Microbiología de Alimentos

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1 Microbiología de Alimentos Dpto. Química Orgánica GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

2 CURSO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS Tema Página Enterococos 3 Estafilococos 4 Enterobacterias 5 Bacterias esporuladas 11 Bacillus 11 Clostridium 12 Clasificación e identificación de hongos y levaduras 14 Análisis de micotoxinas en alimentos 16 Análisis de leche fluida 19 Análisis de leche en polvo 24 Análisis de mantecas y margarinas 31 Análisis de helados 38 Análisis de conservas 43 Recuento de filamentos de hongos en conservas. Cámara de Howard 48 Análisis de azúcar 50 Análisis de carnes y productos cárnicos 53 Análisis de alimentos deshidratados 68 Análisis de agua 72 Tablas de NMP 76 Bibliografía 79 Anexo - Bioseguridad 80 2

3 ENTEROCOCOS -Objetivos: -Introducción de los medios de cultivo y pruebas bioquímicas características de Enterococcus faecalis. Pruebas bioquímicas diferenciales de otras bacterias relacionadas. - Análisis de las cepas 1) Realizar la tinción de Gram. 2) Prueba de la Catalasa: Se emulsiona un ansa de cultivo en una gota de H 2 O 2 10% sobre portaobjetos. La efervescencia causada por la liberación de O 2 indica la presencia de catalasa. 3) Sembrar en caldo infusión cerebro corazón o caldo glucosa e incubar a 10, 37, y 45ºC durante 48 h. 4) Sembrar en caldo infusión cerebro corazón o caldo glucosa a ph 9,6 e incubar a 37 C durante 48 h. 5) Sembrar en caldo infusión cerebro corazón o caldo glucosa al 6.5 % de NaCl e incubar a 37 C durante 48 h. 6) Sembrar en KF Streptococcus agar. Para observar la selectividad del medio estriar sobre una mitad de la placa una cepa conocida no Enterococcus y en la otra mitad la cepa de Enterococcus a investigar. Incubar a 37 C, 48 h. Las colonias típicas son pequeñas de color rojo y el medio alrededor de las mismas vira al amarillo. 7) Sembrar en agar bilis-esculina. Incubar a 37ºC, 48 h. Las colonias típicas son pequeñas y oscuras y el medio alrededor queda oscurecido. 3

4 ESTAFILOCOCOS -Objetivos: -Introducción de los medios de cultivo y pruebas bioquímicas características de Staphylococcus aureus. Pruebas bioquímicas diferenciales de otras bacterias relacionadas. - Análisis de las cepas 1) Realizar la tinción de Gram. 2) Prueba de la Catalasa: Se emulsiona un ansa de cultivo en una gota de H 2 O 2 10% sobre portaobjetos. La efervescencia causada por la liberación de O 2 indica la presencia de catalasa. 3) Sembrar por estría en agar manita (Medio110 para estafilococos) dos cepas de Staphylococcus sp. con distintas propiedades bioquímicas. Incubar a 37ºC, 48 h. Revelar con solución saturada de sulfato de amonio o con HCl diluido para evidenciar la gelatinólisis. Revelar con púrpura de bromocresol para la fermentación del manitol. 4) Sembrar en el medio Baird-Parker por estría dos cepas de Staphylococcus sp. Incubar a 37ºC, 48 h. Las colonias típicas de S. aureus son circulares, suaves, convexas, de 2 a 3 mm de diámetro en placas poco crecidas, de grises a negras, rodeadas de un halo opaco y, frecuentemente de un halo claro más externo. Ocasionalmente se encuentran cepas no lipolíticas que no presentan halos. La apariencia puede ser seca y el color menos intenso si proviene de un alimento congelado o desecado. 5) Prueba de la Coagulasa: Colocar 0,5 ml de plasma, de conejo o humano, citratado, diluido en solución fisiológica, en un tubo de ensayo pequeño. Agregar un ansa de cultivo e incubar a 37 C. La aparición de grumos o coágulos en el término de 1 a 4 horas indica que la cepa es coagulasa (+). Paralelamente hacer un blanco sin sembrar y un testigo con cepa de estafilococo coagulasa (+). 6) Prueba de la Termonucleasa: Las placas de Baird-Parker en las que se observan colonias típicas se colocan en estufa de 60 C durante 2 hs para inactivar las nucleasas termosensibles. Luego de la inactivación verter en cada placa 10 ml de TDA (agar con ADN y azul de toluidina) fundido. Incubar a 37 C durante 2 a 4 horas. La hidrólisis del DNA se evidencia por la aparición de halos claros alrededor de las colonias. 7) Fermentación de manitol en anaerobiosis Sembrar en caldo para fermentación con manitol. Cubrir con vaselina. Incubar a 37ºC, 48 h. 4

5 ENTEROBACTERIAS - Objetivos -Reconocimiento de los grupos de microorganismos marcadores y patógenos más importantes dentro de los miembros de esta familia. -Introducción de los medios de cultivo y pruebas bioquímicas características de estos microorganismos. -Aplicación de técnicas serológicas para la identificación de Salmonella. - Análisis de las cepas MARCADORES 1) Familia Enterobacteriaceae Se trabajará con una cepa de enterobacteria y otra no enterobacteria. a) Siembra en agar de aislamiento por la técnica de vertido en placa. Observación de colonias típicas. - Con cada una de las cepas 1), a partir de una suspensión bacteriana sembrar 1 ml en una placa de Petri y volcar agar Bilis Rojo Violeta Glucosa (ABRV-G), fundido y mantenido a 44-46ºC. Homogeneizar rotando la placa. Confeccionar una sobrecapa de aproximadamente 10 ml del mismo medio fundido, mantenido a C. Dejar solidificar. Incubar las placas en posición invertida a C durante 21+3 h. Observar las colonias. Se consideran presuntas unidades formadoras de colonias de enterobacterias las colonias de color púrpura con halo de precipitación. b) Confirmación de colonias típicas. Características morfológicas y pruebas bioquímicas. - Transferir una colonia típica de cada una de las placas a tubos de caldo glucosa y agar nutritivo. Incubar a C durante 21+3 h. - A partir del cultivo, realizar tinción de Gram. Observar al microscopio. - A partir del agar inclinado realizar la prueba de la oxidasa. - Observar la fermentación de glucosa por viraje del indicador ácido base. Las colonias presuntivas que resulten bacilo-cocos Gram negativos no esporulados, oxidasa negativas y fermentadoras de glucosa confirman la presencia de Enterobacteriaceae. 2) Coliformes totales Se trabajará con una cepa de coliformes y otra no coliforme. a) Siembra en medio líquido (caldo de fermentación). Observación de reacción característica. Confirmación en medio sólido EMB, colonias típicas de coliformes totales. - Con cada cepa 2) sembrar 1 tubo de fermentación de caldo Lactosa-Verde Brillante-2% sales biliares, con campanitas Durham. Incubar C durante 48 h. Se considera reacción positiva la producción de gas en la campanita de Durham. 5

6 - Confirmación. A partir de los tubos positivos, estriar una placa de agar EMB (Eosina Azul de Metileno) según Levine. Incubar 24 h a C. Colonias metálicas, rosadas/rojas o de apariencia mucosa confirman la presencia de coliformes totales. b) Siembra en medio sólido ABRV-L (agar Bilis-Rojo-Violeta-Lactosa). Observación de colonias típicas. Confirmación en medio líquido (caldo de fermentación), reacción positiva característica de coliformes totales. - Con cada una de las cepas 2), a partir de una suspensión bacteriana, sembrar por vertido en placa 1 ml en una placa de Petri y volcar agar ABRV-L fundido y mantenido a C. Dejar solidificar y cubrir con sobrecapa de aproximadamente 10 ml del mismo medio fundido y mantenido a C. Dejar solidificar. Incubar las placas invertidas 24 h a C. Colonias de color rojo oscuro con halo de precipitación de sales biliares no menor de 0,5 mm se consideran presuntas unidades formadoras de colonias de coliformes. - Confirmación. Sembrar colonias típicas del ABRV-L en tubos de fermentación de caldo Lactosa-Verde Brillante-2% sales biliares, con campanitas de Durham. Incubar uno a C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes totales. 3) Coliformes a 45 C (coliformes fecales) A partir de los tubos positivos 2) a), inocular un tubo de fermentación de caldo EC. Incubar 24 h a 45 C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45 C. 4) Escherichia coli Se trabajará con una cepa pura de Escherichia coli y de otra bacteria coliforme. a) Agar de aislamiento: EMB (agar eosina azul de metileno según Levine). Sembrar ambas cepas por estría una placa de EMB según Levine. Incubar 24 h a 37 C. Colonias con centro negro con o sin brillo metálico verde son características de Escherichia coli. b) Características morfológicas y pruebas bioquímicas A partir de cada cepa b.1) Realizar tinción de Gram. b.2) Prueba de oxidasa. b.3) Inocular un tubo de caldo triptona. Incubar 24 h a 37 C. b.4) Inocular un tubo de caldo Clark y Lubs (RMVP). Incubar 24 h a 37 C. b.5) Inocular por estría un tubo de agar Citrato Simons. Incubar 24 h a 37 C. Investigación de Indol -Técnica de Kovacs: Agregar al cultivo de b.3) 0,2-0,3 ml de reactivo y agitar. Esperar unos minutos. Coloración roja en al parte superior del tubo indica formación de Indol (+). Investigación de acidez - Prueba del Rojo de Metilo: Partir el cultivo de b.4) en dos alícuotas, en una de ellas agregar 5 gotas de reactivo, observar inmediatamente. Color rojo indica acidez (+). 6

7 Características del indicador Rojo de Metilo: ph < 4,4 rojo 4,4 < ph < 6 rango de viraje del indicador ph > 6 amarillo Investigación de acetil metil carbinol - Técnica de Voges-Proskauer modificada por Barrit. Sobre la otra alícuota del cultivo de b.5) agregar respetando el orden: - 0,6ml de α- naftol al 5% y - 0,2ml de KOH al 40% Agitar el tubo suavemente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y oxidar la acetoína (acetil metil carbinol) y permitir el desarrollo de color. Dejar descansar por lo menos minutos. El máximo desarrollo de color se observa luego de una hora. Color rosado en la superficie: producción de acetoína (+), VP (+). Color amarillo o cobrizo: no producción de acetoína, VP (-). Investigación de utilización de citrato (b.5): Los microorganismos que son capaces de utilizar el citrato producen cambio de color en el medio (de verde a azul). Se considera citrato (+) el desarrollo de color azul. Resultados típicos de Escherichia coli: b.1) Bacilo coco Gram negativo sin esporas b.2) Oxidasa (-) b.3) Indol (+) (algunas cepas (-)) b.4) Rojo de Metilo (+) b.4 ) Voges Proskauer (-) b.5) Citrato (-) PATÓGENOS Salmonella spp. Se trabajará con una cepa pura de Salmonella spp. y de otra enterobacteria. a) Medios sólidos (agar) de aislamiento. Observación de colonias típicas. A partir de cada cepa a) Sembrar por estría en agar Verde Brillante. b) Sembrar por estría en agar Bismuto-Sulfito. c) Sembrar por estría en agar Desoxicolato-Citrato (Leifson) d) Sembrar por estría en agar Salmonella-Shigella. Incubar las placas invertidas a 37 C durante 24 h. Observar las colonias resultantes. 7

8 Colonias típicas de Salmonella spp. - Agar VB: colonias pequeñas, traslúcidas e incoloras u opacas de un color intermedio entre rosa y fucsia. El medio vira al rojo brillante. - Agar Bismuto-Sulfito: colonias con centro negro, borde claro, precipitado negro con brillo metálico alrededor ( ojo de conejo u ojo de pez ). - Agar Leifson: colonias rosa pálido hasta incoloras, de 1mm de diámetro. - Agar Salmonella-Shigella: colonias pequeñas, entre incoloras y rosa pálido, opacas y traslúcidas. Algunas cepas dan colonias con centro negro (SFe). El medio vira al amarillo. b) Características morfológicas, pruebas bioquímicas, confirmación serológica. A partir de cada cepa b.1) Realizar tinción de Gram. b.2) Prueba de oxidasa. b.3) TSI. Sembrar por punción y en superficie. Incubar a 37ºC, 24 h. b.4) LIA. Sembrar por punción y en superficie. Incubar a 37ºC, 24 h. b.5) BAM. Sembrar por punción con ansa recta. Incubar a 37ºC, 24 h. Alternativamente se puede utilizar caldo urea. b.6) Prueba de la β-galactosidasa: a partir de un cultivo en agar inclinado, tomar un ansa bien cargada y emulsionarla en 0,2 ml de solución salina fisiológica hasta conseguir una suspensión densa. Colocar un disco de ONPG. Incubar a 37ºC por 20 minutos. Observar hasta las 4 horas de incubación para dar un informe negativo. El color amarillo indica que la reacción es positiva. b.7) Inocular un tubo de caldo triptona. Incubar 24 h a 37 C. b.8) Inocular un tubo de caldo Clark y Lubs (RMVP). Incubar 24 h a 37 C. Resultados típicos de Salmonella sp. b.1) Bacilo coco Gram negativo sin esporas b.2) Oxidasa (-) b.3) TSI: profundidad: amarillo o negro, con o sin ruptura del agar por formación de gas/ superficie inclinada: rojo o sin variación. Salmonella es lactosa (-), la mayoría de las cepas y sacarosa (-), la mayoría de las cepas. b.4) LIA: profundidad: violeta o negro (negro en la mayoría de los casos)/superficie inclinada: violeta Salmonella es lisina decarboxilasa (+) Excepción: Salmonella paratyphi A: profundidad: amarillo superficie inclinada: violeta b.5) BAM: - medio sin cambio de color. Salmonella es siempre ureasa (-), lac (-), la mayoría de las cepas - móvil en la mayoría de los casos - indol (-) - H 2 S (+) en la mayoría de los casos - sin formación de gas b.6) β-galactosidasa: (-), sin cambio de color. b.7) Indol (-) b.8) Voges Proskauer (-) 8

9 Identificación serológica de Salmonella sp. Toda cepa sospechosa de Salmonella debe identificarse bioquímicamente antes de efectuar el análisis serológico. De lo contrario aglutinaciones positivas podrán ser originadas por otros gérmenes que poseen estrecha relación antigénica (Arizona, Citrobacter). Las cepas sujetas a examen serológico deberán hallarse en su forma lisa (S), ya que en forma rugosa (R), pueden perder sus caracteres específicos dando aglutinaciones falsas. Sueros polivalentes somáticos de Salmonella Los sueros polivalentes somáticos son 6: OS-A, OS-B, OS-C, OS-D, OS-E, OS-F. Composición: Los sueros OS-A y OS-B tienen las siguientes aglutininas correspondientes a los grupos antigénicos Kauffman-White que se detallan: OS-A: OS-B: Grupo Aglutinina Grupo Aglutinina A 1,2 y 12 B 1, 4, 5 y 12 C 1 6 y 7 D 1 1, 9 y 12 C 2 6 y 8 D 2 9 y 46 F 11 E 1 3 y 10 G 1 1, 13 y 22 E 4 1, 3 y 19 G 2 13 y 23 L 21 H 6, 14 y 24 C 3 8 y 20 Cabe señalar que los sueros OS-A y OS-B permiten identificar alrededor del 98% de los serotipos más frecuentes de Salmonella. Cuando una cepa de Salmonella (identificada previamente por sus características bioquímicas), no dé aglutinación con ninguno de los sueros polivalentes somáticos, es necesario tener en cuenta que la cepa puede: a) presentar antígenos de envoltura V (Salmonella typhi), que inhibe la aglutinación O. b) ser un secretorio no incluido en la lista (caso muy excepcional). Técnica: Aglutinación somática: -Preparación del antígeno: utilizar un cultivo de estrías de 24 h de incubación a 37 C. Suspender el crecimiento de la estría con 1ml de solución fisiológica. -Reacción: sobre lámina de vidrio depositar una gota de c/u de los 2 sueros polivalentes somáticos y los monovalentes. Colocar al lado de cada suero, una gota de suspensión antigénica. Mezclar con un ansa previamente flameada y enfriada. -Lectura: debe ser inmediata y no después de 5 minutos. Las reacciones tardías o dudosas no deben considerarse. Aglutinación flagelar: -Preparación del antígeno: a partir de una colonia de Salmonella, hacer un cultivo de 24 h en caldo. Luego agregar igual volumen de solución formolada al 5%. -Reacción: en distintos tubos de ensayos colocar una gota de cada uno de los sueros polivalentes y monovalentes ciliares. Agregar en cada uno 0,5 ml de la suspensión antigénica. Incubar en baño maría a 50 C. 9

10 -Lectura: se efectuará al cabo de una hora de incubación. Debe considerarse únicamente la aglutinación de tipo ciliar (flóculos esponjosos, fácilmente disociables) Si una cepa de Salmonella (previamente confirmada por su aglutinación somática), no reacciona con ninguno de los sueros ciliares polivalentes hay que tener en cuenta que puede: a) Tratarse de una variante inmóvil b) Presentar otro tipo de antígeno ciliar no incluido en la lista. 10

11 BACTERIAS ESPORULADAS Género Bacillus - Objetivo Observar la morfología típica de colonias de Bacillus cereus en medios usados para su aislamiento y recuento en alimentos; diferenciarlo de otras especies de Bacillus, y realizar las pruebas bioquímicas útiles para su identificación. - Análisis de las cepas 1) Coloración de Gram: realizar la coloración según la técnica descripta en la guía de medios de cultivo. Observar forma y tinción de las células vegetativas, forma y disposición de las esporas. 2) Utilización de azúcares: sembrar una ansada del cultivo en cada uno de los tubos de caldo con azúcares (glucosa-xilosa-arabinosa-manitol). Incubar h a 37 C. Observar la producción de ácido y/o gas. 3) Reducción de nitratos: sembrar una ansada del cultivo en caldo nitrato. Incubar 24 h a 37 C. Agregar los reactivos y observar. 4) Producción de acetoina: (VP) sembrar una ansada del cultivo en el medio VP modificado. Incubar 48 h a 37 C. Agregar los reactivos A y B y agitar. Agregar unos cristales de creatina. Leer el resultado luego de 1 h a temperatura ambiente. 5) Movilidad: inocular por punción el medio de movilidad. Incubar 24 h a 37 C. Observar crecimiento. 6) Catalasa: sembrar por estría un tubo con agar nutritivo inclinado. Incubar 24 h a 37ºC Colocar una ansada del cultivo sobre un portaobjeto y agregar unas gotas de H 2 O 2 al 30%. Observar. 7) Hidrólisis de gelatina: inocular el medio por punción. Incubar 24 h a 37 C. Enfriar en heladera y observar el resultado. 8) Hidrólisis de almidón: sembrar una sola estría en agar almidón. Incubar 24 h a 37ºC. Agregar solución de lugol y observar. 9) Hidrólisis de caseína: sembrar una estría o cuatro puntos en agar leche descremada o agar caseína. Incubar 24 h a 37 C. 10) Lecitinasa: sembrar cuatro puntos en una placa de agar MYP (agar manitol-yema de huevo-polimixina). Incubar 24 h a 37ºC.Observar morfología de las colonias. 11

