MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS. Resumen de las prácticas de Microbiología de Alimentos

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1 MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Resumen de las prácticas de Microbiología de Alimentos 1 Ingeniero Técnico Agrícola Industrias Agrarias y Alimentarias CURSO Profesora: Cristina Solano Goñi cristina.solano@unavarra.es Tfno. Contacto: Instituto de Agrobiotecnología

2 RECUENTO DE AEROBIOS MESÓFILOS (ISO 4833, 2003) 10 g muestra 90 ml caldo peptona Filtrar y preparar diluciones seriadas X 2 1 ml 1 ml 1 ml Añadir PCA ml, C Agitar homogeneizando Suspensión madre: 45 min a Tª amb como máximo, antes de añadir el medio 30 ±1 C 72 ±3 h Recuento placas Colonias

3 RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS EN PLACA (ISO 7402, 1993) 10 g muestra 90 ml caldo peptona Filtrar y preparar diluciones seriadas X 2 1 ml 1 ml 1 ml Añadir VRBG ml, C Agitar homogeneizando Añadir doble capa Suspensión madre: 45 min a Tª amb como máximo, antes de añadir el medio Recuento placas Colonias típicas (colonias color violeta con halo de precipitación) Confirmación 5 colonias pase a Agar nutritivo Colonias confirmadas como Enterobacterias oxidasa KIA + (fermentación de glucosa) Si es oxidasa Se siembra un KIA

4 RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS (NF ISO 7954, 1988) 10 g muestra 90 ml caldo peptona Filtrar y preparar diluciones seriadas X 2 1 ml 1 ml 1 ml Añadir OGA ml, C Agitar homogeneizando Suspensión madre: 15 min a Tª amb como máximo, antes de añadir el medio 25 ±1 C 5 días Recuento placas Colonias

5 RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA (NF ISO 4832, 1991) 10 g muestra 90 ml caldo peptona Filtrar y preparar diluciones seriadas ml 1 ml 1 ml X 2 Añadir VRBL ml, C Agitar homogeneizando Añadir doble capa Suspensión madre: 45 min a Tª amb como máximo, antes de añadir el medio Recuento placas Colonias típicas (colonias color violeta rodeadas o no de halo de precipitación)

6 INVESTIGACIÓN DE Escherichia coli: PRESENCIA/AUSENCIA 10 g muestra 90 ml caldo peptona Filtrar a un tubo estéril 10 ml de muestra 44 C h 10 ml caldo EC (DC) con campana Durham precalentado a 44 C POSITIVO: Presencia de gas en 1/10 parte de la campana Confirmación Prueba del indol NEGATIVO: Ausencia de gas en 1/10 parte de la campana AUSENCIA 0,1 ml Caldo de triptona 44 C Añadir 3 o 4 gotas del reactivo de Kovacs POSITIVO: anillo rojo PRESENCIA NEGATIVO: no anillo rojo AUSENCIA

7 RECUENTO DE Staphylococcus coagulasa positivo EN PLACA (ISO 6888, 1999) 10 g muestra 90 ml caldo peptona Filtrar y preparar diluciones seriadas ,1 ml 0,1 ml 0,1 ml X 2 Baird Parker Extender el inóculo con perlas de vidrio estériles 24 + CATALASA Opcional + Placas colonias típicas y no típicas. Confirmación: inocular tubos de BHI con 3 colonias típicas y 3 colonias no típicas 20- Coagulasa 0,1 ml de cultivo (BHI) + 0,3 ml plasma de conejo 20- Coagulasa positivo

