular caldo base de púrpura de bromocresol con 0,5% de carbohidrato (el uso de campanas Durham es opcional): dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Se puede hacer una batería corta sólo con manitol, ramnosa y xilosa cuando se utilizan otras pruebas adicionales y complementarias como sistema API. Incubar por 7 días a 35ºC. Observar la producción de ácido sin gas. Todas las especies son positivas a dextrosa, esculina y matosa. Si en Palcam, OXA, LPM, en la prueba de esculina se observa una pigmentación inequívoca, puede omitir la prueba de esculina en caldo. Listeria monocytogenes es manitol negativo, ramnosa positiva y xilosa negativa.

5 PRT Página 5 de Test de CAMP: Esta prueba es útil cuando las hemólisis son ambiguas. Para realizar la prueba inocular por estría una cepa de S. aureus β- hemolítico y en paralelo y diametralmente opuesto una cepa de Rhodococcus equi en un aplaca de agar sangre de cordero. Siembre por estría varios cultivos de ensayo en paralelo el uno del otro en forma uniforme pero en ángulo recto hacia y entre S. aureus y Rhodococcus. Incube a 35º C por h. Observar después de la incubación examine las reacciones hemolíticas de L. monocytogenes y L. seeligeri las que se incrementan en la zona influenciada por la hemólisis de S. aureus. Siguen siendo las otras especies no hemolíticas. La reacción de Listeria monocytogenes suele ser óptima a las 24 h en lugar de las 48 h.. Para obtener suficiente R. equi para proporcionar un buen equilibrio, incubar el cultivo inclinado 48 h en lugar de 24 h. Se recomienda el uso de las cepas conocidas de control de Listeria spp. sobre una placa de agar sangre de cordero. Placas de agar sangre de cordero debe ser lo más fresca posible Se pueden usar kits comerciales (pruebas complementarias pueden ser necesarias) como Vitek o API Listeria el cual no requiere un aprueba adicional de CAMP. 7.2 Perfil Bioquímico comercial Sistema API Listeria La galería API es un sistema estandarizado para la identificación de Listeria que utiliza ensayos miniaturizados, así como una base de datos específica. El sistema consta de 10 microtubos que contienen los sustratos deshidratados y permiten la realización de ensayos enzimáticos o de fermentación de azúcares Las reacciones que se producen durante la incubación se traducen en cambios de color, bien espontáneos o bien provocados mediante la adición de reactivos.

6 PRT Página 6 de La lectura de estas reacciones se realiza con la ayuda de la Tabla de Identificación y la interpretación se realiza tras consultar la lista de perfiles de la ficha técnica o con la ayuda de un software de identificación La composición de la galería API Listeria está conformada por: Galería API Listeria, Ampollas de suspensión medium (agua desmineralizada), ampolla de Reactivo ZYM, cámaras de incubación, hoja de resultados y ficha técnica Material necesario adicional: McFarland Standard 1, programa apiweb, pipetas o PSIpettes, protege ampollas, gradillas para ampollas, equipo general de laboratorio Reactivo complemetario: Agar Ottaviani Agosti (OAA) o chromagar Listeria Precauciones: No emplear los reactivos después de su fecha de caducidad, antes de su utilización verificar la integridad del envase y sus componentes, no utilizar galerías que hayan sufrido alguna alteración física: cúpula deformada, bolsa de deshidratante abierta, etc.; antes de su utilización permitir que los reactivos alcancen la temperatura ambiente Abrir las ampollas: en forma delicada realizar lo siguiente: Introducir la ampolla en el protege-ampolla Sujetar verticalmente el conjunto en una mano (tapón blanco hacia arriba) Presionar a fondo el tapón Luego cubrir la parte inclinada del tapón con la primera falange del pulgar Ejercer una presión con el pulgar en la base de la tapa inclinada del tapón para romper la extremidad de la ampolla Otra alternativa es ejercer una presión horizontal con el pulgar en la parte estriada del tapón para romper la extremidad de la ampolla Retirar la ampolla del protege-ampolla y conservarlo para un próximo uso En el caso de la ampollas sin tapón cuentagotas, retirar delicadamente el tapón En el caso de ampolla con tapón cuentagotas, invertir la ampolla y mantenerla en posición vertical. Aplicar una presión lateral sobre el tapón para transferir la totalidad del reactivo al frasco cuentagotas. Para usar posteriormente se recomienda apretar el tapón antes de invertir la ampolla con el fin de aspirar todo el resto de reactivo y evitar que se derrame por el exterior del tapón.