12 Género Clostridium - Objetivo Observar la morfología típica de colonias de C. perfringens en medios usados para su aislamiento y recuento en alimentos; diferenciarlo de otras especies del mismo género; familiarizarse con los distintos métodos de anaerobiosis. - Análisis de las cepas 1) Coloración de Gram: realizar la técnica descripta en la guía de reactivos y medios de cultivo. Observar forma y tinción de las células vegetativas, forma y disposición de las esporas. 2) Coloración de esporas: realizar la coloración de verde de malaquita. Observar las esporas. 3) Utilización de azúcares: sembrar 0,2 ml del cultivo en cada uno de los tubos de caldo con azúcares (glucosa- maltosa-salicina-rafinosa-etc.), sin burbujear. Incubar 48 h a 37 C. Agregar unas gotas de indicador. Observar acidez y/o gas. 4) Reducción de nitrato/movilidad: sembrar una ansada por punción en un tubo de agar semisólido de nitrato. Incubar 24 h a 37 C. Agregar unas gotas de los reactivos. Observar los resultados. 5) Hidrólisis de la gelatina: sembrar 0,2 ml del cultivo en el fondo de un tubo con agar gelatina-lactosa, sin burbujear. Incubar 24 h a 37 C. Enfriar en heladera y observar el resultado. 6) Hidrólisis de almidón: sembrar por estría en agar almidón. Incubar en anaerobiosis 24 h a 37 C. Agregar solución de lugol y observar los resultados. 7) Leche: sembrar 0,2-0,5 ml del cultivo en un tubo con leche. Incubar 24 h a 37 C. Observar coagulación y degradación del coágulo, por digestión de caseína. Observar formación de gas. 8) Hidrólisis de caseína: sembrar por estría en agar caseína. Incubar en anaerobiosis 24 h a 37 C. Observar resultados. 9) Esporulación: sembrar 0,2 ml del cultivo en caldo Duncan-Strong al fondo y sin burbujear. Incubar 24 h a 37 C. Realizar tinción de esporas. 10) Prueba de reducción de sulfito: inocular 0,2 ml del cultivo en agar hierro-sulfito (SPS/TSN/TSC) fundido y mantenido a 45 C. Dejar solidificar e incubar 24 h a 37 C. Observar la formación de colonias negras en el agar. 11) Lecitinasa: sembrar por estría en agar yema de huevo o similar. Incubar 24 h a 37 C. Observar precipitado alrededor de las colonias. 12) Caldo de hígado con hígado: inocular 0,2 ml del cultivo en el caldo hígado + hígado. Sellar con vaselina-parafina. Incubar 24 h a 37 C. Observar ennegrecimiento y digestión de la carne (proteólisis) o enrojecimiento (sacarólisis) y/o producción de gas. 12

13 Observaciones: los tubos con medios líquidos se cubren con vaselina o con vas-par (vaselinaparafina) 13

14 CLASIFICACION E IDENTIFICACION DE MOHOS Y LEVADURAS I. MOHOS El estudio de los hongos se basa en las siguientes características: a) Si las hifas son tabicadas o no. b) Si el micelio es claro u oscuro. c) Si se producen o no esporas sexuales. d) Tipos de esporas asexuales (esporangiosporas, conidios, artrosporas, blastosporas). e) Aspecto de los esporangióforos y conidióforos: tipos de ramificación. f) Presencia de estructuras y de esporas especiales, estolones, rizoides, clamidosporas, etc. Plan de trabajo: Se proveerá de distintos hongos que han crecido en un medio apropiado en tubo de ensayo y con cada uno de ellos se harán microcultivos en la siguiente forma: a) Se recortan cuadrados pequeños de agar Czapek con una espátula estéril. b) Se colocan sobre un portaobjetos. c) Se hacen toques en el centro de cada lado con un ansa contaminada con el hongo en estudio. d) Se coloca encima un cubreobjetos de mayor tamaño que el trozo de agar. e) Se coloca el conjunto en una caja de Petri estéril que contiene algodón húmedo. f) Se incuba a temperatura ambiente y se hacen observaciones periódicas a partir de las 48 h para estudiar las distintas fases de crecimiento. II. LEVADURAS Para identificar las levaduras deben conocerse sus características morfológicas y bioquímicas. Entre los datos morfológicos figuran aspecto del cultivo en agar extracto de malta, o en el medio de Sabouraud, tamaño y forma de las células vegetativas, formación del micelio y pseudomicelio, producción de ascosporas, tamaño y número de las mismas. Como datos bioquímicos interesa: - habilidad para fermentar azúcares. - utilización de fuentes de C y N para su crecimiento (método auxonográfico). Observaciones microscópicas Las células provenientes de medios líquidos pueden observarse directamente entre porta y cubreobjetos. Las levaduras provenientes de medios sólidos pueden observarse mejor si se las mezcla sobre el portaobjetos con una gota de nigrosina al 5% en solución acuosa. La observación al microscopio se hace por inmersión. Coloración de esporas Se usa el mismo método que para las bacterias. 14

15 Aislamiento de mohos y levaduras En el caso de los mohos o las levaduras que se encuentran en un producto mezclados con las bacterias, para separarlos de éstas deben usarse medios de cultivo que favorezcan el desarrollo de los primeros. En general se obtienen buenos resultados empleando: - medios a base de infusión de vegetales, con el agregado de azúcares, por ej. agar-papaglucosa-ácido tartárico. El ácido tartárico se emplea para llevar el ph a 3,5 pues así se inhibe el crecimiento de casi todas las bacterias. - agar papa-dextrosa con agregado de 40 µg/g de cloranfenicol. Los medios deben incubarse a temperatura comprendida entre 20 y 25 C. 15

16 ANALISIS DE AFLATOXINAS EN ALIMENTOS Existen dos tipos básicos de métodos para el análisis de aflatoxinas en alimentos: a) métodos biológicos: realizados sobre animales de prueba sensibles al efecto tóxico (en este caso generalmente se utilizan patos de un día pero también pueden emplearse embriones de pollo, larvas de peces, etc.). Son de utilidad para los estudios confirmatorios, particularmente cuando surgen dificultades analíticas en el caso de ciertos alimentos. Pero estos métodos insumen demasiado tiempo para el análisis de rutina como el que se precisa en un programa de control de calidad y para este fin se requieren métodos químicos. b) métodos químicos: el procedimiento para la determinación de aflatoxinas en un dado producto consta en rasgos generales de las siguientes etapas: 1) muestreo y preparación de muestra para el análisis. 2) desgrasado (es necesario cuando el material contiene más del 5% de aceite). 3) extracción de la toxina utilizando un solvente adecuado. 4) purificación del extracto para eliminar material fluorescente interferente. 5) determinación de la concentración, generalmente por cromatografía en placa delgada, en la cual se observa la fluorescencia característica de estas sustancias con luz ultravioleta. Según el producto que se deba analizar, algunas de estas etapas pueden omitirse. En algunos productos, especialmente en el caso de granos y semillas, la etapa de muestreo presenta dificultades. Esto se debe a la falta de homogeneidad de los lotes respecto a la contaminación con aflatoxinas, ya que estas se encuentran, por lo general, en una proporción muy pequeña en los granos y es difícil obtener una muestra representativa en condiciones prácticas. La selección del método a utilizar depende fundamentalmente del producto y del número de muestras a analizar. Por ejemplo, en algunos casos la etapa de desgrasado puede omitirse y la eliminación del aceite se realiza junto con la extracción, como veremos para el caso del maní. En los casos en que hay interferencia fluorescente es necesario incluir una etapa de purificación en columna cromatográfica. AFLATOXINAS. REGLAMENTO TÉCNICO SOBRE LÍMITES MÁXIMOS DE MERCOSUR. GMC RES N o 056/94 (RES MS y AS N o 110 del ) ALIMENTO AFLATOXINA LIMITE Leche Leche fluida M 1 0,5 µg/l Leche en polvo M 1 5,0 µg/kg Maíz Maíz en grano (entero, partido, aplastado, mondado) B 1 + B 2 + G 1 + G 2 20 µg/kg Harinas o sémolas de maíz B 1 + B 2 + G 1 + G 2 20 µg/kg Maní Maní (sin descascarar, descascarado, crudo o tostado) B 1 + B 2 + G 1 + G 2 20 µg/kg Maní en ( pasta de maní o manteca de maní B 1 + B 2 + G 1 + G 2 20 µg/kg 16

17 METODO PARA ANALIZAR AFLATOXINAS EN MUESTRAS DE MANI (AOAC ) 1) Extracción 1 - Tomar 100 g de muestra molida y colocar en una licuadora junto con 4 g de NaCl, 500 ml de metanol-agua (55+45) y 200 ml de hexano. 2 - Licuar 1 minuto a alta velocidad. 3 - Filtrar por papel de filtro. 4 - Tomar 25 ml de la solución metanol-agua (capa inferior) y colocarla en una ampolla de decantación con 25 ml de cloroformo. 5 - Tapar la ampolla de decantación y agitar 1 minuto. 6 - Recoger la capa clorofórmica (inferior) y llevar a sequedad en baño maría bajo corriente de nitrógeno o en un evaporador rotatorio. 7- Determinar la presencia de aflatoxinas por cromatografía en capa delgada. 2) Determinación de aflatoxinas por cromatografía en capa fina Utilizar placas de sílica gel G o GF 254 según Sthal, de 250 micrones de espesor, activadas a 80 C durante dos horas. Los sistemas de solventes que se utilizan son: acetona-cloroformo (1+9) y benceno-acetona-ácido acético ( ) a temperatura ambiente. Se utilizan cubas sin saturar y sin papel. 1 - Tomar el extracto seco con 250 microlitros de cloroformo. 2 - Sembrar en la placa 10 microlitros de la muestra a analizar, 10 microlitros de la muestra con 10 microlitros de estándar interno y 10 microlitros de estándar. 3 - Correr la muestra durante 45 min (hasta que el solvente esté a 5 mm del borde superior de la placa). 4 - Secar la placa boca arriba y en posición horizontal preferentemente en la oscuridad. 5 - Observar a la luz ultravioleta. La ausencia de fluorescencia en los 10 microlitros de muestra sembrada indica menos de 25 microgramos/kg de aflatoxina. 3) Cuantificación por el método de comparación visual 1- Sembrar 2, 5 y 10 microlitros de aflatoxina B 1 (estándar) y desarrollar el cromatograma. 2- Comparar la intensidad de fluorescencia de las manchas del extracto con la intensidad de fluorescencia de las manchas del estándar. 3- Aplicar la siguiente ecuación: Vs. Cs. Md Concentración de aflatoxina (microgramos/kg) = Vx. P Vs: volumen de estándar (microlitros) cuya intensidad de fluorescencia es igual a la que presenta un determinado volumen de muestra. Cs: concentración del estándar de aflatoxina B 1 en microgramos/ml. 17

18 Md: volumen (microlitros) de la dilución final del extracto de muestra (para este caso 250 microlitros). Vx: volumen de muestra (microlitros) cuya intensidad de fluorescencia es igual a la de Vs. P: masa (g) de la muestra original en el extracto final (en este caso 5 g). 18

19 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LECHE FLUIDA 1) Toma de muestra Cuando el muestreo de leche fluida se realiza a partir de los tanques o tarros de las granjas utilizados para el transporte a granel, los tanques de almacenamiento de las centrales lecheras o los tanques móviles de almacenamiento hay que asegurarse de que se haya mezclado el contenido hasta hacerlo homogéneo. Se vierte entonces una cantidad adecuada de leche en condiciones asépticas en los recipientes de muestreo, utilizando para ello un cucharón o tubo de muestreo esterilizado para cada muestra (ICMSF recomienda tomar por lo menos 30 ml de muestra). Estas muestras se enfrían inmediatamente manteniéndolas a una temperatura de 0-4ºC, y se envían al laboratorio. Cuando se trata de un producto final envasado (como la leche pasteurizada), es preferible llevar la muestra al laboratorio sin abrir. Se enfrían y se llevan al laboratorio lo más rápidamente posible para que puedan comenzar los ensayos antes de que transcurran 36 h. Previamente al análisis se mezcla la muestra cuidadosamente agitando o invirtiendo el recipiente con el fin de lograr una distribución uniforme de los microorganismos en la muestra. 2) Preparación de la muestra Colocar 1 ml de leche en un tubo de dilución que contiene 9 ml de agua peptona al 0,1%. Mezclar bien y realizar las diluciones siguientes tomando siempre 1 ml y transfiriendo este volumen a 9 ml del medio de dilución. Se hacen tantas diluciones como sean necesarias. 3) Metodología de análisis a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche) b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas c) Recuento de bacterias psicrotróficas d) Recuento de coliformes totales e) Determinación de coliformes totales f) Recuento de coliformes a 45 C g) Determinación de Escherichia coli a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche) Método de Breed-Newman (APHA, 1976) El método consiste en contar los microorganismos vivos y muertos de la muestra. La validez de este método se limita a las muestras con recuentos elevados, mientras que aporta escasa información respecto a las muestras que contienen un número reducido de microorganismos Preparación de la película 1- Mezclar bien la muestra por agitación. 2- Transferir 0,01 ml al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro marcado tiene 1 cm de lado. 3- Distribuir el material sobre el recuadro mediante un ansa cuyo extremo forme un pequeño ángulo recto. 4- Secar el extendido al aire o bien colocándolo sobre una chapa caliente, cuidando que no sobrepase los 45ºC. 5- Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados sumergiéndolos en xileno durante 5 minutos. 6- Luego de secar al aire se lo fija sumergiéndolo en alcohol absoluto durante 2-3 minutos. 19

20 7- Sin secarlo se lo tiñe con la solución colorante sumergiéndolo durante 30 segundos. El exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel absorbente. 8- Secar cuidadosamente al aire y, una vez seco, sumergir en una cubeta con agua lo necesario como para que ésta no tome color. Secar al aire. Solución colorante Solución madre al 2% de Azul de Metileno en alcohol absoluto 96º. Se toman 30 ml de la solución madre y se diluyen con agua destilada hasta 1 litro. Examen microscópico La película se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y después con el objetivo de inmersión. Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml de la porción de muestra de la siguiente manera: cuando las células de un mismo tipo morfológico se presentan en racimos, éstos se cuentan como unidades individuales, sólo si la distancia entre las células es igual o mayor al doble del diámetro menor de las dos células que estén más próximas entre sí; las células de morfología diferente o con tinción diferente se cuentan como unidades también diferentes independientemente de su proximidad a las demás células. Para examinar una parte representativa de la película, se escoge un campo de partida situado a la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del preparado sobre uno de los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde (superior o inferior). Se cuentan los campos de una serie a través de la película en forma horizontal, y después se empieza a contar desde el centro que habíamos tomado como punto de partida una serie de campos separados en un sentido perpendicular a la primera serie. Si fuese necesario examinar un número mayor de campos, se repite la selección de campos según la explicación anterior, partiendo de un punto situado a 2 mm de distancia de la primera serie elegida. Se contarán entre 30 y 60 campos. Si el número de microorganismos es menor de bacterias/ml ó g, se efectuará el recuento de 60 campos. Si es de bacterias/ml ó g a bacterias/ml ó g basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor a bacterias/ml ó g se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200 gérmenes en la suma de todos ellos. Cálculo Se calcula el valor promedio de gérmenes por campo y se multiplica este valor por el factor microscópico (FM) y por (la inversa de la alícuota tomada) el número recíproco de la dilución: RECUENTO Promedio de Recíproca de la MICROSCÓPICO = microorganismos por campo * FM * dilución DIRECTO/ml ó g Donde FM = 100/A. A es el área del campo microscópico (la mayoría de los microscopios para alumnos tienen un diámetro de campo de 0,16 mm). FM = 4970/cm b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas (FIL 100B: 1991) 1- Se vierte 1 ml de cada dilución por duplicado en placas de Petri y se agrega el agar para recuento (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aprox

21 46ºC. Se mezcla para lograr una distribución homogénea. Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones sucesivas. 2- Cuando las placas estén frías se invierten y se incuban a 30ºC ± 1 C durante 72h ± 3h. 3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en el capítulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se multiplica el número promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilución correspondiente y se informa como UFC de bacterias aerobias mesófilas/ml ó g. c) Recuento de bacterias psicrotróficas (APHA, 1992) Este recuento puede realizase bajo diferentes combinaciones de temperatura/tiempo. 1- Se procede de la misma forma que para el recuento de aerobios (b) pero incubando a 7ºC por 10 días (ó, 21 C por 25 horas ó, 18 C por 45 horas). Se informa UFC de bacterias psicrótrofas /ml ó g d) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985) El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio sólido o en medio líquido (por la técnica de NMP: número más probable). d.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa) Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri. Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV fundido a aprox ºC. Mezclar. Dejar solidificar completamente y agregar entonces 4 ml más de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las placas invertidas a 30ºC por h. Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas oscuras con diámetro de por lo menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes. Confirmación: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto). Incubar a 30ºC por h. Se consideran positivas aquellas colonias que den producción de gas. El resultado se calcula en base al número de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de coliformes totales /ml ó g. La confirmación de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que contengan otros azúcares distintos de lactosa. d.2) Técnica del número más probable (NMP) Prueba presuntiva Inocular por triplicado 1ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30ºC por 48 h. Se consideran positivos aquellos tubos que presenten formación de gas en la campanita de Durham. De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. En este caso se utilizarán tubos doble concentración de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. 21

22 Prueba de confirmación Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno). Incubar a 30ºC por h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metálico. Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/ml ó g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas. e) Determinación de coliformes totales (Basado en Mossel, 1985) Inocular 1 ml de muestra en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS). Incubar a 20-25ºC por 5-6 h. Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham). Incubar a 30ºC ±1 C durante h. Los tubos en los que no se verifique formación de gas se consideran negativos. En este caso se informa ausencia de coliformes totales en 1 ml. Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estría en agar EMB. Incubar a 37±1 C por 24 horas. Las colonias típicas de coliformes son oscuras, rojas-rosadas o mucosas. Si se verifica crecimiento de estas características, se informa presencia de coliformes en 1 ml. f) Recuento de coliformes a 45 C (APHA, 1992) A partir de los tubos positivos en d.2 (coliformes totales a 30 C, por NMP), inocular un tubo de fermentación de caldo EC. Incubar 24 h a 45 C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45 C (coliformes fecales). Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45 C/ml ó g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas. g) Determinación de Escherichia coli (Mossel y Moreno García, "Microbiología de los alimentos. Fundamentos ecológicos para garantizar y comprobar la inocuidad y calidad de los alimentos."; Ed. Acribia, 1985). Inocular 1 ml de muestra en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS). Incubar a 20-25ºC por 5-6 h. Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham). Incubar a 30ºC ± 1 C durante h. Los tubos en los que no se verifique formación de gas se consideran negativos. En este caso se informa ausencia de E. coli Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estría en agar Mac Conkey. Incubar a 44ºC±0,1 C (preferentemente en baño de agua) durante 30 h. Si existiese crecimiento típico (colonias rojas), tomar colonias aisladas y realizarles: 1- Gram 2- Siembra en tubo de fermentación caldo verde brillante 2% sales biliares con lactosa. Incubar a 44 C por 48 horas. 3- Siembra en caldo triptona. Incubar a 44 C por 48 horas 4- Siembra en agar citrato. Incubar a 30 C por 48 horas. Resultados característicos: 1- Cocobacilo Gram negativo no formador de esporas. 2- Fermentación de lactosa a 44 C con formación de gas. 22

23 3- Producción de indol a 44 C 4- No utiliza citrato Alternativamente se pueden utilizar las pruebas del IMViC para la identificación. De ser posible ensayar el cultivo sospechoso con un sistema de pruebas múltiples (API, MICRO-ID, o semejantes). En caso de confirmarse, informar presencia de E. coli en 1 ml de muestra. Indicar las pruebas de identificación realizadas. 4) Antibióticos en leche Durante el tratamiento de la mastitis, se usan antibióticos que pueden aparecer eventualmente en la leche de los animales bajo tratamiento. Los antibióticos residuales, pueden producir interferencias en el proceso de fermentación láctica, que se lleva a cabo para la fabricación de quesos y otros productos lácteos. Investigación de antibióticos Un ensayo práctico consiste en calentar 100 ml de leche en un erlenmeyer por 2-5 minutos a 83ºC (para evitar falsos positivos debido a sustancias inhibidoras naturales en la leche cruda que la pasteurización reduce pero no elimina completamente). Enfriar a 45ºC y agregar una cucharadita de yogurt (Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus). Incubar a 45ºC y examinar a las 2-3 h. Si la leche no ha coagulado es probable la presencia de antibióticos. 23