8 INVESTIGACIÓN DE Salmonella (NF EN ISO 6579, 2002) 25 g muestra 225 ml agua peptona tamponada PRE-ENRIQUECIMIENTO ENRIQUECIMIENTO RVS (10 ml) 41,5 ±1 C 24 ± 3 h 0,1 ml 18 ± 2 h 1 ml 24 ± 3 h MKTTn (10 ml) ENRIQUECIMIENTO R.V. BGA M.K. Colonias no típicas 18 ± 2 h R.V. Colonias típicas BGA: rosas y medio rosa XLD: rojas con centro negro XLD M.K. AISLAMIENTO AUSENCIA Confirmación Serología - Pase de 5 colonias típicas a Agar Nutritivo 18 - Reacciones bioquímicas - Confirmación serológica Galería de confirmación API Glu+, SH 2 +, ure-, indol-, lys+, β-gal-, Antígeno O,H+ PRESENCIA

9 INVESTIGACIÓN DE Listeria monocytogenes (NF EN ISO , 1997) (30 seg Stomacher) 25 g muestra 225 ml caldo Fraser-demi PRE-ENRIQUECIMIENTO ENRIQUECIMIENTO Agar Palcam Agar Oxford ±1 C 24 ± 2 h 0,1 ml Caldo Fraser (10 ml) ENRIQUECIMIENTO Agar Palcam 18 ± 2 h h Agar Oxford AISLAMIENTO Colonias típicas Verde grisáceas, a veces con centro negro y rodeadas de halo negro, deprimidas en el centro (48h) Colonias típicas Pequeñas, grisáceas, rodeadas de halo negro. A las 48 h tienen reflejos verdosos y son deprimidas en el centro Confirmación 5 colonias típicas Siembra en TSAY Iluminación de Henry+ Catalasa + Bacilos Gram positivos Listeria spp 18 - Hemólisis+ Test de CAMP + Ramnosa+ Xilosa- Listeria monocytogenes

10 RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS Y ESPORULADAS 10 g muestra 90 ml caldo peptona Filtrar y preparar una dilución seriada desde la dilución ml 10 MIN, 80 c (destrucción de formas vegetativas) 1 ml Preparar una dilución seriada dilución 10-1 : sólo han resistido las esporas dilución 10-2 Añadir PCA ml, C Agitar homogeneizando 1 ml 1 ml PCA ml, C Agitar homogeneizando Schaedler ml, C Agitar homogeneizando Añadir doble capa Recuento placas Colonias Tinción Gram/esporas RECUENTO FORMAS VEGETATIVAS Recuento placas Colonias Tinción Gram/esporas RECUENTO ESPOROS AEROBIOS, JARRA ANAEROBIOSIS Recuento placas Colonias Tinción Gram/esporas RECUENTO ESPOROS ANAEROBIOS

11 PREPARACIÓN DE YOGUR 5 ml leche pasteurizada Inocular con el cultivo iniciador (a partir de yogur comercial) Yogur FERMENTACIÓN LÁCTICA Leche líquida

12 PREPARACIÓN DE CERVEZA Suspensión de harina de malta al 5% en agua Llenar hasta el borde. Cerrar con tapón de rosca 75 C 1h Activación amilasas. Hidrólisis del almidón a glucosa y maltosa 121 C 10 min Enfriar tubos Tª ambiente Inocular con Saccharomyces cerevisiae Tª ambiente 3-7 días Cerveza FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

13 ANÁLISIS DEL AIRE Determinación aerobios mesófilos ambientales Destapar placa PCA durante 30 min. ANÁLISIS DE MANIPULADORES placa VRBG Tomar muestra de la nariz con hisopo estéril Pasar dedos sin lavarse las manos Pasar dedos después de lavarse las manos con un desinfectante placa AMS Colonias de Enterobacteriaceae: violetas con halo Colonias de S. aureus: amarillas

14 ANÁLISIS DE SUPERFICIES HISOPO Solución salina Humedecer hisopo estéril en la solución salina Restregar Plantilla papel de aluminio con abertura de 9 cm 2 Introducir de nuevo el hisopo en la solución salina min Placa PCA Placa VRBG ufc/9 cm2 PLACAS RODAC ufc/25 cm2 Presionar placa Rodac sobre superficie elegida