7 PRT Página 7 de Condiciones de almacenamiento: las galerías se conservan a 2-8º C hasta la fecha límite de utilización indicada en el envase Los medios se conservan a 2-30º C hasta la fecha límite de utilización indicada en el envase Conservar los reactivos en la oscuridad a 2-8º C hasta la fecha límite de utilización indicada en el envase Tras la apertura de las ampollas y transferir los reactivos a los frascos cuentagotas, los reactivos pueden conservarse un mes (o hasta la fecha límite de su utilización si ésta fuera anterior): anotar la fecha de apertura sobre la etiqueta de los frascos Como el reactivo ZYM B es muy sensible a la luz verificar el aspecto del reactivo antes de transferirlo al cuentagotas El reactivo ZYM B presenta en su estado normal una coloración amarilla a ámbar. Eliminar el reactivo si se observa una coloración rosa (alteración).una exposición corta a la luz del laboratorio (alrededor de 1 hora) entraña una degradación del reactivo Utilización del reactivo ZYM B: abrir ampolla sin lo descrito en numeral Agregar una gota de reactivo Volver a cerrar bien el frasco después de su uso y conservar según el punto Muestras: Recogida y Preparación: la galería API Listeria no debe ser utilizada directamente a partir de muestras de origen clínico o de otro tipo En una primera fase, los microorganismos a identificar deben aislarse sobre un medio de cultivo apropiado siguiendo las técnicas usuales en bacteriología Modo operativo Selección de las colonias Verificar que la cepa a estudiar pertenezca al género Listeria (bacilos cortos, Gram- positivos, polimorfos, móviles a 25º C pero no a 37º C, catalasa positivos y oxidasa negativos) Dado que las muestras contienen con frecuencia una mezcla de varias especies de Listeria, resulta preferible realizar un subcultivo sobre agar con sangre a partir de una colonia bien aislada.

8 PRT Página 8 de Incubar la placa a 24 h a 36º C ± 2º C Se pueden usar los siguientes medios para aislar las colonias antes del empleo galería API Listeria: medios a base de agar con sangre no selectivos, tipo Columbia o TSA, con o sin antibióticos; medios selectivos para Listeria con excepción del medio McBride que inhibe la expresión enzimática de bacterias sobre la galería API Listeria. Si se empleara este medio para aislamiento, realizar un subcultivo sobre agar con sangre Preparación de la galería Reunir fondo y tapa de un cámara de incubación y repartir aproximadamente 3 ml de agua destilada o desmineralizada (o cualquier agua sin aditivos ni derivados susceptibles a liberar gases (Ej: Cl 2, CO 2 ) en los alvéolos del fondo para crear una atmósfera húmeda Escribir la referencia o la identificación de las muestras o cepas en la lengüeta lateral de la cámara (no escribir la referencia o identificación sobre la tapa, ya que ésta puede resultar extraviada durante la manipulación Sacar una galería de su envase individual Colocar la galería en la cámara de incubación Eliminar la bolsita antihumedad Preparación del inóculo Abrir una ampolla de API Suspensión Medium (2 ml) como se indica en el punto Con la ayuda de una pipeta o PSIpette, coger colonias bien aisladas. Se recomienda utilizar cultivos jóvenes (18 a 24 h) Realizar una suspensión de turbidez igual a 1 de McFarland. Esta suspensión debe ser utilizada de inmediato. Observar el tipo de hemólisis y anotarlo en la hoja de resultados, ya que esta característica constituye un ensayo adicional al API pero de gran importancia Inoculación de la galería Repartir la suspensión bacteriana precedente, en los tubos evitando la formación de burbujas (para ello inclinar la cámara de incubación hacia delante y colocar la pipeta o la PSIpette en un lado de la cúpula).