24 ANÁLISIS DE LECHE EN POLVO 1) Toma de muestra Para el muestreo, es preferible tomar como muestra los recipientes o paquetes originales, sin abrir. Cuando haya que muestrear productos a granel, la muestra se tomará en un punto cerca del centro del recipiente que la contiene, si es posible, quitando la capa superficial de polvo con un instrumento esterilizado, y extrayendo después la muestra con una cuchara o varilla esterilizada. ICMSF recomienda para cada producto a granel tomar no menos de 30 g. 2) Preparación de la muestra Con una cuchara estéril mezclar el contenido del frasco de leche en polvo. Pesar asépticamente 10 g de muestra en un erlenmeyer que contenga 90 ml de agua peptona 0,1% previamente calentada a no más de 45ºC. Agitar hasta disolución de grumos. Preparar las siguientes diluciones transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de agua peptona al 0,1%. La mayoría de las leches en polvo pueden ser disueltas en agua peptona al 0,1% o en solución salina de fosfatos tamponada. Las muestras más insolubles (por ejemplo leches de alta acidez) se disuelven bien agregando 1,25 % de citrato de sodio a la solución de fosfatos. 3) Metodología de análisis a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche) b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas c) Recuento de coliformes totales d) Recuento de coliformes a 45 C e) Recuento de Staphylococcus aureus f) Determinación de Salmonella a) Recuento microscópico directo (recuento de bacterias totales en leche) Método de Breed-Newman (APHA, 1976) El método consiste en contar los microorganismos vivos y muertos de la muestra. La validez de este método se limita a las muestras con recuentos elevados, mientras que aporta escasa información respecto a las muestras que contienen un número reducido de microorganismos. Preparación de la película 1- Mezclar bien la muestra por agitación. 2- Transferir 0,01 ml al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro marcado tiene 1 cm de lado. 3- Distribuir el material sobre el recuadro mediante un ansa cuyo extremo forme un pequeño ángulo recto. 4- Secar el extendido al aire o bien colocándolo sobre una chapa caliente, cuidando que no sobrepase los 45ºC. 5- Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados sumergiéndolos en xileno durante 5 minutos. 6- Luego de secar al aire se lo fija sumergiéndolo en alcohol absoluto durante 2-3 minutos. 7- Sin secarlo se lo tiñe con la solución colorante sumergiéndolo durante 30 segundos. El exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel absorbente. 24

25 8- Secar cuidadosamente al aire y, una vez seco, sumergir en una cubeta con agua común lo necesario como para que ésta no tome color. Secar al aire. Solución colorante Solución madre al 2% de Azul de Metileno en alcohol absoluto 96º. Se toman 30 ml de la solución madre y se diluyen con agua destilada hasta 1 litro. Examen microscópico La película se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y después con el objetivo de inmersión. Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml de la porción de muestra de la siguiente manera: cuando las células de un mismo tipo morfológico se presentan en racimos, éstos se cuentan como unidades individuales, sólo si la distancia entre las células es igual o mayor al doble del diámetro menor de las dos células que estén más próximas entre sí; las células de morfología diferente o con tinción diferente se cuentan como unidades también diferentes independientemente de su proximidad a las demás células. Para examinar una parte representativa de la película, se escoge un campo de partida situado a la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del preparado sobre uno de los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde (superior o inferior). Se cuentan los campos de una serie a través de la película en forma horizontal., y después se empieza a contar desde el centro que habíamos tomado como punto de partida una serie de campos separados en un sentido perpendicular a la primera serie. Si fuese necesario examinar un número mayor de campos, se repite la selección de campos según la explicación anterior, partiendo de un punto situado a 2 mm de distancia de la primera serie elegida. Se contarán entre 30 y 60 campos. Si el número de microorganismos es menor de bacterias/ml ó g, se efectuará el recuento de 60 campos. Si es de a gérmenes /ml ó g basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor a gérmenes /ml ó g se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200 gérmenes en la suma de todos ellos. Cálculo Se calcula el valor promedio de gérmenes por campo y se multiplica este valor por el factor microscópico (FM) y por (la inversa de la alícuota tomada) el número recíproco de la dilución RECUENTO Promedio de Recíproca de la MICROSCÓPICO = microorganismos por campo * FM * dilución DIRECTO/ml ó g Donde FM = 100/A. A es el área del campo microscópico (la mayoría de los microscopios para alumnos tienen un diámetro de campo de 0,16 mm). FM = 4970/cm b) Recuento de bacterias aerobias mesófilas (FIL 100B: 1991) 1- Se vierte 1 ml de cada dilución por duplicado en placas de Petri y se agrega el agar para recuento (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aprox ºC. Se mezcla para lograr una distribución homogénea. Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones sucesivas. 2- Cuando las placas estén frías se invierten y se incuban a 30ºC ± 1 C durante 72h ± 3 h. 3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en el capítulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se 25

26 multiplica el número promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilución correspondiente y se informa como UFC de bacterias aerobias mesófilas/g. c) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A:1985) El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio sólido o en medio líquido (por la técnica de NMP: número más probable). c.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa) Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri. Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV fundido a aprox ºC. Mezclar. Dejar solidificar completamente y agregar entonces 4 ml más de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las placas invertidas a 30ºC por h. Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas oscuras con diámetro de por lo menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes. Confirmación: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto). Incubar a 30ºC por h. Se consideran positivas aquellas colonias que den producción de gas. El resultado se calcula en base al número de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de coliformes totales/g. La confirmación de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que contengan otros azúcares distintos de lactosa. c.2) Técnica del número más probable (NMP) Prueba presuntiva Inocular por triplicado 1ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30ºC por 48 h. Se consideran positivos aquellos tubos que presenten formación de gas en la campanita de Durham. De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. Se utilizarán tubos doble concentrado de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Prueba de confirmación Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno). Incubar a 30ºC por h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/ rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metálico. Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas. d) Recuento de coliformes a 45 C (APHA, 1992) A partir de los tubos positivos c.2 (coliformes totales a 30 C, por NMP), inocular un tubo de fermentación de caldo EC. Incubar 24 h a 45 C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45 C (coliformes fecales). Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45 C/g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas. 26

27 e) Recuento de Staphylococcus aureus (FIL 145:1990) Se recomienda realizar el recuento sembrando por duplicado cada dilución. En caso de requerir un inóculo más grande por un valor bajo del requisito microbiológico de aceptación, puede hacerse una siembra combinada de la siguiente forma: Distribuir 1 ml de dilución 1/10 equitativamente en la superficie de tres placas de agar Baird Parker perfectamente secas. Distribuir con una espátula de Drigalsky cuidadosamente (tener la precaución de enfriar bien la espátula para no matar los microorganismos). Dejar secar las placas tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez secas, incubarlas invertidas a 37± 1ºC durante h. Tomar para enumerar placas con no más de 150 colonias. Seleccionar un número representativo de colonias típicas y atípicas; y transferirlas a tubos de caldo infusión cerebrocorazón. Incubar a 37 C ó 35ºC por 20 a 24 h. Las colonias típicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara, generalmente un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara. Identificación y confirmación Sobre los cultivos puros de horas, realizar: - Tinción de Gram - Catalasa - Coagulasa (comparar con cepa patrón): Agregar 0,1 ml del cultivo a aprox. 0,3 ml de plasma de conejo reconstituido en un tubo estéril. Incubar a C. Examinar después de 4 a 6 horas. El coágulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo (4+). Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estéril en lugar del cultivo. Para que el ensayo sea válido, no debe observarse ningún signo de coagulación. Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa de Baird Parker. S. aureus coagulasa positiva son cocos Gram positivos, catalasa positivo, coagulasa positivo (3 o 4+) y termonucleasa positivo. Informar UFC de S. aureus coagulasa positivo/ g de muestra. Para realizar el cálculo contar el número total de colonias confirmadas en las tres placas. f) Determinación de Salmonella (FIL 93 A: 1985) Preenriquecimiento en medio líquido Preparar un erlenmeyer con 225 ml de agua destilada con 1 ml de solución de Verde Brillante (0,5% en agua, agregar verde brillante al agua; dejar la solución en la oscuridad por lo menos un día para autoesterilizar). Pesar asépticamente 25g de muestra en dicho erlenmeyer. Dejar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h sin agitar. Incubar a 37ºC durante h. Si al cabo de 3 h de incubación todavía no se ha disuelto la leche en polvo, agitar el frasco para mezclar su contenido. Enriquecimiento en medio líquido. Transferir 10 ml de preenriquecimiento a 100 ml de caldo tetrationato (Müller Kauffmann). Incubar a 43 ± 0,5ºC durante h. Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 37± 1ºC durante h. 27

28 Aislamiento en medio sólido A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo Fenol (agar BPLS) y una de agar Bismuto Sulfito (son cuatro placas en total). Incubar las placas invertidas a 37 ± 1ºC durante h. De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento h más y volver a estriar en los medios de aislamiento. Si al cabo del período de incubación el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por h adicionales a la misma temperatura. Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella. En agar BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar Bismuto Sulfito, las colonias típicas son marrones a negras con brillo metálico. Algunas cepas forman colonias verdosas. Identificación y confirmación De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 37± 1ºC durante h. Al cabo de la incubación, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmación bioquímica y serológica. Sobre el cultivo puro realizar - tinción de Gram - oxidasa Inocular los cultivos que resulten coco-bacilos Gram negativos y oxidasa negativos en los siguientes medios. - TSI: en superficie y en profundidad - Medio LIA - Medio para ureasa (puede ser BAM) - β-galactosidasa - Reacción de Voges Proskauer - Reacción de indol Consultar TP N 2 - Salmonella, para desarrollar los ensayos y consultar los resultados característicos. De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas múltiples. Confirmación serológica Seguir la técnica explicada en TP Nº 2: Enterobacterias Salmonella. Emplear una cepa patrón de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios empleados en las pruebas de confirmación e identificación. Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el análisis (25 g, en este caso). Aclarar modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas. 28

29 REQUISITOS MICROBIOLOGICOS DEL CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO - MERCOSUR LECHE Art. 558 (Res. MSyAS N 047 del ):...La leche entera pasteurizada, deberá responder a las siguientes exigencias: a) Estar exenta de gérmenes patógenos. Esta exigencia no se dará por cumplida si presenta: 1- Recuento total en placa: mayor de bacterias mesófilas/cm 3 en los meses de abril a septiembre inclusive y mayor de bacterias /cm 3 en los meses de octubre a marzo, inclusive. 2- Bacterias coliformes (recuento en placa con medio agar-violeta-rojo-bilis): mayor de 50/cm 3 3- Escherichia coli: presencia en 1cm 3. Deberá ser confirmada por pruebas bioquímicas. 4- Prueba de la fosfatasa positiva. Art. 559 (Res. MSyAS N 047 del ): Leche entera seleccionada pasteurizada. Sin haber sido sometida a ningún tratamiento previo, debe presentar un contenido microbiano no mayor de bacterias mesófilas/cm 3. La leche entera seleccionada pasteurizada deberá estar exenta de gérmenes patógenos. Esta exigencia no se dará por cumplida si presenta: 1- Recuento total en placa: mayor de bacterias mesófilas/cm 3 de abril a septiembre, inclusive y mayor de bacterias mesófilas/cm 3 de octubre a marzo, inclusive. 2- Bacterias coliformes (recuento en placa con medio agar-violeta-rojo-bilis): mayor de 10/cm 3 3- Escherichia coli: presencia en 1cm 3. Deberá ser confirmada por pruebas bioquímicas. 4- Prueba de la fosfatasa positiva. Art. 559bis (Res. MSyAS N 047 del ): Leche entera certificada pasteurizada. Sin haber sido sometida a ningún tratamiento previo, no debe presentar gérmenes patógenos y su contenido microbiano no debe ser superior a bacterias mesófilas/cm 3. La leche entera certificada pasteurizada deberá estar exenta de gérmenes patógenos. Esta exigencia no se dará por cumplida si presenta: 1- Recuento total en placa: mayor de bacterias mesófilas/cm 3 en el momento de su recepción por el consumidor. 2- Bacterias coliformes presencia en 1/cm 3 3- Prueba de la fosfatasa positiva. Art. 559tris (Res. MSyAS N 328 del ): Se entiende por leche ultrapasteurizada a la leche, homogeneizada o no, que haya sido sometida durante por lo menos 2 segundos a una temperatura mínima de 138 C mediante un proceso térmico de flujo continuo, inmediatamente enfriada a menos de 5 C y envasada en forma no aséptica en envases estériles y herméticamente cerrados. 29

30 Deberá responder a las siguientes exigencias: CATEGORIA ICMSF VALORES 1- Recuento de mesófilos totales /cm 3 : 3 n=5 c=2 m=10 2 M= Recuento de coliformes a 30 C/cm 3 : 6 n=5 c=2 m<3 M=10 3- Recuento de coliformes a 45 C/cm 3 : 6 n=5 c=1 m<3 M=10 4- Prueba de la fosfatasa Negativa 5- Prueba de la peroxidasa Negativa Leche UHT Res MS y AS Nº 110 del GMC Res. N 78/94 MICROORGANISMOS CRITERIO DE ACEPTACION CATEGORIA I.C.M.S.F. Microorganismos aerobios mesófilos viables/ml METODO DE ENSAYO n=5 c=0 m= FIL1008: 1991 Resoluciones MS y AS: N 003 del y N 433 del Leche en polvo Criterios microbiológicos y tolerancias MICROORGANISMOS CRITERIO DE ACEPTACION CATEGORIA Microorganismos aerobios mesófilos viables/g METODO DE ENSAYO (Codex, Vol. H CAC/RCP 31-83) I.C.M.S.F. n=5 c=2 m= M= FIL100:A 1987 Coliformes (a 30 C)/g n=5 c=2 m= 10 M=100 5 FIL 73A: 1985 Coliformes (a 45 C)/g n=5 c=2 m< 3 M=10 5 APHA 1992 Cáp. 24 S. aureus coag. pos./g n=5 c=1 m= 10 M=100 8 FIL 60A: 1978 Salmonella spp./25 g n=10 c=0 m= 0 11 FIL 93A:

31 ANÁLISIS DE MANTECAS Y MARGARINAS 1) Preparación de la muestra y diluciones: (FIL 73 A:1985) Colocar en un tubo estéril con capacidad para 50 ml, la muestra de manteca o margarina, de forma de no superar el 50% de la capacidad del tubo. Fundir la muestra en baño de agua a 45ºC durante 15 minutos agitando para evitar la separación del suero de la grasa. Transferir con una pipeta precalentada 10 ml de material del material fundido a un erlenmeyer con 90 ml de agua de dilución estéril a 45ºC (dilución 1/10). Homogeneizar por agitación evitando la separación de las fases. Las diluciones sucesivas se efectúan transfiriendo 1 ml a tubos conteniendo 9 ml de agua de dilución estéril a 45ºC. Alternativamente se puede trabajar solamente con la fase acuosa y sus diluciones. Permitir la separación de las fases (dejar reposar a 45 C por no más de 15 minutos) y tomar de la fase inferior: 1 ml equivale a 1 gramo de manteca. 2) Metodología de análisis a) Recuento de bacterias psicrotróficas b) Recuento de bacterias proteolíticas c) Recuento de bacterias lipolíticas d) Recuento de coliformes totales e) Recuento de coliformes a 45 C f) Determinación de Escherichia coli g) Recuento de hongos y levaduras h) Recuento de Staphylococcus aureus i) Determinación de Salmonella a) Recuento de bacterias psicrotróficas (APHA, 1992) Este recuento puede realizase bajo diferentes combinaciones de temperatura/tiempo. Se procede de la misma forma que para el recuento de aerobios empleando agar para recuento en placa (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aprox ºC. Se mezcla para lograr una distribución homogénea. Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones sucesivas. Se incuba a 7ºC por 10 días (ó, 21 C por 25 horas ó, 18 C por 45 horas). Se informa UFC de bacterias psicrótrofas /ml ó g. b) Recuento de bacterias proteolíticas (APHA, 1992) Medio de cultivo: agar para recuento en placa (APC) con leche al 10%. Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri. Agregar el agar fundido a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar. Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml de la dilución 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar de la misma forma que antes. Dejar solidificar. Incubar invertidas a 21± 2ºC durante 72 horas. Para revelar, si no se observaran directamente los halos de clarificación, inundar las placas con HCl 1% o ácido acético 10% durante 1 minuto, volcando luego el ácido. Si el recuento se realizó en duplicado, emplear las placas que contengan entre 25 y 250 colonias. Tener en cuenta la dilución empleada. 31

32 Si se hizo el recuento combinado, contar el número de colonias en las tres placas. Corresponden al número de bacterias proteolíticas en 1 g de muestra. Informar como UFC de bacterias proteolíticas /g. c) Recuento de bacterias lipolíticas (APHA, 1992) Medio de cultivo: agar tributirina Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri. Agregar el agar fundido a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar. Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml de la dilución 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar de la misma forma que antes. Dejar solidificar. Incubar invertidas a temperaturas entre 20 a 30ºC durante 72 horas. La hidrólisis de la tributirina se evidencia como una zona clara alrededor de las colonias. Si el recuento se realizó en duplicado, emplear las placas que contengan entre 25 y 250 colonias. Tener en cuenta la dilución empleada. Si se hizo el recuento combinado, contar el número de colonias en las tres placas. Corresponden al número de bacterias lipolíticas en 1 g de muestra. Informar como UFC de bacterias lipolíticas /g d) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985) El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio sólido o en medio líquido (por la técnica de NMP: número más probable). d.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa) Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri. Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV fundido a aprox ºC. Mezclar. Dejar solidificar completamente y agregar entonces 4 ml más de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las placas invertidas a 30ºC por h. Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas oscuras con diámetro de por lo menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes. Confirmación: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto). Incubar a 30ºC por h. Se consideran positivas aquellas colonias que den producción de gas. El resultado se calcula en base al número de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de coliformes totales /ml ó g. La confirmación de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que contengan otros azúcares distintos de lactosa. d.2) Técnica del número más probable (NMP) Prueba presuntiva Inocular por triplicado 1ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30ºC por 48 h. Se consideran positivos aquellos tubos que presenten formación de gas en la campanita de Durham. De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. Se utilizarán tubos doble concentración de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. 32

33 Prueba de confirmación Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno). Incubar a 30ºC por h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/ rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metálico. Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/ml ó g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas. e) Recuento de coliformes a 45 C (APHA, 1992) A partir de los tubos positivos en d.2 (coliformes totales a 30 C, por NMP), inocular un tubo de fermentación de caldo EC. Incubar 24 h a 45 C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45 C (coliformes fecales). Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45 C/ml ó g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas. f) Determinación de Escherichia coli (Mossel y Moreno García, "Microbiología de los alimentos. Fundamentos ecológicos para garantizar y comprobar la inocuidad y calidad de los alimentos."; Ed. Acribia, 1985) Inocular 1 g de muestra en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS). Incubar a 20-25ºC por 5-6 h. Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham). Incubar a 30ºC ± 1 C durante h. Los tubos en los que no se verifique formación de gas se consideran negativos. En este caso se informa ausencia de E. coli en 1 gramo. Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estría en agar Mac Conkey. Incubar a 44ºC± 0,1 C (preferentemente en baño de agua) durante 30 h. Si existiese crecimiento típico (colonias rojas), tomar colonias aisladas y realizarles 1- Gram 2- Siembra en tubo de fermentación caldo verde brillante 2% sales biliares con lactosa. Incubar a 44 C por 48 horas. 3- Siembra en caldo triptona. Incubar a 44 C por 48 horas 4- Siembra en agar citrato. Incubar a 30 C por 48 horas. Resultados característicos: 1- Cocobacilo Gram negativo no formador de esporas. 2- Fermentación de lactosa a 44 C con formación de gas. 3- Producción de indol a 44 C 4- No utiliza citrato Alternativamente se pueden utilizar las pruebas del IMViC para la identificación De ser posible ensayar el cultivo sospechoso con un sistema de pruebas múltiples (API, MICRO-ID, o semejantes). En caso de confirmarse, informar presencia de E. coli en 1 ml de muestra. Indicar las pruebas de identificación realizadas. 33

34 g) Recuento de mohos y levaduras (FIL 94 B: 1990) Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri. Agregar agar YGC (cloranfenicol-glucosa-extracto de levadura) fundido a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar. Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml de la dilución 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar YGC de la misma forma que antes. Dejar solidificar. Incubar sin invertir a 25± 1ºC durante 5 días. Si se hizo el recuento por duplicado, contar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si hay excesivo crecimiento contar la placa de mayor dilución aún cuando contenga menos de 10 colonias. Si se hizo el recuento combinado, contar el número de colonias en las tres placas. Corresponden al número de mohos y levaduras en 1 g de muestra. Las colonias sospechosas o dudosas deben confirmarse por observación microscópica. Informar el resultado como UFC de mohos y levaduras /g de muestra. h) Recuento de Staphylococcus aureus (FIL 145:1990) Se recomienda realizar el recuento sembrando por duplicado cada dilución. En caso de requerir un inóculo más grande por un valor bajo del requisito microbiológico de aceptación, puede hacerse una siembra combinada de la siguiente forma: Distribuir 1 ml de dilución 1/10 equitativamente en la superficie de tres placas de agar Baird Parker perfectamente secas. Distribuir con una espátula de Drigalsky cuidadosamente (tener la precaución de enfriar bien la espátula para no matar los microorganismos). Dejar secar las placas tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez secas, incubarlas invertidas a 37±1ºC durante 24-48h. Tomar para enumerar placas con no más de 150 colonias. Seleccionar un número representativo de colonias típicas y atípicas; y transferirlas a tubos de caldo infusión cerebrocorazón. Incubar a 37 C ó 35ºC por 20 a 24 h Las colonias típicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara, generalmente un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara. Identificación y confirmación Sobre los cultivos puros de horas, realizar - Tinción de Gram - Catalasa - Coagulasa (comparar con cepa patrón): Agregar 0,1 ml del cultivo a aprox. 0,3 ml de plasma de conejo reconstituido en un tubo estéril. Incubar a C. Examinar después de 4 a 6 horas. El coágulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo (4+). Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estéril en lugar del cultivo. Para que el ensayo sea válido, no debe observarse ningún signo de coagulación. Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa de Baird Parker. S. aureus coagulasa positiva son cocos Gram positivos, catalasa positivo, coagulasa positivo (3 o 4+) y termonucleasa positivo. Informar UFC de S. aureus coagulasa positivo/ g de muestra. Para realizar el cálculo contar el número total de colonias confirmadas en las tres placas. 34

35 i) Determinación de Salmonella (FIL 93 A: 1985) Preenriquecimiento en medio líquido Preparar un erlenmeyer con 225 ml de agua destilada con 1 ml de solución de Verde Brillante (0,5% en agua, agregar verde brillante al agua; dejar la solución en la oscuridad por lo menos un día para autoesterilizar). Pesar asépticamente 25g de muestra en dicho erlenmeyer. Dejar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h sin agitar. Incubar a 37±1ºC durante h. Enriquecimiento en medio líquido. Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo tetrationato (Müller Kauffmann). Incubar a 43 ± 0,5ºC durante h. Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 37±1ºC durante h. Aislamiento en medio sólido A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo Fenol (agar BPLS) y una de agar Bismuto Sulfito (son cuatro placas en total). Incubar las placas invertidas a 37±1ºC durante h. De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento h más y volver a estriar en los medios de aislamiento. Si al cabo del período de incubación el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por h adicionales a la misma temperatura. Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella. En agar BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar Bismuto Sulfito, las colonias típicas son marrones a negras con brillo metálico. Algunas cepas forman colonias verdosas. Identificación y confirmación De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 37±1ºC durante h. Al cabo de la incubación, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmación bioquímica y serológica. Sobre el cultivo puro realizar - tinción de Gram - oxidasa Inocular los cultivos que resulten coco-bacilos Gram negativos y oxidasa negativos en los siguientes medios. - TSI: en superficie y en profundidad - Medio LIA - Medio para ureasa (puede ser BAM) - β-galactosidasa - Reacción de Voges Proskauer - Reacción de indol Consultar TP N 2-Salmonella, para desarrollar los ensayos y consultar los resultados característicos. De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas múltiples. 35

36 Confirmación serológica Seguir la técnica explicada en TP Nº 2: Enterobacterias-Salmonella Emplear una cepa patrón de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios empleados en las pruebas de confirmación e identificación. Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el análisis (25 g, en este caso). Aclarar modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas. 36

37 REQUISITOS MICROBIOLOGICOS DEL CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO - MERCOSUR Manteca Art. 596 Res MS y AS Nº 003 del Criterios microbiológicos y tolerancias MICROORGANISMOS CRITERIO DE ACEPTACION (Codex, Vol. H CAC/RCP 31-83) CATEGORIA I.C.M.S.F. METODO DE ENSAYO Coliformes totales /g n=5 c=2 m= 10 M=100 5 FIL 73ª 1985 Coliformes (a 45 C)/g n=5 c=2 m< 3 M=10 5 APHA 1992 Cáp. 24 S. aureus coag. pos./g n=5 c=1 m= 10 M=100 8 FIL Salmonella spp./25 g n=5 c=0 m= 0 10 FIL 93ª 1985 Margarina Art (Res ) Deberá responder a las siguientes características microbiológicas: Bacterias coliformes: máximo 10/g Escherichia coli: ausencia en 1 g Bacterias proteolíticas: máximo 50/g Bacterias lipolíticas: máximo 50/g Hongos y levaduras: máximo 50/g 37

38 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS LACTEOS HELADOS Los productos lácteos congelados son responsables de algunas intoxicaciones e infecciones intestinales. Con la denominación genérica de helados se entiende los productos elaborados por la congelación de mezclas líquidas constituidas por leche, leche en polvo, leche condensada, leche evaporada, manteca, crema de leche, zumos o jarabes de frutas, huevos frescos, conservados, yemas de huevo, café, frutas naturales o confitadas, chocolate, colorantes y demás sustancias de uso permitido. Las mezclas deben ser pasteurizadas. El origen de las bacterias y otros microorganismos en los helados son las distintas materias primas con las que se las prepara, utensilios que se emplean en el manipuleo y cualquier contaminación que pueda llegar a ellos durante las operaciones. 1) Preparación de la muestra y diluciones (FIL 73 A: 1985) Colocar el helado en un baño de agua caliente a 37 C, impedir que la muestra exceda esta temperatura. Agitar para favorecer que se derrita y tomar la muestra de análisis ni bien se derrita totalmente. Pesar 10 g de helado en un erlenmeyer que contiene 90 ml de agua peptona 0,1% estéril. Homogeneizar completamente. A partir de esta dilución (1/10) preparar las siguientes en transfiriendo 1 ml a tubos con 9 ml de agua peptona 0,1%. Homogeneizar en agitador. 2) Metodología de análisis a) Recuento de bacterias aerobias mesófilas b) Recuento de coliformes totales c) Recuento de coliformes a 45 C d) Determinación de Salmonella e) Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva f) Recuento de mohos y levaduras a) Recuento de bacterias aerobias mesófilas (FIL 100 B: 1991) 1- Se vierte 1 ml de cada dilución por duplicado en placas de Petri y se agrega el agar para recuento (APC) con 0,1 % de leche en polvo descremada ya fundido y mantenido a aprox ºC. Se mezcla para lograr una distribución homogénea. Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones sucesivas. 2- Cuando las placas estén frías se invierten y se incuban a 30ºC ± 1 C durante 72h ± 3 h. 3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en el capítulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se multiplica el número promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilución correspondiente y se informa como UFC de bacterias aerobias mesófilas/ml ó g. b) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A: 1985) El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio sólido o en medio líquido (por la técnica de NMP: número más probable) b.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa) Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri. 38

39 Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV fundido a aprox ºC. Mezclar. Dejar solidificar completamente y agregar entonces 4 ml más de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las placas invertidas a 30ºC por h. Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas oscuras con diámetro de por lo menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes. Confirmación: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto). Incubar a 30ºC por h. Se consideran positivas aquellas colonias que den producción de gas. El resultado se calcula en base al número de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de coliformes totales /ml ó g. La confirmación de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que contengan otros azúcares distintos de lactosa. b.2) Técnica del número más probable (NMP) Prueba presuntiva Inocular por triplicado 1ml de muestra y de las diluciones sucesivas en tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30ºC por 48 h. Se consideran positivos aquellos tubos que presenten formación de gas en la campanita de Durham. De ser necesario, inocular 10 ml de muestra en vez de 1 ml. Se utilizarán tubos doble concentración de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Prueba de confirmación Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno). Incubar a 30ºC por h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/ rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metálico. Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas. c) Recuento de coliformes a 45 C (APHA, 1992) A partir de los tubos positivos b.2 (coliformes totales a 30 C, por NMP), inocular un tubo de fermentación de caldo EC. Incubar 24 h a 45 C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45 C (coliformes fecales). Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Con la ayuda de una tabla de Número Más Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45 C/g de muestra, teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas. d) Determinación de Salmonella Preenriquecimiento en medio líquido Preparar un erlenmeyer con 225 ml de agua destilada con 1 ml de solución de Verde Brillante (0,5% en agua, agregar verde brillante al agua; dejar la solución en la oscuridad por lo menos un día para autoesterilizar). Pesar asépticamente 50 g de muestra en dicho erlenmeyer. Dejar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h sin agitar. Incubar a 37±1ºC durante h. 39

40 Enriquecimiento en medio líquido. Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo tetrationato (Müller Kauffmann). Incubar a 43 ± 0,5ºC durante h. Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 37±1ºC durante h. Aislamiento en medio sólido A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo Fenol (agar BPLS) y una de agar Bismuto Sulfito (son cuatro placas en total). Incubar las placas invertidas a 37±1ºC durante h. De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento h más y volver a estriar en los medios de aislamiento. Si al cabo del período de incubación el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por h adicionales a la misma temperatura. Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella. En agar BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar Bismuto Sulfito, las colonias típicas son marrones a negras con brillo metálico. Algunas cepas forman colonias verdosas. Identificación y confirmación De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 37±1ºC durante h. Al cabo de la incubación, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmación bioquímica y serológica. Sobre el cultivo puro realizar - tinción de Gram - oxidasa Inocular los cultivos que resulten coco-bacilos Gram negativos y oxidasa negativos en los siguientes medios. - TSI: en superficie y en profundidad - Medio LIA - Medio para ureasa (puede ser BAM) - β-galactosidasa - Reacción de Voges Proskauer - Reacción de indol Consultar TP N 2-Salmonella, para desarrollar los ensayos y consultar los resultados característicos. De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas múltiples. Confirmación serológica Seguir la técnica explicada en TP Nº 2: Enterobacterias -Salmonella Emplear una cepa patrón de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios empleados en las pruebas de confirmación e identificación. Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el análisis (25 g, en nuestro caso). Aclarar modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas. 40

41 e) Recuento de S. aureus (FIL 145:1990) Se recomienda realizar el recuento sembrando por duplicado cada dilución. En caso de requerir un inóculo más grande por un valor bajo del requisito microbiológico de aceptación, puede hacerse una siembra combinada de la siguiente forma: Distribuir 1 ml de dilución 1/10 equitativamente en la superficie de tres placas de agar Baird Parker perfectamente secas. Distribuir con una espátula de Drigalsky cuidadosamente (tener la precaución de enfriar bien la espátula para no matar los microorganismos). Dejar secar las placas tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez secas, incubarlas invertidas a 37± 1ºC durante h. Tomar para enumerar placas con no más de 150 colonias. Seleccionar un número representativo de colonias típicas y atípicas; y transferirlas a tubos de caldo infusión cerebrocorazón. Incubar a 37 C ó 35ºC por 20 a 24 h Las colonias típicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara, generalmente un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara. Identificación y confirmación Sobre los cultivos puros de horas, realizar - Tinción de Gram - Catalasa - Coagulasa (comparar con cepa patrón): Agregar 0,1 ml del cultivo a aprox. 0,3 ml de plasma de conejo reconstituido en un tubo estéril. Incubar a C. Examinar después de 4 a 6 horas. El coágulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo (4+) Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa de Baird Parker. S. aureus coagulasa positiva son cocos Gram positivos, catalasa positivo, coagulasa positivo (3 o 4+) y termonucleasa positivo. Informar UFC de S. aureus coagulasa positivo/ g de muestra. Para realizar el cálculo contar el número total de colonias confirmadas en las tres placas. f) Recuento de mohos y levaduras (FIL 94 B: 1990) Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri. Agregar agar YGC (cloranfenicol-glucosa-extracto de levadura) fundido a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar. Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml de la dilución 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar YGC de la misma forma que antes. Dejar solidificar. Incubar sin invertir a 25± 1ºC durante 5 días. Si se hizo el recuento por duplicado, contar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si hay excesivo crecimiento contar la placa de mayor dilución aún cuando contenga menos de 10 colonias. Si se hizo el recuento combinado, contar el número de colonias en las tres placas. Corresponden al número de mohos y levaduras en 1 g de muestra. Las colonias sospechosas o dudosas deben confirmarse por observación microscópica. Informar el resultado como UFC de mohos y levaduras /g de muestra. 41

42 REQUISITOS MICROBIOLOGICOS DEL CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO - MERCOSUR Helados Art (Res 2141, ): Los distintos tipos de helados deberán responder a las siguientes exigencias microbiológicas: I. Helados de elaboración industrial: a) Ausencia de gérmenes patógenos. Esta exigencia se dará por no cumplida si el producto presenta: 1. Recuento de bacterias aerobias mesófilas (PCA, 30ºC, 72 h): mayor de /g 2. Bacterias coliformes: más de 100/g 3. Bacterias coliformes fecales: más de 1/g 4. Staphylococcus aureus coagulasa positiva: más de 500/g 5. Salmonella: presencia en 50 g 6. (Res. 23, ): Cuando el recuento de hongos y levaduras supere 100/g sólo podrá recomendarse verificar las prácticas de elaboración y la calidad de las materias primas utilizadas, no siendo este indicador habilitante para declarar al producto No Apto para el Consumo. b) Ausencia de toxinas microbianas. II. Helados de elaboración artesanal: a) Ausencia de gérmenes patógenos. Esta exigencia se dará por no cumplida si el producto presenta: 1. Recuento de bacterias aerobias mesófilas (PCA, 30ºC, 72 h): mayor de /g 2. Bacterias coliformes: más de 150/g 3. Bacterias coliformes fecales: más de 1/g 4. Staphylococcus aureus coagulasa positiva: más de 500/g 5. Salmonella: presencia en 50 g 6. (Res. 23, ): Cuando el recuento de hongos y levaduras supere 100/g sólo podrá recomendarse verificar las prácticas de elaboración y la calidad de las materias primas utilizadas, no siendo este indicador habilitante para declarar al producto No Apto para el Consumo. b) Ausencia de toxinas microbianas. 42

43 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE CONSERVAS ALTERADAS (APHA 1992) 1) Preparación de las latas - Sacar las etiquetas y guardarlas; numerar las latas del lado que no se va a abrir. - Registrar los datos del envase; pesar la lata y comparar con lo indicado. - Examinar el exterior en busca de fallas de suturas, fugas, abolladuras, corrosión, etc. - Lavar con agua y jabón, enjuagar bien y secar. 2) Apertura de las latas a) Latas abombadas: deben tomarse precauciones para evitar proyecciones del contenido al perforar la lata. Se recomienda enfriarlas previamente durante unas horas. - Desinfectar la tapa bañándola con una solución de hipoclorito 2% durante 15 minutos; retirar el exceso y secar con toalla estéril o en flujo laminar. No flamear. - Colocar la lata dentro de un recipiente con un poco de hipoclorito de sodio al 2% y cubrirla con un embudo de vidrio cuyo vástago está cerrado con algodón, a través del cual pasa una varilla puntiaguda o punzón (todo el conjunto esterilizado). - Perforar el centro de la lata con un golpe seco del punzón, y de ser posible, recoger el gas que emana con un tubo invertido. - Retirar el embudo cuando las presiones se hayan igualado y abrir la lata en forma normal con un abrelatas estéril. Cubrir la superficie con una placa de Petri estéril. b) Latas no abombadas: - Desinfectar con hipoclorito 2% durante 15 minutos; retirar el exceso y flamear hasta sequedad. - Abrir con abrelatas estéril y cubrir con una placa de Petri estéril. 3) Toma de material La técnica utilizada para obtener material y el punto de donde hay que tomarlo varían según la naturaleza del producto. - Líquidos: con pipeta estéril, sembrando directamente en los medios de cultivo. - Semilíquidos: con pipeta de boca ancha, sembrando directamente en los medios de cultivo o diluyendo con agua estéril. - Sólidos en líquidos: tomar de ambas partes; 10 ml del líquido con pipeta estéril y 10 g de sólido con espátula estéril. - Sólidos: con espátula estéril o con sacabocados estéril, descargándolo con ayuda de una varilla de vidrio flameada. Los líquidos y semilíquidos se siembran directamente en los medios, a razón de 1-2 ml cada 10 ml de medio. Los sólidos se transfieren a un recipiente estéril de boca ancha de 100 ml, que contiene 50 ml de agua destilada estéril. Se agita para homogeneizar. Se recomienda guardar parte de la muestra para repetir análisis en caso necesario. 4) Examen del contenido Registrar el olor y aspecto del alimento y compararlos con las características del producto normal. Medir el ph. 43

44 5) Examen microscópico Tomar material con un ansa y hacer un extendido, secarlo, fijarlo y colorearlo con cristal violeta. Si el alimento es graso, enjuagar con xilol luego de fijarlo. Si se dispone de microscopio de contraste de fases, realizar un montaje húmedo, de una ansada del material con agua, cubrir con cubre-objetos y observar. 6) Cultivo a) alimentos de ph mayor que 4,6 (Todas las determinaciones se efectúan por duplicado) a.1) Microorganismos aerobios Sembrar 2 placas de agar triptona-glucosa (GTA) por estría, incubándolas 4 días a C y a 55 C respectivamente. También pueden utilizarse tubos con caldo triptona-glucosa (GTB), sembrando 1 ml o 1 g del alimento. a.2) Microorganismos anaerobios Tomar 2 tubos de medio PE-2 o carne cocida (CMM), calentar en baño María 20 minutos, enfriar y sembrar 1 g o 1 ml del alimento sin burbujear. Sellar uno de ellos con Vas-par (vaselina-parafina 50-50%) e incubarlo hasta 10 días a 35 C.Sellar el otro con agar al 2,5 % fundido. Dejar solidificar y llevar a baño de 55 C para preincubar. Luego incubar en estufa de 55 C, 4 días. La marcha continúa según se indica en el esquema de la página siguiente. b) alimentos de ph menor que 4,6 b.1) Microorganismos aerobios Sembrar 2 placas de agar termoacidurans (TAA), por estría e incubarlas a 35 y 55 C respectivamente. O bien sembrar 2 tubos de caldo suero de naranja (OSB) con 1 g o 1 ml de del alimento e incubarlos 4 días de dichas temperaturas. b.2) Microorganismos anaerobios Fundir el agar termoacidurans (TAD) en tubos, enfriar a 45 C y sembrar 1 ml del alimento al fondo sin burbujear. Dejar solidificar, incubar 5 días a C. b.3) Hongos Sembrar por estría una placa de agar para recuento de hongos. Incubar 5-7 días a 28 C. 44