9 PRT Página 9 de Llenar el tubo y la cúpula del ensayo DIM (100 µl aprox.) cuidando que no se produzca un menisco convexo Llenar solamente la parte del tubo de los ensayos ESC a TAG (50 µl aprox.) La calidad del llenado es muy importante ya que los tubos con excesiva o insuficientemente llenos originan resultados falsos positivos o negativos Cerrar la cámara de inmediato Incubar de horas a 36º C ± 2º C en atmósfera aerobia. PI Listeria Cerrar PRUEBAS NEGATIVAS PRUEBAS POSITIVAS Lectura Agregar una gota de reactivo ZYM al ensayo DIM Pasados 3 minutos leer todas las reacciones haciendo referencia a la Tabla de identificación de la ficha técnica Anotar las reacciones +/ - en la hoja de resultados Anotar igualmente el tipo de hemólisis El resultado de este ensayo no se tiene en cuenta en la interpretación de la galería.

10 PRT Página 10 de Interpretación La identificación se obtiene a partir del perfil numérico. En la hoja de resultados, los test están separados en grupos de 3 y se asigna para cada uno un valor 1, 2 ó 4. Para ello, las pruebas de la galería se separan en grupos de tres y se da a cada reacción positiva un valor igual a 1, 2 ó 4 dependiendo de la posición de la prueba en su grupo, 1ª, 2ª, 3ª respectivamente El principio de codificación es condensar la información binaria (+, -) en un perfil numérico La suma de los 3 valores obtenidos (0 para reacciones negativas) dan una cifra entre 0 y 7 para cada grupo Colocar el cursor en el campo que usted desee rellenar Sumando en el inferior de cada grupo los números que corresponden a reacciones positivas, se obtiene 4 cifras que constituye el perfil numérico Identificación Se realiza mediante la base de datos (V 1.2) Con la ayuda del perfil numérico en la lista de la ficha técnica; esta lista no exhaustiva, en caso de un perfil inexistente, consultar uno de los programas citados o con la Asistencia técnica de biomerieux Por medio del software de identificación apiweb Introducir manualmente por teclado el perfil numérico de 4 cifras Es posible introducir directamente: - "+", "-" o "?" en los campos superiores de la galería. Las cifras correspondientes se visualizarán en los campos inferiores. - las cifras (0-7) en los campos inferiores La tecla (tab) del teclado permite pasar de un campo a otro El botón Reinicializar permite cancelar la introducción anterior Una vez rellenos los campos, pulsar el botón Validar para visualizar los resultados. Pueden añadirse una referencia y comentarios a la página de los resultados.

11 PRT Página 11 de DIM ESC MAN DARL XYL RHA MDG RIB G1P TAG HEM Validar BUENA IDENTIFICACION Galería API LISTERIA V1.2 Perfil Nota Taxón significativo % ID T Pruebas en contra Listeria monocytogenes Taxón siguiente % ID T Pruebas en contra Listeria innocua DIM 99% Control de calidad Los medios y reactivos son objeto de controles de calidad sistemáticos durante las diferentes etapas de su fabricación El usuario debe realizar además un control bacteriológico de los ensayos de la galería, utilizando las cepas: Listeria innocua ATCC preferentemente o una de las cepas siguientes: Listeria ivanovii ATCC BAA-139 o Listeria monocytogenes ATCC