45 ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE CONSERVAS DE BAJA ACIDEZ MARCHA AEROBIA MUESTRA 30-35ºC (hasta 4 días) GTA/GTB Aerobiosis 55ºC (hasta 4 días) crecimiento + Examen microscópico crecimiento + Bacilos con o sin esporas Cultivo mixto Bacilos, cocos, hongos y levaduras. Contaminación post-proceso. Solo bacilos NAMn 30-35ºC (hasta 10 días) crecimiento + NAMn 55ºC (hasta 10 días) Esporas + Esporas Contaminación post-proceso. Esporas Contaminación post-proceso. Esporas + Shock térmico 85ºC 10 min NAMn 30-35ºC (hasta 4 días) crecimiento + Bacillus sp mesófilo Proceso térmico insuficiente NAMn 55ºC (hasta 4 días) crecimiento + Bacillus sp termófilo Enfriado insuficiente o temperatura muy alta de almacenamiento Crecimiento + a 30 y a 55ºC Bacillus sp. termófilo facultativo 45

46 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE CONSERVAS DE BAJA ACIDEZ MARCHA ANAEROBIA MUESTRA PE-2 o CMM Anaerobiosis 30-35ºC (hasta 10 días) 55ºC (hasta 4 días) crecimiento + Examen microscópico crecimiento + Examen microscópico Cultivo mixto Bacilos, cocos, mohos y levaduras. Contaminación postproceso. Bacilos con o sin esporas Bacilos largos y delgados de tinción débil. Anaerobios termófilos productores de SH 2 Insuficiente enfriamiento o temperatura de almacenamiento muy alta Bacilos cortos Bacillus sp. facultativo Insuficiente enfriamiento o temperatura de almacenamiento muy alta LVA 30-35ºC (hasta 4 días) Aerobiosis LVA 30-35ºC (hasta 4 días) Anaerobiosis Crecimiento + Bacillus sp. mesófilo Posible contaminación post-proceso Crecimiento + Clostridium sp. mesófilo* Posible inadecuado proceso térmico Crecimiento + Aerobiosis y anaerobiosis Examen microscópico Cultivo puro Anaerobio facultativo Cultivo mixto * * Buscar toxina botulínica en el cultivo 46

47 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE CONSERVAS ACIDAS MARCHA AEROBIA MUESTRA TAA o OSB Aerobiosis 30-35ºC (hasta 5 días) 55ºC (hasta 5 días) Crecimiento + Bacillus sp. mesófilo (flat sour) Proceso térmico insuficiente Crecimiento + Bacillus sp. termófilo o termófilo facultativo (flat sour) Enfriamiento insuficiente o alta temperatura de almacenamiento MARCHA ANAEROBIA MUESTRA MOHOS Y LEVADURAS MUESTRA TAD Anaerobiosis 35ºC (hasta 5 días) PDA o YGC 25ºC (hasta 5 días) Crecimiento + Anaerobios mesófilos butíricos 47

48 METODO DE CAMARA DE HOWARD PARA RECUENTO DE FILAMENTOS DE HONGOS EN CONSERVAS (AOAC , 1990) 1) Recuentos de hongos en conservas de tomate Por ser los tomates de naturaleza ácida, es más fácil preparar sus conservas que las de otros alimentos. Los tiempos y temperaturas de calentamiento son relativamente bajos. Si el productor emplea tomates sanos, se obtiene un producto de alta calidad que llena los requisitos estipulados por las reglamentaciones, pero si no lo son y hay crecimiento fúngico en ellos, el producto no resulta de buena calidad. El recuento de mohos en cámara de Howard es una forma de conocer la calidad de los productos terminados. Por este método se determina microscópicamente el porcentaje de campos que contienen filamentos de hongos en una muestra de conservas de tomates. 2) Materiales Se emplea un portaobjetos especial en el centro consta de un rectángulo de 15 x 20 mm que está limitado a cada lado por depresiones y soportes paralelos. Estos están 0,1 mm más altos que el rectángulo el cubre objeto queda apoyado sobre estas barras. El rectángulo, los soportes y el cubreobjetos tienen superficies planas. Para facilitar la calibración del microscopio, el rectángulo tiene dos líneas paralelas separadas 1,382 mm. Para el recuento de mohos el campo del microscopio debe tener 1,5 mm 2 (una circunferencia de 1,382 mm de diámetro) y debe utilizarse una magnificación comprendida entre 90 y 125 aumentos totales (fig. 1). 3) Preparación de la muestra Tratándose de jugo de tomate o de salsa ketchup la muestra es examinada tal como viene en el envase. Pesar 20 g de muestra y colocarlo en un vaso de precipitados. Agregar 50 ml de agua estéril y mezclar. En el caso de puré o pasta de tomates se agrega agua para obtener 8,37%- 9,37% de sólidos totales, lo cual puede verificarse midiendo el índice de refracción a 20 C (1,3447-1,3460). Para facilitar la observación microscópica se recomienda usar como diluyente un colorante que se prepara en la forma siguiente: disolver 0,1 g de azul de algodón en 100 ml de lactofenol (partes iguales de fenol, glicerina, ácido láctico y agua). No se colorean los protoplasmas viejos, pero sí los elementos anatómicos del tomate. Debe limpiarse la cámara de Howard de modo que se produzcan anillos concéntricos con los colores del arco iris, los cuales se pueden observar sosteniendo el portaobjetos en un ángulo tal que la luz se refleje sobre el cubreobjetos. Los anillos de Newton se deben a la descomposición de la luz cuando se adosan perfectamente dos cristales de superficies pulidas. Sobre el portaobjetos se coloca una porción de la muestra bien homogeneizada, de modo tal que cubra exactamente el centro y cuyo espesor sea suficiente para llenar completamente el espacio existente entre porta y cubreobjetos. Es necesario evitar derrames laterales y en el preparado no deben quedar burbujas de aire. La iluminación debe ser normal ya que demasiada luz impide una observación adecuada. La preparación se lleva al microscopio y se observan 25 campos normalizados. Para tal fin con el objetivo de 10 aumentos se regula el ocular adecuado (8x, 10x, 12x) de forma tal que las dos líneas paralelas grabadas en el portaobjetos sean tangentes al campo. Dicho campo normalizado tiene un diámetro de 1,382 mm y una superficie de 1,5 mm 2. Los 25 campos deben observarse de modo tal que el resultado obtenido sea representativo del total del preparado (método oficial). La distribución de campos ideal corresponde a la figura 2. Se deben examinar por lo menos dos preparados. 48

49 Cada campo se observa anotando la ausencia o presencia de filamentos fúngicos; cuando la identificación es difícil se usa un aumento de 200x. Debe usarse el tornillo micrométrico para observar filamentos en todos los planos del preparado. En el caso de observarse filamentos cortos, se consideran positivos aquellos campos en los cuales la longitud agregada de no más de tres filamentos exceda 1/6 del diámetro del campo. 4) Cálculo Se suman los campos positivos de ambas determinaciones, se multiplica por dos y se obtiene el porcentaje de campos positivos. Reglamentación bromatológica En las conservas de tomate se establecen las siguientes tolerancias en el recuento de filamentos en cámara de Howard (EE.UU. y Canadá): 1- Los jugos de tomate examinados, no deben tener más del 25% de campos positivos. 2- Las latas de tomates, ketchup, los purés de tomates, no deben superar el 60% de campos positivos. Reglamentación Bromatológica Nacional (CAA) Todas las muestras de conservas de tomates (jugos, salsas, puré, extracto, ketchup) examinadas al microscopio por el método de Howard diluidas de tal manera que contengan 8,37%-9,37% de residuo sólido, no acusarán más del 50% de campos con filamentos de hongos. figura 1 figura 2 49

50 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AZÚCAR Tan pronto se estableció que el azúcar puede contener bacterias, levaduras y mohos, que al proliferar pueden producir deterioro en los alimentos enlatados y en las bebidas sin alcohol en que se usa, se desarrollaron métodos adecuados para su recuento. ANÁLISIS DEL AZÚCAR PARA PRODUCTOS ENLATADOS Los laboratorios de la National Canners Association de USA pusieron a punto una serie de ensayos, que, junto con otros, nos permiten reconocer la calidad del azúcar que se examina. 1) Muestreo Tomar muestras de 250 g de 5 bolsas de cada lote. Estas muestras deben enviarse al laboratorio en envases limpios y cerrados. 2) Preparación de las muestras Colocar 20 g del azúcar en un erlenmeyer estéril de 150 ml marcado al nivel de 100 ml. Agregar agua estéril hasta la marca, llevar rápidamente a ebullición y mantenerla por 5 minutos. Reemplazar el agua evaporada por agua estéril. 3) Metodología de análisis a) Esporas del flat sour o fermentación simple b) Recuento total c) Termófilos anaerobios que no producen SH 2 d) Termófilos anaerobios que producen SH 2 a) Esporas del flat sour o fermentación simple Utilizar 5 cajas de Petri y pipetear en cada una 2 ml de la solución hervida del azúcar. Cubrir y mezclar el inóculo con agar triptona glucosa. Incubar las cajas a 55 C durante 48 h. El recuento combinado de las 5 cajas representa el número de esporas en 2 g de azúcar original. Se multiplica esta cuenta por 5 para expresar los resultados como: nº de esporas / 10 g de azúcar. Las esporas del flat sour son características: son circulares y miden de 2 a 5 mm de diámetro. Tienen un centro típico opaco y debido a la producción de ácido, en presencia del indicador, habitualmente están rodeadas de un halo amarillo. Este halo puede ser insignificante y aún faltar en algunos tipos que producen muy poca acidez. Las colonias subsuperficiales aparecen como colonias puntiformes. Cuando las cajas tienen un exceso de colonias y no pueden contarse las colonias típicas del flat sour se hará una segunda caja usando una dilución mayor. Para fines prácticos basta hacer notar que los recuentos de las muestras están por encima del estándar exigido. b) Recuento total El recuento total de esporas termófilas se hace a partir de las mismas cajas de Petri. El cálculo se hace en la misma forma que para las esporas del flat sour incluyendo todas las esporas visibles. 50

51 c) Termófilos anaerobios que no producen SH 2 Dividir 20 ml de la solución del azúcar en 6 porciones aproximadamente iguales y sembrarlas en 6 tubos de caldo hígado. Estratificar el medio con agar triptona. Solidificar el medio inmediatamente por inmersión parcial en agua fría. Cuando se ha solidificado el medio precalentar a 55 C e incubar a esta temperatura por 48 h. En estas condiciones se produce rotura del agar y formación de ácido. A veces se produce olor a queso. Es un método cualitativo con una aproximación cuantitativa lejana. Los resultados se expresan como + o -. Por ejemplo: d) Termófilos anaerobios que producen SH 2 Entre ellos predomina el Clostridium nigrificans. Se dividen otros 20 ml de la solución del azúcar en 6 porciones aproximadamente iguales y se las siembra en agar sulfito. Los tubos deben ser hervidos por 5 minutos antes de la siembra y enfriados a 55 C. Se incuban a esa temperatura durante h. El medio debe estar sólido antes de llevarlo a la estufa. Los microorganismos característicos se ponen de manifiesto por formación de áreas negras típicas. Se las cuenta en los 6 tubos y multiplica el dato por 2,5; expresando el resultado como nº de esporas de bacterias productoras de SH 2 en 10 g de azúcar. Normas aceptadas por la National Canners Association para usar en productos enlatados 1) Recuento total de esporas termófilas: De 5 muestras de un lote de azúcar ninguna debe tener más de 150 esporas en 10 g y el promedio de las muestras no debe ser superior a 125 esporas en 10g. 2) Esporas del flat sour : De 5 muestras ninguna debe tener más de 75 esporas en 10 g y el promedio para todas las muestras no debe ser superior a 50 esporas en 10 g. 3) Esporas termófilas anaerobias: No más de 3 de las 5 muestras contendrán de estas esporas (60%) y de cada muestra no deberá haber más de 4 tubos + de cada 6 (65 %). 4) Esporas de alteración sulfhídrica: No deberá haber más de 2 muestras + sobre las 5 muestras y cada muestra no deberá dar más de 5 colonias en 10 g (equivalente a 2 colonias por cada 6 tubos). 51

52 ANÁLISIS DEL AZÚCAR PARA BEBIDAS SIN ALCOHOL Teniendo en cuenta la flora más corriente en el azúcar industrial, The American Bottlers of Carbonated Beverages (1953) de USA estableció el siguiente procedimiento de análisis: 1) Preparación de las muestras: Colocar 100 g del azúcar en un erlenmeyer de 250 ml, que contenga 102,5 ml de agua destilada estéril. Se deja disolver el azúcar. 2) Metodología de análisis a) Bacterias mesófilas b) Levaduras y mohos a) Bacterias mesófilas Pipetear 2,1 ml de la solución en cada una de dos cajas de Petri. Se cubren y se mezcla el inóculo con aproximadamente ml de agar nutritivo. Se incuban las cajas durante 48 h a 30 C. Finalizado ese lapso el recuento combinado en ambas cajas representa el número de bacterias en aproximadamente 2,5 g del azúcar original. El resultado se expresa por 10 g de azúcar. b) Levaduras y mohos Se pipetean 2,1 ml de la solución de azúcar antes preparada en cada una de 4 cajas de Petri. Se cubren mezclando con ml de agar para recuento de mohos ajustado a ph 4,5-4,8 con ácido láctico 10 % justo antes de su uso. Se incuban las cajas a 30 C durante 2 a 3 días. Al final de ese lapso el recuento combinado de colonias desarrolladas en la placa representa el número de levaduras y mohos en aproximadamente 5 g de azúcar original. Se expresan los resultados por 10 g de azúcar. Normas aceptadas por The American Bottlers of Carbonated Beverages. 1) Bacterias mesófilas /10g 2) Levaduras /10g 3) Mohos /10g 52

53 ANALISIS DE CARNES Y PRODUCTOS CARNICOS 1) Preparación de la muestra y diluciones (APHA 1992) Se pesan 10 g de la muestra, mezclada asépticamente, en una mezcladora esterilizada y se añaden 90 ml de agua peptona 0,1%. Se agita a la velocidad rpm durante 2,5 minutos como máximo. Se mezcla el alimento homogeneizado, agitándolo; se toma 1 ml con una pipeta y se vierte en un tubo que contenga 9 ml de agua peptona 0,1%. Homogeneizar cuidadosamente. Las diluciones sucesivas se preparan transfiriendo 1 ml a tubos conteniendo 9 ml de agua de dilución estéril. 2) Metodología de análisis a) Recuento de bacterias aerobias mesófilas b) Recuento de bacterias psicrotróficas c) Recuento de Enterobacteriaceae d) Recuento de coliformes totales e) Determinación de coliformes totales, coliformes a 45 C y Escherichia coli f) Determinación de Escherichia coli g) Determinación de Salmonella h) Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva i) Recuento de anaerobios sulfito reductores j) Recuento de Bacillus cereus k) Recuento de enterococos l) Recuento de hongos y levaduras m) Determinación de Listeria monocytogenes n) Determinación de Escherichia coli O157:H7 a) Recuento de bacterias aerobias mesófilas (ICMSF 1983) 1- Se vierte 1 ml de cada dilución por duplicado en placas de Petri y se agrega el agar para recuento (APC) fundido y mantenido a aprox ºC. Se mezcla para lograr una distribución homogénea. Siguiendo las mismas indicaciones, sembrar tres diluciones sucesivas. 2- Cuando las placas estén frías se invierten y se incuban a 35+ 1ºC durante 48 h. 3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en el capítulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se multiplica el número promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilución correspondiente y se informa como UFC de bacterias aerobias mesófilas/g de muestra. b) Recuento de bacterias psicrotróficas (APHA 1992) Aplicar el mismo procedimiento que en a) con las diluciones correspondientes. Incubar a 7+1 C por 10 días ó 16 h a 17+ 1ºC seguido de 3 días a 7+1ºC. c) Recuento de Enterobacteriaceae Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri y volcar sobre ellas agar Bilis Rojo Violeta Glucosa (ABRV-G), fundido y mantenido a 44-46ºC. Homogeneizar rotando la placa. Confeccionar una sobrecapa de aproximadamente 10 ml del mismo medio fundido, mantenido a C. Dejar solidificar. Incubar las placas en posición invertida a C durante 21+3 h. Observar las colonias. Se consideran presuntas 53

54 unidades formadoras de colonias de enterobacterias las colonias de color púrpura con halo de precipitación. Confirmación de colonias típicas. Características morfológicas y pruebas bioquímicas. - Transferir una colonia típica de cada una de las placas a tubos de caldo glucosa y agar nutritivo. Incubar a C durante 21+3 h. - A partir del cultivo, realizar tinción de Gram. Observar al microscopio. - A partir del agar inclinado realizar la prueba de la oxidasa. - Observar la fermentación de glucosa por viraje del indicador ácido base. Las colonias presuntivas que resulten bacilo-cocos Gram negativos no esporulados, oxidasa negativas y fermentadoras de glucosa confirman la presencia de Enterobacteriaceae. d) Recuento de coliformes totales (APHA 1992) Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri. Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV lactosa fundido a aprox ºC. Mezclar. Dejar solidificar completamente y agregar entonces 4 ml más de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las placas invertidas a 30ºC por h. Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas oscuras con diámetro de por lo menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes. Confirmación: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto). Incubar a 30ºC por h. Se consideran positivas aquellas colonias que den producción de gas. El resultado se calcula en base al número de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de coliformes totales /ml ó g. e) Enumeración de coliformes totales, coliformes a 45 C y Escherichia coli (FAO 1992) e.1) Enumeración de coliformes totales Prueba presuntiva Inocular por triplicado 1 ml de diluciones sucesivas de la muestra en tubos de fermentación con caldo Lauril Sulfato. Incubar a 35ºC por 48 h. Se consideran positivos aquellos tubos que presenten formación de gas en la campanita de Durham. Confirmación de coliformes totales Transferir una ansada de los tubos positivos del ensayo anterior a tubos con Caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar 24 h a 35ºC. Considerar positivos los tubos con producción de gas. Calcular el NMP de coliformes totales/g. e.2) Confirmación de coliformes a 45 C A partir de los tubos positivos de Caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares en e.1) inocular un tubo de fermentación de caldo EC. Incubar 24 hs a 45,5+0,2 C. La producción de gas en la campanita de Durham confirma coliformes a 45 C. En caso negativo reexaminar a las 48 h. Registrar el número de tubos positivos de cada dilución. Calcular el NMP de coliformes a 45 C/g de muestra. 54

55 e.3) Confirmación de Escherichia coli Estriar una ansada de los tubos positivos de EC en e.2) en una placa de EMB. Incubar h a 35ºC. Transferir colonias típicas a AN y efectuar ensayos de confirmación (IMViC y producción de gas de lactosa) o set de pruebas múltiples. Calcular el NMP de Escherichia coli/g de muestra en base a los tubos de EC confirmados. f) Determinación de Escherichia coli en 0,1 g (Mossel 1985) Inocular 1 ml de la dilución 1/10 en 10 ml de caldo triptona peptona de soja (CTS). Incubar a 20-25ºC por 5-6 h. Agitar bien y volcar en un tubo que contenga 10 ml de caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares doble concentrado (con campanita de Durham). Incubar a 30ºC ± 1 C durante h. Los tubos en los que no se verifique formación de gas se consideran negativos. En este caso se informa ausencia de E. coli. Agitar bien el contenido de los tubos positivos, resembrar por estría en agar Mac Conkey. Incubar a 44ºC±0,1 C (preferentemente en baño de agua) durante 30 h. Si existiese crecimiento típico (colonias rojas), tomar colonias aisladas y realizarles: 1- Gram 2- Siembra en tubo de fermentación caldo verde brillante 2% sales biliares con lactosa. Incubar a 44 C por 48 horas. 3- Siembra en caldo triptona. Incubar a 44 C por 48 horas. 4- Siembra en agar citrato. Incubar a 30 C por 48 horas. Resultados característicos: 1- Coco bacilo Gram negativo no formador de esporas. 2- Fermentación de lactosa a 44 C con formación de gas. 3- Producción de indol a 44 C. 4- No utiliza citrato. Alternativamente se pueden utilizar las pruebas del IMViC para la identificación. De ser posible ensayar el cultivo sospechoso con un sistema de pruebas múltiples (API, MICRO-ID, o semejantes). En caso de confirmarse, informar presencia de E. coli en 1 ml de muestra. Indicar las pruebas de identificación realizadas. g) Determinación de Salmonella (ISO 6579: 1993) Pre-enriquecimiento en medio líquido Pesar asépticamente 10 g de muestra en un erlenmeyer con 225 ml de agua peptona tamponada. Agitar para homogeneizar. Incubar a 37ºC durante h. Enriquecimiento en medio líquido. Transferir 0,1 ml del preenriquecimiento a 10 ml de caldo Rappaport-Vassiliadis (RV). Incubar a 42,5-43,5ºC durante h. Transferir 1 ml del preenriquecimiento a 10 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 36-38ºC durante h. 55

56 Aislamiento en medio sólido A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo Fenol (agar BPLS) y una de agar MLCB (manitol-lisina-cristal violeta-verde brillante). Incubar las placas invertidas a 36-38ºC durante h. De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento h más y volver a estriar en los medios de aislamiento. Si al cabo del período de incubación el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por h adicionales a la misma temperatura. Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella. En agar BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar MLCB, las colonias típicas son violetas y, a veces, con centro negro. Identificación y confirmación De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 36-38ºC durante h. Al cabo de la incubación, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmación bioquímica y serológica. Sobre el cultivo puro realizar: - tinción de Gram - oxidasa Inocular los cultivos que resulten coco-bacilos Gram negativos y oxidasa negativos en los siguientes medios. - TSI: en superficie y en profundidad - Medio LIA - Medio para ureasa (puede ser BAM) Salmonella es lisina decarboxilasa +, ureasa +, lactosa - (la gran mayoría de las cepas), sacarosa - (la gran mayoría de las cepas). De ser necesario, pueden realizarse las pruebas del indol (la mayoría de las cepas son -), la prueba de Voges Proskauer (-), citrato de Simmons (la mayoría de las cepas son +), etc. De ser posible confirmar el resultado con un test de pruebas múltiples. Confirmación serológica Seguir la técnica explicada en TP Nº 2: Enterobacterias-Salmonella Emplear una cepa patrón de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios empleados en las pruebas de confirmación e identificación. Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el análisis. Aclarar modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas. h) Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva (APHA 1992) Siembra y aislamiento en medio sólido Repartir 1 ml de la dilución adecuada entre 3-4 placas de agar Baird Parker. Realizar un recuento combinado. Distribuir el inóculo con espátula de Drigalsky para obtener colonias aisladas. Incubar a 35ºC durante 48 h. Considerar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Seleccionar un número representativo de colonias sospechosas y transferirlas a tubos de caldo infusión-cerebrocorazón (BHI). Incubar a 35ºC por 24 h. 56

57 El volumen y las diluciones empleadas dependen de la contaminación que se espere en la muestra. Recordar que no se recomienda sembrar más de 0,2 o 0,25 ml por placa. También puede realizarse un recuento por duplicado sembrando 0,1 ml por placa. Identificación y confirmación Sobre los cultivos puros de 24 h realizar: - Tinción de Gram - Catalasa - Coagulasa - Termonucleasa (en la misma placa de Baird - Parker) Sembrar en paralelo una cepa patrón para comparar con un positivo. Para realizar los cálculos tener en cuenta las diluciones y las alícuotas sembradas. Aclarar las modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas. Informar UFC de S. aureus coagulasa positiva / g de muestra. i) Recuento de anaerobios sulfito reductores (Mossel 1982 mod) Se siembran 2 tubos con agar TSC, fundido deaireado y mantenido a 44-45ºC con dos diluciones consecutivas (1/10 y 1/100 preferentemente). Al sembrar, tener la precaución de introducir la pipeta hasta el fondo del tubo. Comenzar a eliminar el volumen de homogenato o dilución indicado, a medida que se va retirando la pipeta y describiendo círculos para homogeneizar. Los tubos preparados se incuban a C por h. Se cuentan las colonias negras por tubo (de ser posible se cuentan tubos que tengan entre colonias) Se expresa el número de UFC de anaerobios sulfito reductores por gramo de muestra de acuerdo al factor de dilución utilizado. j) Determinación de Bacillus cereus (APHA 1992) Medio de cultivo: agar manitol-yema de huevo-polimixina (MYP). Sembrar en superficie 0,1 ml de dos diluciones por duplicado con un rastrillo para cada dilución. Después de sembrar dejar secar e incubar por 20 ó 24 h a 30 C+ 2 o C. Transferir un número representativo de colonias típicas a agar nutritivo. Incubar h a 37ºC. En estos cultivos puros ensayar: - Gram - catalasa - tinción de esporas - fermentación de glucosa (en caldo rojo fenol en anaerobiosis) - caldo nitrato - caldo Voges-Proskauer modificado Calcular el número de colonias de B. cereus teniendo en cuenta las diluciones empleadas y las colonias confirmadas. Informar como UFC de B. cereus/g. k) Recuento de enterococos (APHA 1976) Colocar 1ml de dos diluciones sucesivas en placas de Petri por duplicado. Volcar sobre las mismas 10 a 15 ml de Agar KF con TTC. Incubar 48 h a 35+1ºC. Contar todas las colonias rojas y/o rosas. Confirmar entre 5 y 10 colonias transfiriendo a Caldo BHI e incubando 24 h a 35ºC. Realizar Gram, catalasa, crecimiento en Agar Bilis Esculina, crecimiento en BHI NaCl 6,5% y en BHI a 45ºC. Informar UFC de enterococos/g. 57

58 l) Recuento de mohos y levaduras (ISO 13681: 1995) Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas de la muestra en placas de Petri. Agregar agar glucosa-extracto de levadura con oxitetraciclina y gentamicina fundido a 44-46ºC y mezclar para homogeneizar el inóculo en el agar. Dejar solidificar. Incubar sin invertir entre 20 y 25 ºC durante 5 días. Contar las placas que tengan menos de 150 colonias. Informar el resultado como UFC de mohos y levaduras /g de muestra. m) Determinación de Listeria monocytogenes (USDA, FSIS. Laboratory Communication Nº57, revised 1989) m.1) Enriquecimiento Enriquecimiento primario: Colocar 25 ml (o g) de muestra en 225 ml de caldo UVM. Homogeneizar durante 2 minutos. Incubar por 20 a 24 horas a 30 C. Enriquecimiento secundario: Transferir 0,1 ml del cultivo anterior a un tubo con 10 ml de caldo Fraser. Incubar horas a 35 C. Comparar la coloración de los tubos incubados con uno sin sembrar. Observar tubos oscurecidos o ennegrecidos por la hidrólisis de esculina. Si el tubo no muestra oscurecimiento se informa como "Ausencia de L. monocytogenes en 25 g". En caso de muestras sospechosas de haber causado enfermedad, debe continuarse el análisis estriando en agar de aislamiento y reincubando el caldo Fraser por otras 24 horas para realizar otro aislamiento. m.2) Aislamiento en medio sólido A partir de los tubos oscurecidos estriar placas de agar MOX (*). Incubar horas a 35 C. Las colonias típicas están rodeadas de una zona negra por hidrólisis de la esculina. Complementariamente pueden emplearse otros medios de aislamiento: - Agar MMA (Mc Bride Modificado): se incuba en condiciones anaeróbicas a 35 C por horas. Las colonias típicas aparecen azul-gris o gris verdoso observadas con iluminación de Henry con luz incidente a Agar PALCAM: se incuba a 35 C por horas. Las colonias típicas son de color gris verdoso con halo negro-parduzco (por hidrólisis de la esculina), sobre fondo rojo (porque no fermenta manitol). - Agar Oxford: se incuba por horas a 35 C. Las colonias típicas están rodeadas de una zona negra por hidrólisis de la esculina. (*) En el caso del agar MOX utilizar hisopo estéril para sembrar la mitad de la placa y estriar la otra mitad en ángulo recto. m.3) Selección de colonias y reestriado en agar de hemólisis Picar sucesivamente 5 colonias sospechosas de agar MOX. Estriar este inóculo en una placa de agar base sangre con sobrecapa del mismo agar con 0,4% de sangre de caballo (las placas deben ser finas para visualizar bien la hemólisis). Incubar durante la noche a 35 C. Las placas se examinan con luz fluorescente. Sostener la placa en ángulo recto a la luz fluorescente. 58

59 Seleccionar colonias típicas de Listeria monocytogenes: colonias translúcidas de 1 a 2 mm de diámetro con una delgada zona de β-hemólisis alrededor de la colonia y completo aclaramiento del medio por debajo. Las colonias características bien aisladas se pican y se transfieren a un tubo de caldo BHI y a un tubo de agar para movilidad (alternativamente puede emplearse agar SIM) por punción con ansa recta. Incubar durante la noche a C. Sobre los cultivos ensayar: - Tinción de Gram - Catalasa - Movilidad típica: En agar, observar línea de siembra difusa con forma típica de sombrilla invertida. Del caldo: por la gota pendiente o en fresco. Si se trata de una cepa bien aislada y pura, bacilo corto Gram positivo no formador de esporas, catalasa (+), de movilidad característica y hemolítica; se procede a la identificación. m.4) Identificación A partir de cultivos puros, realizar pruebas para diferenciar L. monocytogenes de las otras especies hemolíticas - Camp Test - Fermentación de ramnosa - Fermentación de xilosa Camp Test Se realiza sobre una placa de agar sangre. Se inocula en forma de fina estría un cultivo fresco de Staphylococcus aureus y otra línea paralela de un cultivo fresco de Rhodococcus equi. En forma transversal se estrían, también como finas líneas y sin llegar a atravesar las estrías ya hechas, cepas de Listeria monocytogenes, L. seeligeri, L. ivanovii (las tres hemolíticas) y L. innocua (no hemolítica). Una reacción Camp positiva se observa por aumento de la hemólisis en la zona cercana a S. aureus o R. equi. Resultados característicos: Especies Camp Test Xilosa Ramnosa S. aureus R. equi L. monocytogenes L. seeligeri L. ivanovii -/ Se pueden realizar las siguientes pruebas complementarias (reacción característica de Listeria spp.): - Hidrólisis de esculina (+) - Utilización de glucosa: medio O/F (+) - Fermentación de manitol (-) - Reducción de nitrato (-) - Rojo de Metilo- Voges Proskauer (+/+) - Oxidasa (+) 59

60 n) Determinación de E. coli 0157:H7 (USDA, FSIS. Laboratory Communication #38, revisión 4) n.1) Enriquecimiento Pesar 65 g en 225 ml de caldo EC modificado con novobiocina. Agitar para homogeneizar. Incubar a 35 C por horas. Incluir por lo menos un control positivo por cada grupo de muestras ensayadas. El inóculo debe ser de aproximadamente UFC por el volumen total de enriquecimiento. Se registrarán todas las reacciones observadas en el control. n.2) Test de screening Se emplean dispositivos comerciales de ensayos rápidos para demostrar la presencia de cepas con antígeno O157 en el caldo de enriquecimiento n.1). Para las muestras negativas se informa ausencia de Escherichia coli O157:H7 en 25 gramos. Las muestras positivas se continúan analizando. n.3) Aislamiento en medios sólidos El caldo de enriquecimiento positivo en n.2) se diluye con diluyente fosfatado Butterfield s. Se inoculan placas de agar MSA-BCIG con 0,1 ml de diluciones 10-4, 10-5, 10-6 y Distribuir homogéneamente con espátula de vidrio. Incubar a 42 C durante la noche. Las colonias características de Escherichia coli O157:H7 son blancas (sorbitol negativas) y no son fluorescentes (β-glucuronidasa negativas). Preparar un juego de PRS-MUG y EMB para cada muestra sospechosa. Dibujar sobre el vidrio, en la parte de atrás de la placa, una grilla de 12 secciones y numerarlas. Tomar aproximadamente 12 colonias sospechosas y estriar en la zona central de la sección de EMB y hacer una punción en la zona correspondiente de PRS-MUG. Incubar las placas a 35 C durante la noche Colonias típicas: Examinar los pares de placas. Se continúan analizando solamente aquellos aislados que den colonias características en ambos medios. Las colonias características de Escherichia coli O157:H7 resultan: Agar PRS-MUG: colonias sin cambio de color (color amarillo significa que fermentó sorbitol) y sin fluorescencia a la luz UV (β-glucuronidasa negativas). Agar EMB: colonias oscuras con o sin brillo metálico. n.4) Confirmación serológica de antígeno O157. Las colonias que resultan sospechosas se ensayan para detectar el antígeno O157. Se estudian las colonias que crecieron en PRS-MUG. Se continúa la identificación para los aislados O157 positivos. n.5) Confirmación Se realizan las siguientes pruebas (reacción característica de Escherichia coli O157: H7): - TSI (amarillo/amarillo, H 2 S negativo) - Fermentación de sorbitol (negativo) - Fermentación de celobiosa (negativo) - Caldo triptona (indol positivo) - Medio RM-VP (RM: positivo; VP: negativo) - Citrato de Simmons (negativo) 60

61 - Lisina decarboxilasa (positivo) * - Ornitina decarboxilasa (positivo)* - Medio decarboxilasa base (negativo) - Medio movilidad (+/-) Todos los medios se incuban a 35 C. Los azúcares deben leerse a las 24 horas. *Los caldos decarboxilasa deben llevar un sello de vaselina. Los positivos son púrpura (medio básico por decarboxilación) y el negativo es amarillo (por acidificación por fermentación de la glucosa del medio). n.6) Serología de antígeno H7 Sobre los aislados que hayan dado reacciones típicas de Escherichia coli O157: H7, realizar una prueba de aglutinación para H7. 61

62 REQUISITOS MICROBIOLÓGICOS DEL CÓDIGO ALIMENTARIO ARGENTINO -MERCOSUR- ANEXO I Texto de los artículos 156 tris, 255 y 302 del Código Alimentario Argentino (según la modificación/ inclusión por la Resolución Conjunta SPyRS/ SAGPyA Nº 79/04 y 500/04). Art 156 tris: Los productos preparados a base de carne picada, tales como chacinados frescos embutidos o no embutidos, y otras preparaciones a base de carne picada (albóndigas, empanadas, pasteles, arrollados o similares) precocidas o no, una vez cocidos y listos para consumir, ya sea que se dispensen inmediatamente después de finalizada la cocción, en el establecimiento elaborador o sean enviados a domicilio, deberán responder a las siguientes especificaciones microbiológicas: Criterio complementario Determinación Resultados Método de Análisis Recuento de aerobios mesófilos/g Recuento de coliformes/g n=5 c=2 m=10 4 M=10 5 n=5 c=2 m=100 M=500 ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol I-Técnicas de análisis microbiológicos-parte II- Enumeración de microorganismos aerobios mesófilos- Métodos de Recuento en Placa ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol I-Técnicas de análisis microbiológicos-parte II- Bacterias coliformes E. coli/g Ausencia/g ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol I-Técnicas de análisis microbiológicos-parte II- Bacterias coliformes Recuento de S. aureus coagulasa +/g n=5 c=1 m<100 M=500 ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol I-Técnicas de análisis microbiológicos-parte II- S. aureus- Recuento de estafilococos coagulasa positiva 62

63 Criterio obligatorio Determinación Resultados Método de Análisis E. coli O157: H7/NM n=5 c=0 Ausencia/65 g USDA-FSIS Guía de Laboratorio de Microbiología-capítulo 5 Detección, aislamiento e identificación de E. coli O157:H7/NM en productos cárnicos o equivalente Salmonella spp. n=5 c=0 Ausencia/25 g Manual de Bacteriología Analítica de FDA (BAM) Capítulo 5 Salmonella o equivalente Podrán investigarse otros microorganismos cuando las circunstancias lo hicieran necesario. Art. 255: Con la designación de carne triturada o picada, se entiende la carne apta para consumo dividida finamente por procedimientos mecánicos y sin aditivo alguno. Debe prepararse en presencia del interesado salvo en aquellos casos en los que por la naturaleza del establecimiento o volumen de las operaciones sean autorizados expresamente por la autoridad competente. La carne picada fresca deberá responder a las siguientes especificaciones microbiológicas: Criterio complementario Determinación Resultados Método de Análisis Recuento de aerobios mesófilos/g n=5 c=3 m=10 6 M=10 7 ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol I-Técnicas de análisis microbiológicos-parte II- Enumeración de microorganismos aerobios mesófilos-métodos de Recuento en Placa Recuento de E. coli/g n=5 c=2 m=100 M=500 ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol I-Técnicas de análisis microbiológicos-parte II- Bacterias coliformes Recuento de S. aureus coagulasa +/g n=5 c=2 m=100 M=1000 ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol I-Técnicas de análisis microbiológicos-parte II- S. aureus-recuento de estafilococos coagulasa positiva 63

64 Criterio obligatorio Determinación Resultados Método de Análisis E. coli O157: H7/NM n=5 c=0 Ausencia/65 g USDA-FSIS Guía de Laboratorio de Microbiología-capítulo 5 Detección, aislamiento e identificación de E. coli O157:H7/NM en productos cárnicos o equivalente Salmonella spp. n=5 c=0 Ausencia/10 g Manual de Bacteriología Analítica de FDA (BAM) Capítulo 5 Salmonella o equivalente Podrán investigarse otros microorganismos cuando las circunstancias lo hicieran necesario. Art. 302: Se entiende por chacinados, los productos preparados sobre la base de carne y/o sangre, vísceras u otros subproductos animales que hayan sido autorizados para el consumo humano, adicionados o no con substancias aprobadas a tal fin. Los chacinados frescos deberán responder a las siguientes especificaciones microbiológicas: Criterio complementario Determinación Resultados Método de Análisis Recuento de aerobios mesófilos/g Recuento de E. coli/g Recuento de S. aureus coagulasa +/g n=5 c=3 m=10 6 M=10 7 n=5 c=2 m=100 M=500 n=5 c=2 m=100 M=1000 ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos-Vol I-Técnicas de análisis microbiológicos-parte II-Enumeración de microorganismos aerobios mesófilos-métodos de Recuento en Placa ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos- Vol I-Técnicas de análisis microbiológicos-parte II- Bacterias coliformes ICMSF o equivalente Microorganismos de los Alimentos- Vol I- Técnicas de análisis microbiológicos-parte II- S. aureus- Recuento de estafilococos coagulasa positiva 64