12 PRT Página 12 de Los resultados esperados se resumen el cuadro siguiente: Cepa DIM ESC αman DARL XYL RHA MDG RIB G1P TAG L. innocua L.ivanovii V - +* - L. monocytogenes * Ocasionalmente (-). Perfiles obtenidos después de cultivo sobre agar Columbia con sangre de cordero Límites de ensayo El sistema API Listeria está destinado únicamente a la identificación de bacterias del género Listeria presentes en la base de datos (tabla de identificación) No puede utilizarse para identificar otros microorganismos ni para excluir su presencia Sólo se pueden utilizar medios puros que contengan un solo tipo de microorganismo Eliminación de desechos Eliminar el Reactivo ZYM B no utilizando siguiendo los procedimientos relativos a los desechos químicos peligrosos Eliminar todos los reactivos utilizados o no utilizados (diferentes al ZYM B), así como el material de un solo uso contaminado siguiendo los procedimientos relativos a los productos infecciosos o potencialmente infecciosos.

13 PRT Página 13 de REGISTROS Identificación del registro Hoja Registro resultados análisis Listeria monocytogenes RG Almacenamiento Protección Recuperació n Archivador rojo Acceso Papel rotulado Registros restringido al resultados análisis personal Sección Listeria Microbiología monocytogenes Laboratorio 338 Tiempo retención y disposición 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos 9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio Fecha Aprobación 10. ANEXOS Anexo Nº 1 Tabla de identificación API Listeria. Anexo Nº 2 Tabla diferenciación especies de Listeria BAM online. Anexo Nº 3 Hoja Registro resultados análisis Listeria monocytogenes RG

14 PRT Página 14 de 15 Test DIM Componente s activos Substrato enzimático ANEXO Nº 1 TABLA DE IDENTIFICCAIÓN API LISTERIA Cantidad Mg/cúp. Reacciones Resultados Negativo Positivo 0,106 Diferenciación ZYM B /< 3 min L. innocua/ L. Naranja pálido Naranja monocytogenes Rosa beige Gris beige 0,16 Hidrólisis (ESCulina) Amarillo negro 0,024 pálido 0,045 Α- MANosidasa Incoloro Amarillo MDG ESC Esculina citrato férrico αman 4-nitrofenilαDmanopiranosi da DARL D- Arabinol 0,4 Acidificación (D-Arabinol) XYL D-Xilosa 0,4 Acidificación ( Xilosa) RHA L-Rhamnosa 0,4 Acidificación(RHAmnosa) Metil-αDglucopiranosi do 0,4 Acidificación (Metil-αD- Glucopiranosido) RIB D-Ribosa 0,4 Acidificación (RIBosa) GP1 Glucosa-1 Fosfato 0,4 Acidificación (Glucosa-1- Fosfato) TAG D-Tagatosa 0,4 Acidificación (TAGatosa) Rojo/ rojo anaranjado Amarillo/ amarillo anaranjado Se pueden ajustar las cantidades en función de los títulos de las materias primas. Ciertas cúpulas contienen componentes de origen animal especialmente peptonas.

15 PRT Página 15 de 15 ANEXO Nº 2 TABLA DIFERENCIACIÓN ESPECIES DE LISTERIA Table 1. Differentiation of Listeria species Acid produced from Species -Hemolysis a Mannitol Rhamnose Xylose Virulence b L. monocytogenes L. ivanovii c L. innocua - - V d - - L. welshimeri - - V d + - L. seeligeri L. grayi e - + V d - - a Placa agar sangre cordero. b Ensayo en ratón. c Cepas fermentadoras de ribosa son clasificadas como Listeria ivanovii subsp. Ivanovii. Cepas no fermentadoras de ribosa son clasificadas como.listera ivanovii subsp. londiniensis. d V biotipos variables. e Incluye dos subespecies: L. grayi subsp. Murrayi que reduce nitratos a nitritos y L. grayi subsp. grayi que no reduce nitratos a nitritos.