65 Criterio obligatorio Determinación Resultados Método de Análisis E. coli O157: H7/NM n=5 c=0 Ausencia/65 g USDA-FSIS Guía de Laboratorio de Microbiología- capítulo 5 Detección, aislamiento e identificación de E. coli O157:H7/NM en productos cárnicos o equivalente Salmonella spp. n=5 c=0 Ausencia/10 g Manual de Bacteriología Analítica de FDA (BAM) Capítulo 5 Salmonella o equivalente Podrán investigarse otros microorganismos cuando las circunstancias lo hicieran necesario 65

66 SE.NA.SA (Decreto 42.38/68) PRODUCTOS DE LA PESCA MATERIAS PRIMAS Pescados, moluscos no valvados, y crustáceos crudos Moluscos valvados Crustáceos escaldados Vacuna Porcina Tripas naturales AEROBIOS MESOFILOS col/g col/ g col/ g col/g col/g col/ g ENTEROBACTERIAS 200 col/g 500 col/ g 200 col/g 500 col/ g 1000 col/ g col/g COLIFORMES 100 col/ g 200 col/ g 100 col/g 300 col/ g 500 col/ g 5000 col /g ESTREPTOCOCOS GRUPO D 100 col/ g 100 col/g 100 col/g No considerar No considerar 5000 col /g CLOSTRIDIOS SULFITOREDUCTORES 20 col/ g 20 col/g 20 col/g 20 col/g 20 col/g 100 col/g Bacillus cereus No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar LACTOBACILOS No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar FLORA MICOTICA TOTAL 600 col /g 200 col/g 200 col/g 1100 col/ g 1100 col/g 1100 col/g LEVADURAS 500 col/g 100 col/g 100 col/g 1000 col/ g 1000 col/ g 1000 col/ g Escherichia coli Ausente en 0,1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Salmonella sp. Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Staphylococcus aureus COAGULASA + < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g 66

67 SE.NA.SA (Decreto 42.38/68) Embutidos frescos Chorizos, salchichas y longanizas parrilleras. Embutidos secos Salame, salamín, longaniza, chorizos españoles, etc. Salazones secas Bondiola, jamón crudo, panceta, pastrón, etc. Salazones húmedas Jamón, paleta, lomo de cerdo cocido. Chacinados cocidos Salchicha tipo Viena, salchichón, mortadela, morcilla, matambre, etc. Subproductos comestibles Extracto de carne, gelatina. AEROBIOS MESOFILOS col/ g No considerar* col/ g col/ g col/ g col/ g ENTEROBACTERIAS col/ g col/ g 200 col/ g 200 col/ g 200 col/ g 100 col/ g COLIFORMES col/ g col/ g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g ESTREPTOCOCOS GRUPO D col/ g col /g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g CLOSTRIDIOS SULFITOREDUCTORES 100 col/ g 50 col/ g 20 col/ g 20 col/ g 20 col/ g 20 col/ g Bacillus cereus No considerar 400 col/ g 400 col/ g 400 col/ g 400 col/ g 400 col/ g LACTOBACILOS No considerar Sin límite Sin límite No considerar No considerar No considerar FLORA MICOTICA TOTAL col/ g No considerar col/ g col/ g 200 col/ g 200 col/ g LEVADURAS col/ g Sin límite col/ g col/ g 100 col/ g 100 col/ g Escherichia coli Ausente en 0,1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Salmonella sp. Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Staphylococcus aureus COAGULASA + < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g *Debe predominar la flora de maduración 67

68 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS DESHIDRATADOS 1) Preparación de la muestra y diluciones Pesar asépticamente 10 g del alimento en un Erlenmeyer con 90 ml de agua peptona 0,1% estéril y homogeneizar bien. Tomar con pipeta estéril 1 ml de esta primera dilución y pasar a un tubo con 9 ml de agua peptona 0,1% para obtener la dilución 1/100. De ser necesarias más diluciones, realizarlas en tubos conteniendo 9 ml de agua peptona 0,1%. 2) Metodología de análisis a) Recuento de bacterias aerobias mesófilas b) Recuento de coliformes totales c) Recuento de Clostridium perfringens d) Determinación de Salmonella e) Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva f) Determinación de Bacillus cereus a) Recuento de bacterias aerobias mesófilas. 1- Se vierte 1 ml de cada dilución por duplicado en placas de Petri y se agrega el agar para recuento (APC) fundido y mantenido a aprox ºC. Se mezcla para lograr una distribución homogénea. 2- Cuando las placas estén frías se invierten y se incuban a 37 ºC durante 48 h. 3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en el capítulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se multiplica el número promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilución correspondiente y se informa como UFC de bacterias aerobias mesófilas/ g de muestra. b) Recuento de coliformes totales b.1) Medio líquido Medio de cultivo: caldo verde brillante 2% de sales biliares o caldo Mc Conkey. Como trabajo de rutina se usan 2 tubos por cada dilución. Si fuera necesaria más precisión, realizar el NMP usando series de 5 tubos. Sembrar: 2 tubos con 10 ml de la dilución 1/10 (1g) en caldo doble concentración. 2 tubos con 1 ml de la dilución 1/100 (0,1g) en caldo simple concentrado. 2 tubos con 1 ml de la dilución 1/100 (0,01g) en caldo simple concentrado. Incubar a 37 C por 48 h. Confirmación: estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB. Incubar a 37ºC 24 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/ rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metálico. Registrar el número de tubos positivos y calcular el número de bacterias coliformes por gramo de producto empleando las tablas de NMP. b.2) Recuento en placa Medio de cultivo: Agar Bilis Rojo Violeta-Lactosa (ABRV-L). Sembrar dos placas de la dilución 1/10 y dos placas de la dilución 1/100 agregando una sobrecapa del agar al medio solidificado. Incubar 24 h a 35 C. Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas oscuras con diámetro de por lo menos 0,5 mm, características de bacterias coliformes. 68

69 Confirmación: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentación con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30ºC por h. Se consideran positivas aquellas colonias que den producción de gas. El resultado se expresa como UFC de coliformes totales/g. c) Recuento de Clostridium perfringens Siembra y aislamiento Sembrar 1 ml de la dilución 1/10 en el fondo de dos bolsitas plásticas. Volcar a través del cuello de cada una 30 ml de agar TSN. Homogeneizar bien el inóculo rotando la bolsita mientras se mantiene presionado el cuello. Dejar solidificar el agar en un separador. Incubar a 37 C por 24 h. Se puede sembrar en placas de Petri e incubar en anaerobiosis. También puede realizarse por NMP en forma similar al recuento de anaerobios sulfito reductores realizado en el análisis de carnes y productos cárnicos. Identificación y confirmación Pasar un número representativo de colonias sulfito reductoras a tubos con 10 ml de caldo tioglicolato. Incubar 24 h a 37 C observando si hay crecimiento vigoroso entre 4 y 6 horas con producción de abundante gas. A partir de tubos con buen crecimiento realizar: - Tinción de Gram - Licuación de la gelatina en tubos con discos de gelatina-carbón. Sembrar 0,2 ml en el fondo de los tubos conteniendo el medio previamente deaireado. Incubar a 37 C por 18 h. - Movilidad y reducción de nitrato en agar semisólido Nitrato-Movilidad-Buffereado. Sembrar por punción e incubar por 24 h a 37 C. - Fermentación de la lactosa en medio para fermentación de azúcares. Sembrar 0,2 ml en el fondo de tubos previamente deaireados. Incubar a 37 C por 24 h. Informar como UFC/g de muestra o NMP/g de muestra de acuerdo a la técnica empleada. Tener en cuenta para los cálculos las diluciones empleadas y el número de colonias confirmadas. d) Determinación de Salmonella Pre-enriquecimiento en medio líquido Pesar asépticamente 25g de muestra en un erlenmeyer con 225 ml de agua peptonada tamponada. Agitar para homogeneizar. Incubar a 37ºC durante h. Enriquecimiento en medio líquido. Transferir 1 ml de caldo de pre-enriquecimiento a 10 ml de caldo tetrationato (Müller Kauffmann). Incubar a 42,5-43,5ºC durante h. Transferir 1 ml de caldo de pre-enriquecimiento a 10 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 36-38ºC durante h. Aislamiento en medio sólido A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Xilosa-Lisina- Desoxicolato (agar XLD) y una de agar Bismuto Sulfito. Incubar las placas invertidas a 36-38ºC durante h. De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento h más y volver a estriar en los medios de aislamiento. Si al cabo del período de incubación el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por h adicionales a la misma temperatura. 69

70 Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella. En agar XLD, las colonias son rojas y con centro negro en la mayoría de los casos. En agar Bismuto sulfito las colonias son marrones a negras con brillo metálico. Identificación y confirmación De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 36-38ºC durante h. Al cabo de la incubación, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmación bioquímica y serológica. Sobre el cultivo puro realizar - tinción de Gram - oxidasa Inocular los cultivos que resulten coco-bacilos Gram negativos y oxidasa negativos en los siguientes medios: - TSI: en superficie y en profundidad - Medio LIA - Medio para ureasa (puede ser BAM) Salmonella es lisina decarboxilasa +, ureasa +, lactosa - (la gran mayoría de las cepas), sacarosa - (la gran mayoría de las cepas). De ser necesario, pueden realizarse las pruebas del indol (la mayoría de las cepas son -), la prueba de Voges Proskauer (-), crecimiento en caldo KCN (no crece), etc. De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas múltiples. Confirmación serológica Seguir la técnica explicada en TP Nº 2: Enterobacterias-Salmonella Emplear una cepa patrón de Salmonella para chequear los medios de cultivo y los medios empleados en las pruebas de confirmación e identificación. Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el análisis. Aclarar modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas. e) Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva Siembra y aislamiento en medio sólido Transferir 0,1 ml de la dilución adecuada a una placa de agar Baird Parker. Realizar un duplicado. Distribuir el inóculo con espátula de Drigalsky para obtener colonias aisladas. Incubar a 35ºC durante h. Considerar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Seleccionar un número representativo de colonias sospechosas y transferirlas a tubos de caldo infusión-cerebrocorazón (BHI). Incubar a 35ºC por 24 h. El volumen y las diluciones empleadas dependen de la contaminación que se espere en la muestra. Incluso puede realizarse un recuento combinado sembrando un volumen mayor y repartido en varias placas. Recordar que no se recomienda sembrar más de 0,2 ó 0,25 ml por placa. 70

71 Identificación y confirmación Sobre los cultivos puros de 24 h realizar: - Tinción de Gram - Catalasa - Coagulasa - Termonucleasa (en la misma placa de Baird-Parker) Sembrar en paralelo una cepa patrón para comparar con un positivo. Para realizar los cálculos tener en cuenta las diluciones y las alícuotas sembradas. Aclarar las modificaciones y pruebas bioquímicas realizadas. Informar UFC de S. aureus coagulasa positiva/g de muestra f) Determinación de Bacillus cereus (APHA 1992) Medio de cultivo: agar manitol-yema de huevo-polimixina (MYP). Sembrar en superficie 0,1 ml de dos diluciones por duplicado con un rastrillo para cada dilución. Después de sembrar dejar secar e incubar por 20 o 24 h a 30 C+ 2 o C. Transferir un número representativo de colonias típicas a agar nutritivo. Incubar h a 37ºC. En estos cultivos puros ensayar: - Gram - catalasa - tinción de esporas - fermentación de glucosa (en caldo rojo fenol en anaerobiosis) - caldo nitrato - caldo Voges-Proskauer modificado Calcular el número de colonias de B. cereus teniendo en cuenta las diluciones empleadas y las colonias confirmadas. Informar como UFC de B. cereus /g de muestra. 71

72 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA 1) Toma de muestra y preparación de las diluciones Utilizar frascos estériles de capacidad adecuada para la cantidad de agua necesaria para realizar los análisis. Si se supone la presencia de cloro o cloraminas en el agua, agregar 100 mg de tiosulfato de sodio por litro de muestra en los frascos antes de su esterilización. Si pudieran hallarse presentes metales pesados proceder de igual forma empleando 572 mg de EDTA por litro de muestra. Realizar diluciones decimales sucesivas empleando como diluyente agua peptona 0,1% (9060. St. Meth. 18th Ed. 1992). 2) Metodología de análisis a) Recuento total de bacterias aerobias mesófilas b) Recuento de coliformes totales c) Determinación de coliformes totales por el método de filtración por membrana d) Determinación de E. coli por el método de filtración por membrana e) Determinación de Estreptococos fecales f) Determinación de P. aeruginosa g) Determinación de anaerobios esporulados sulfito reductores a) Recuento total de bacterias aerobias mesófilas Sembrar en Agar para Recuento en Placa (APC). En la mayoría de las aguas potables los recuentos adecuados se logran sembrando 1 y 0,1 ml del agua tal cual y 1 y 0,1ml de la dilución 1/100. Realizar como mínimo dos placas por dilución de diluciones sucesivas. Incubar a 37 o C por 24hs. Informar UFC de aerobios mesófilos/ml (9215. St. Meth. 18th. Ed. 1992). b) Recuento de coliformes totales A) Ensayo presuntivo A 1 - Determinación de coliformes totales por la técnica de fermentación en tubos múltiples (NMP) Se inoculan series de 5 tubos de por lo menos 3 diluciones decimales sucesivas (generalmente 10, 1 y 0,1 ml). Si el inóculo es igual o mayor a 10 ml se utiliza el medio de concentración adecuada para no diluir los nutrientes. Se incuban h a 35 o C. A 2 - Determinación de coliformes totales por ensayo de Ausencia-Presencia Sembrar la cantidad adecuada de agua en frascos con igual volumen de Caldo Lauril Sulfato de doble concentración. Incubar h a 35ºC. Producción de gas y/o ácido y/o crecimiento abundante se confirman como en (1). Se informa ausencia o presencia de coliformes totales en el volumen de agua sembrada. (1) - Ensayo de confirmación: Los tubos o frascos que producen gas y/o crecimiento abundante en A 1 y en A 2 se transfieren con ansa a tubos de fermentación de Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa. Se incuban 48 h a 35 o C. Los tubos que producen ácido en (1) se computan para el cálculo del NMP. En el caso de que en A 1 fueran positivos todos los tubos de dos diluciones consecutivas se confirman sólo los de la serie más diluida y se computan todos los positivos para el cálculo. 72

73 Esquema del método Standard Methods 18th. Ed Crecimiento con producción de ácido y/o gas +. Transferir para confirmación a Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa. Incubar 48 h a 35ºC. Inocular tubos de fermentación para NMP (A 1 ) o frascos para Ensayo de Ausencia-Presencia (A 2 ) con Caldo Lauril Sulfato. Incubar por 24 h a 35ºC. (1) (2) Producción de ácido y/o gas -. Incubar 24 h más (48 h en total). (a) Producción de gas +. Transferir a Agar ENDO o Mac Conkey. Incubar 24 h a 35ºC. (b) Producción de gas -. Ausencia de coliformes (a) Producción de gas + y/o ácido +. Seguir como en (1). (b) Gas -, ácido -. Ausencia de coliformes (1.1) Colonias típicas o atípicas. - Transferir a Caldo Lauril Sulfato. Incubar h a 35ºC. - Transferir a Agar nutritivo inclinado. Incubar 24 h a 35ºC a 1.2. (a ) Producción de gas -. Ausencia de coliformes (1.2) Colonias no típicas. Ausencia de coliformes (b ) Gas + Tinción de Gram del AN: Bacilos Gram Ensayo completo Presencia de coliformes Mezcla de bacilos Gram y Gram +. Repetir desde 1.1. Esporas y/o bacilos Gram +. Ensayo completo Ausencia de coliformes (1) (a) - Ensayo completo: Para establecer con certeza la presencia de coliformes y para obtener datos de control de calidad se debe usar el Ensayo Completo en por lo menos el 10% de los tubos positivos en los ensayos anteriores. Se puede utilizar una doble confirmación en Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa o sembrar cada tubo positivo de (1) en Agar Endo o Agar Mac Conkey. Incubar 24 h a 35ºC. Las colonias típicas en Agar Endo son rosas o rojas con brillo metálico y las atípicas son rosas o rojas sin brillo metálico, otras colonias se consideran negativas. Las colonias típicas en Agar Mac Conkey son rojas rodeadas de un halo de precipitación. De cada placa se pica una o más colonias y se transfieren: a.1.1. Caldo Lauril Sulfato. Incubar h a 35ºC. a.1.2. Agar Nutritivo inclinado (No necesario en agua de bebida). Incubar 24 h a 35ºC. La producción de gas en Lauril Sulfato y la presencia de cocobacilos Gram - en el cultivo de Agar Nutritivo indican: Presencia del grupo coliforme (Ensayo completo). Si no se produce gas en los tubos de Caldo Lauril Sulfato, ajustar el cálculo del NMP. 73

74 c) Determinación de coliformes totales por el método de filtración por membrana (Directiva 95/131 CEE) Se filtra por membrana la cantidad necesaria de agua y se coloca el filtro en 25 ml de Caldo Lauril Sulfato. Se incuba 4 h a 30 o C y 14 h a 37 o C. Si hay producción de ácido y/o gas y/o crecimiento abundante, confirmar como en (1). Se determina ausencia o presencia del grupo coliforme en el volumen filtrado. Si se desea hacer recuento colocar el filtro sobre un pad estéril embebido en el medio de cultivo (Caldo Lauril Sulfato para filtración por membrana), incubando de igual forma. Las colonias amarillas se confirman como en (1). Se pueden determinar UFC de coliformes totales/volumen de agua. d) Determinación de E. coli por el método de filtración por membrana Proceder como en 4) e incubar 4 h a 30 o C y 14 h a 44 o C (Directiva 95/131 CEE). Producción de ácido y/o gas y/o crecimiento abundante se confirma estriando en agar Endo. A las colonias aisladas se les realizan las pruebas de IMViC y/o set de pruebas múltiples. Se informa ausencia o presencia de E. coli en el volumen filtrado (9225 E. St. Meth. 18th Ed. 1992). Si se desea hacer recuento se procede como en 4), incubando 4 h a 30ºC y 14 h a 44ºC. Las colonias amarillas se confirman por pruebas de IMViC y/o set de pruebas múltiples. Se informa UFC de E. coli por volumen de agua filtrada. e) Determinación de Estreptococos fecales (Método APHA 1984) Filtrar por membrana la cantidad necesaria de agua y colocar el filtro en cajas de Agar KF. Incubar 48 h a 37ºC. Confirmación: Aislar las colonias típicas en placas de Agar Cerebro Corazón. Incubar 24 h a 35ºC. De las colonias aisladas realizar: Gram, catalasa, siembra en Agar Bilis Esculina (48 h a 35ºC), siembra en Agar Infusión de Corazón (24 h a 35ºC), siembra en Caldo Infusión de Corazón 6,5% de NaCl (24 h a 37ºC). Informar ausencia o presencia de Estreptococos fecales en el volumen filtrado. f) Determinación de P. aeruginosa (Norma DIN 38411) Enriquecimiento: a) Filtrar por membrana la cantidad adecuada de agua y colocar el filtro en 25 ml de Caldo Verde de Malaquita. b) Colocar la cantidad adecuada de agua en igual volumen de Caldo Verde de Malaquita doble concentrado. Incubar 48 h a 37 o C. Aislamiento: Si se observa crecimiento en el caldo de enriquecimiento sembrar por estría en placas de Agar Cetrimida. Incubar 48 h a 42 o C. Confirmación: de las colonias de Agar Cetrimida sembrar en: Agar F (formación de fluoresceína), Agar P (formación de piocianina) y Agar Acetamida. Realizar la prueba de oxidasa. g) Determinación de anaerobios esporulados sulfito reductores (Norma DIN 38411) Se siembra la cantidad adecuada de agua en igual cantidad de Caldo Diferencial para Clostridios (DRCM) doble concentrado. Se recubre con parafina líquida y se pasteuriza el conjunto 20 minutos a 70ºC. Se incuba como mínimo 48 h a 37ºC. La mayoría de los cultivos pueden reconocerse al cabo de 3-4 días pero es conveniente prolongar las observaciones una semana o más, ya que la germinación de las esporas puede tardar bastante tiempo. 74

75 REQUERIMIENTOS MICROBIOLÓGICOS DEL CAA Art. 982 Agua potable de suministro público y de uso domiciliario. Art. 983 Agua de bebida potabilizada envasada. Bacterias mesófilas (APC 24 h a 37ºC): máx. 500UFC/ml Bacterias coliformes (NMP 48 h a 37ºC en Caldo Lauril Sulfato o Caldo Mac Conkey): igual o menor que 3 /100ml. E. coli: ausencia en 100ml P. aeruginosa: ausencia en 100ml Art. 985 Agua mineral natural. No debe tener: Parásitos en 250 ml. E. coli en 250 ml. Estreptococos fecales en 250 ml. P. aeruginosa en 250 ml. Anaerobios esporulados sulfito reductores en 50 ml. 75

76 Tabla I. - Número más probable (N.M.P.) de bacterias coliformes por 100 ml de la muestra, sembrando porciones en no más de tres diluciones Combinación de tubos sembrados 10, 1 y 0,1 ml respectivamente Número de tubos positivos ml 1 ml 0.1 ml ,9 4,9 4,7 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,5 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 4,3 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,1 4,1 4,0 4,0 4,0 4, ,7.. 9,3 9,2 9,2 9,2 9,1.. 8,9 8,8 8,8 8,8 8,7.. 8,5 8,5 8,4 8,4 8,4.. 8,1 8,1 8,1 8,1 8, ,5 9,5 9,4 9,4 9,3 9,3 9,1 9,1 9,0 9,0 8,9 8,9 8,7 8,7 8,6 8,6 8,5 8,5 8,3 8,3 8,3 8,2 8,2 8, ,9 6,5 6,4 6,1 6,0 6,0 6,0 5,9 5,9 5,7 5,7 5,6 5,6 5,6 5,5 5,4 5,4 5,3 5,3 5,3 5,2 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 5, ,9 9,9 9,9 9, Ferramola, Examen bacteriológico de aguas,

77 Tabla II. - Número más probable (N.M.P.) de bacterias coliformes por 100 ml de la muestra, sembrando porciones en no más de tres diluciones Combinación de tubos sembrados 10, 1 y 0,1 ml respectivamente Número de tubos positivos ml 1 ml 0.1 ml ,3 3,3 3,2 3,2 3,2 3,1 3,1 3,1 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2, ,1 3,9 3,9 3,8 3,7 3,7 3,6 3,6 3,6 3,6 3,6 3,5 3,5 3,5 3,5 3,4 3,4 3,4 3,4 3,4 3,3 3,3 3,3 3, ,1 8,0 7,7 7,7 7,7 7,4 7,4 7,4 7,3 7,3 7,3 7,2 7,1 7,1 7,1 7,1 7,0 6,9 6,9 6,9 6,8 6,8 6, ,8 9,8 9,7 9,3 9,3 9,2 9,1 9,1 9,1 8,9 8,8 8,8 8,7 8,7 8,7 8,5 8,5 8,4 8,4 8,3 8, Ferramola, Examen bacteriológico de aguas,

78 MPN index and 95% confidence limits for various combinations of positive results when various numbers of tubes are used. (Inocula of 0.1, 0.01, and g) 3 Tubes per dilution 5 Tubes per dilution 95% Confidence limits 95% Confidence limits Combination of positives MPN index per g Lower Upper MPN index per g Lower Upper <3 <0.5 <9 <2 <0.5 < < < < < < < < < < < < < , , , , >1,100 >150 >4, FAO, Manual of Food Control Quality. Microbiological Analysis,

79 BIBLIOGRAFIA Adams, M.R. & Moss, M.O. Food Microbiology. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, AOAC, Official Methods of Analysis, 1995 APHA."Compendium of Methods for the microbiological examination of foods",1st Ed. (1976), 3 rd Ed (1992). Brock, T.D. & Madigan, M.T. Microbiología, 6ª Edición. Prentice Hall Hispanoamericana. México, de la Canal, J.J. Código Alimentario Argentino, 1995 Doyle, M.P., Beuchat, L.R. & Montville, T.J. (Eds.). Food Microbioloy. Fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington D.C., FAO, Manual of Food Quality Control. 4. Rev.1. Microbiological analysis, 1992 ICMSF, "Microorganismos en los Alimentos. Vol. I. Técnicas de análisis microbiológico". Ed. Acribia 1983 ICMSF Microorganisms in Foods. 1. Their significance and methods of ennumeration, 2 nd Ed. University of Toronto Press, ICMSF Microbial Ecology of Foods. Volume 1: Factors affecting life and death of microorganisms. Volume 2: Food commodities. Academic Press, New York, (Edición en castellano: Editorial Acribia, 1985). ICMSF Microorganisms in Foods. 2. Sampling for microbiological analysis: principles and specific applications, 2 nd Ed. Blackwell Scientific Publications, Oxford, ICMSF Microorganisms in Foods. 5. Microbiological Specification of Food Pathogens, Blackie, London, Normas FIL-IDF: 73A:1985; 93A:1985; 94B:1990; 45:1990 Mossel y Moreno García, "Microbiología de los alimentos. Fundamentos ecológicos para garantizar y comprobar la inocuidad y calidad de los alimentos."; Ed. Acribia, Pitt, J.I. & Hocking, A.D. Fungi and Food Spoilage. 2 nd Ed., Blackie Academic & Professional, London, St. Methods for the examination of water and waste waters. APHA 18 th ED, 1992 USDA, FSIS, Microbiology Division Beltsville, MD. Method for the isolation and identification of Listeria monocytogenes from processed meat and poultry products Vanderzant, C. & Splittstoesser, D. (Eds.). Compendium of methods for the microbiological examination of foods 3 rd Ed. APHA,

80 ANEXO - BIOSEGURIDAD REGLAS BÁSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA ALUMNOS DE LABORATORIOS DE QUÍMICA Y BIOLOGÍA - PAUTAS DE ACTUACION EN CASOS DE EMERGENCIAS FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES - SERVICIO DE HIGIENE Y SEGURIDAD Las prácticas que se realizan en los laboratorios presentan riesgos propios de cada actividad. Las reglas básicas aquí indicadas son un conjunto de normas destinadas a proteger la salud de los alumnos y a evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro del ámbito de trabajo, como hacia el exterior. Es un elemento clave en la seguridad la información que permita reconocer y minimizar o evitar los riesgos presentes en el laboratorio. Será fundamental respetar la metodología de cada técnica, y trabajar con cuidado y en forma ordenada. MEDIDAS GENERALES 1. Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales como: matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignífugas, lavaojos, gabinete para contener derrames, accionamiento de alarmas, etc. 2. No se debe comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio. 3. No se debe guardar alimentos en heladeras que contengan drogas o preparados. 4. Se debe utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio, guardapolvo abrochado (preferentemente de algodón y de mangas largas) y zapatos cerrados. Evitar el uso de accesorios colgantes (aros, pulseras, collares, etc.). Llevar el cabello recogido. 5. Las mesadas de trabajo, deben estar despejadas, sin libros, ni abrigos ni objetos personales. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes. 6. Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación de laboratorio y antes de retirarse del mismo. 7. Se deben utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias química o material biológico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deberá tocar objetos, ni superficies, tales como: teléfono, lapiceras, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc. 8. No se permite correr en los laboratorios. 9. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con bancos, sillas, equipos, máquinas u otros elementos que entorpezcan la correcta circulación. 10. De aviso inmediato al docente responsable si encuentra instalaciones eléctricas y de gas precarias o provisorias. 11. No utilice equipos (Ej. Rotavap, columnas de destilación, sonicadores, hornos etc.) sin haber recibido entrenamiento previo y sin supervisión durante su uso. 12. Toda herida o abrasión, aún los pequeños cortes que puedan producirse durante el trabajo práctico deben ser informados al Docente. Los laboratorios cuentan con un botiquín de primeros auxilios con los elementos indispensables para atender casos de emergencia. 13. Respete las señales de advertencia. (ej.: riesgo eléctrico, alta temperatura, radiaciones, etc.) 80

81 14. Todo residuo generado debe colocarse en los recipientes destinados para tal fin según las indicaciones del docente (ver Pautas para Gestión de Residuos). LABORATORIOS DE QUÍMICA 1. No se permite pipetear con la boca. 2. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se utilizarán anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u otros dispositivos de protección. Cuando se manipulen productos químicos que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitará el uso de lentes de contacto. 3. No utilice el contenido de un recipiente que no este identificado. Los envases que contengan agentes químicos deben adecuadamente etiquetados con la denominación del compuesto y el tipo de riesgo (Ej.: corrosivo, tóxico, inflamable, oxidante, radiactivo, explosivo o nocivo). 4. Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales inflamables (más de 5 litros) deberá tenerse a mano un extintor apropiado para ese material en cuestión. 5. Al almacenar sustancias químicas se debe considerar las incompatibilidades que dan lugar a reacciones peligrosas. Consultar con el Docente. 81

82 6. No almacenar en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas y en caso de ácidos o álcalis concentrados (mayor de 2N) deben ser mantenidos en bandejas de material adecuado. 7. Las prácticas que produzcan gases, vapores, humos o partículas, y que puedan ser riesgosas por inhalación deben llevarse a cabo bajo campana. 8. Se debe verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de ignición. 9. No se debe trabajar con materiales inflamables o solventes sobre llamas directas o cerca de las mismas. Para calentamiento, sólo se utilizarán resistencias eléctricas o planchas calefactoras blindadas. Se prestará especial atención al punto de inflamación y de autoignición del producto. 10. Está prohibido descartar líquidos inflamables o tóxicos o corrosivos por los desagües de las piletas, sanitarios o recipientes comunes para residuos. Se deben seguir las pautas para la gestión de residuos. 11. Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben estar en posición vertical sujetos con correas o cadenas a la pared en sitios de poca circulación, de ser posible fuera del lugar de trabajo, protegidos de la humedad y fuentes de calor. 12. El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será conveniente envolverlo en papel y ubicarlo en cajas resistentes, 13. Todo recipiente que hubiera contenido agentes químicos puede ser descartado junto a los residuos comunes vaciado totalmente, enjuagado apropiadamente y sin etiquetas. 14. Está terminantemente prohibido hacer experimentos no autorizados por el Docente. No substituya nunca un producto químico por otro en una práctica. LABORATORIOS DE BIOLOGIA 1. Leer Reglas Básicas para Laboratorios de Química. 2. Se deben utilizar mascarillas descartables cuando exista riesgo de producción de aerosoles (mezcla de partículas en medio líquido) o polvos durante operaciones de pesada de sustancias tóxicas o biopatógenas, apertura de recipientes con cultivos después de agitación, etc. 3. Está prohibido descartar material biológico por los desagües de las piletas, sanitarios o recientes comunes para residuos. En cada caso se deberán seguir los procedimientos establecidos para la gestión de residuos. 4. La superficie de trabajo se deberá descontaminar una vez terminadas las tarea o luego de cada derrame de material viable, utilizando productos probadamente efectivos contra los agentes con que se trabaja. 5. El derrame o caída de muestras contaminadas, diluciones y medios sembrados o inoculados será informada al docente de inmediato. Se procederá a tratar el área afectada con la solución desinfectante que corresponda, la cual se dejará actuar y se recogerá con papel absorbente que será luego descartado con los residuos patogénicos. 6. En caso de rotura del recipiente de vidrio que contiene microorganismos, proceder de igual forma pero no tocar los residuos antes que el desinfectante haya actuado. 7. Cuando proceda a la limpieza de una superficie con alcohol, verifique que no haya mecheros encendidos. 8. Consulte con el Docente si el material biológico debe ser descontaminado previo a su descarte en recipiente de residuos patogénicos (bolsa roja). 82

83 PAUTAS PARA LA GESTIÓN DE RESIDUOS PELIGROSOS Y PATOGÉNICOS Peligrosos (ácidos, álcalis, oxidantes, corrosivos, guantes, trapos, etc.): Los residuos líquidos se deberán acumular en bidones provistos por el Servicio de Higiene y Seguridad. Mantenerlos tapados. No mezclar sin consultar al Docente. Los residuos sólidos se deberán acumular en bolsas negras dentro de cajas provistas por el Servicio de Higiene y Seguridad. No tirar residuos domésticos. Patogénicos (tips, guantes, cajas de petri, etc.): Los residuos biológicos (sangre, tejidos animales o humanos y todo el material que haya estado en contacto con ellos) se deberán acumular en bolsas rojas dentro de cestos con tapa provistos por el Servicio de Higiene y Seguridad. Quedan exceptuados los elementos cortopunzantes (agujas, hojas de bisturíes), que se recogerán en contenedores especiales. ANTE CUALQUIER DUDA CONSULTE CON EL DOCENTE La seguridad la disfrutamos todos. Actuemos responsablemente PAUTAS DE ACTUACIÓN EN CASO DE EMERGENCIAS En caso de accidente, avisar inmediatamente al Docente. EMERGENCIAS MÉDICAS Si ocurre una emergencia tal como cortes o abrasiones, quemaduras o ingestión accidental de algún producto químico, tóxico o peligroso, se deberá proceder en la siguiente forma: 1. A los accidentados se les proveerá los primeros auxilios 2. Se da aviso al Departamento de Seguridad y Control (Int. 311 Emergencias) 3. El Docente responsable del turno o una autoridad del Departamento, deberá completar el Formulario de Incidentes y enviarlo al Servicio de Higiene y Seguridad para su conocimiento y evaluación. CENTROS PARA REQUERIR AYUDA MEDICA S.A.M.E. Teléfono 107 Hospital Pirovano Av. Monroe 3555 Tel / 9279 INTOXICACIONES: Hospital de Niños. Dr. R. Gutiérrez Sánchez de Bustamante Capital Federal. Tel: Hospital de Niños. Dr. P. de Elizalde Av. Montes de Oca 40 Tel Toxicología QUEMADURAS: Hospital de Quemados P.Goyena 369 Tel /

84 OFTALMOLOGÍA Hospital Santa Lucía San Juan 2021 Tel Hospital Dr. P. Lagleyze Av. Juan B. Justo 4151 Tel / Quemaduras. Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas o mantas calefactoras, etc., se trataran lavando la zona afectada con agua fría durante minutos. Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata. No utilices cremas y pomadas grasas en las quemaduras graves. 2. Cortes. Los cortes se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos como mínimo. Si son pequeños y dejan de sangrar en poco tiempo, lávalos con agua y jabón y tápalos con una venda o apósito adecuados. Si son grandes y no paran de sangrar, requiere asistencia médica inmediata. 3. Derrame de productos químicos sobre la piel. Los productos químicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua corriente abundante, como mínimo durante 15 minutos. Es necesario sacarle toda la ropa contaminada a la persona afectada lo antes posible. El lavado es muy importante para reducir la gravedad y la extensión de la herida. Requiere asistencia médica. 4. Actuación en caso de producirse corrosiones en la piel. Por ácidos. Sacar o cortar lo más rápidamente posible la ropa. Lavar con agua corriente abundante la zona afectada. Neutralizar la acidez con bicarbonato sódico durante minutos. Esperar la asistencia médica. Por álcalis. Lavar la zona afectada con agua corriente abundante y luego con una solución saturada de ácido bórico. Secar y esperar la asistencia médica. 5. Fuego en el cuerpo. Si se te incendia la ropa, pide ayuda. El afectado no correrá, tiene que tirarse en el suelo y rodar sobre si mismo para apagar las llamas. Es tu responsabilidad ayudar a alguien que se esté quemando. Cubrirlo con una manta antifuego, conducirlo hasta la ducha de seguridad, si está cerca. No utilices nunca un extintor sobre una persona. Una vez apagado el fuego, mantener a la persona tendida, hasta que llegue la asistencia médica. 6. Actuación en caso de producirse corrosiones en los ojos. En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos). Cuanto antes se lave el ojo, menos grave será el daño producido. Lavar los dos ojos con agua corriente abundante durante 15 minutos como mínimo en una ducha de ojos, o con solución fisiológica. Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado debajo de los párpados. Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la lesión. 7. Actuación en caso de ingestión de productos químicos. Antes de cualquier actuación concreta pide asistencia médica. Si el paciente está inconsciente, ponerlo en posición inclinada, con la cabeza de lado. Si está consciente, mantenerlo apoyado. No dejarlo sólo. No provocar el vómito si el producto ingerido es corrosivo. 84

85 8. Actuación en caso de inhalación de productos químicos. Identificar el vapor tóxico. Si se trata de un gas, utilizar el tipo adecuado de máscara para gases durante el tiempo que dure el rescate del accidentado. No arriesgarse. Conducir inmediatamente la persona afectada a un sitio con aire fresco. Requiere asistencia médica lo antes posible. Ante el primer síntoma de dificultad respiratoria, iniciar la respiración artificial boca a boca. INCENDIOS 1. Fuego en el laboratorio. Mantenga la calma. Informe al docente responsable. Se dará aviso inmediatamente al Dpto. de Seguridad y Control (Interno 311) informando el lugar y las características del siniestro 2. Fuegos pequeños Si el fuego es pequeño y localizado, y sabe utilizar un extintor, trate de apagarlo utilizando un extintor adecuado, arena, o cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo ahogue. Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego. No utilices nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamación de un solvente. 3. Fuegos grandes Si el fuego es de consideración, no se arriesgue y manteniendo la calma ponga en marcha el plan de evacuación. Apague los equipos eléctricos y cierre las llaves de gas y ventanas. Acate las indicaciones de los brigadistas. Evacue la zona por la ruta asignada. No corra, camine rápido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. No utilice ascensores. Descienda siempre que sea posible. No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida. Si pudo salir por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se encarguen. DERRAME MAYORES DE PRODUCTOS QUÍMICOS Avise al Departamento de Seguridad y Control (int. 311 Emergencias) Atender a cualquier persona que pueda haber sido afectada. Notificar a las personas que se encuentren en las áreas cercanas acerca del derrame. Buscar los elementos en el Gabinete para contener derrames. Coloque la cinta de demarcación para advertir el peligro. Evacuar a toda persona no esencial del área del derrame. Si el derrame es de material inflamable, apagar las fuentes de ignición, y las fuentes de calor. Evite respirar los vapores del material derramado, si es necesario utilizar una máscara respiratoria con filtros apropiados al tipo de derrame. Ventilar la zona. Utilizar los elementos de protección personal tales como equipos de ropa resistente a ácidos, bases y solventes orgánicos y guantes. Confinar o contener el derrame, evitando que se extienda. Para ello extender los cordones en el contorno del derrame. Luego absorber con los paños sobre el derrame. 85

86 Deje actuar y luego recoger con pala y colocar el residuo en la bolsa roja (patogénicos) o negra (peligrosos) y ciérrela. Si el derrame es de algún elemento muy volátil deje dentro de la campana hasta que lo retire para su disposición. Disponer la bolsa con los residuos (consultar al Servicio de Higiene y Seguridad, int. 275) Lave el área del derrame con agua y jabón. Seque bien. Cuidadosamente retire y limpie todos los elementos que puedan haber sido salpicados por el derrame. Lave los guantes, la máscara y ropa. 86

87 Fecha:... Declaro haber leído las REGLAS BÁSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS DE QUÍMICA Y BIOLOGÍA PROCEDIMIENTOS ANTE EMERGENCIAS que aparecen en la guía de Trabajos Prácticos de la Materia... Turno de Laboratorio:... Firma:... Aclaración:... L.U. Nº:... 87