TEMA 10. Cultivo y aislamiento de patógenos viables

Transcripción

1 TEMA 10 Cultivo y aislamiento de patógenos viables

2 Tema 10. Cultivo y aislamiento de patógenos viables 1. Medios de cultivo 2. Preparación de medios de cultivo artificiales 3. Condiciones para el aislamiento de patógenos 3.1. Comportamiento de los microorganismos frente al oxígeno Incubación de microorganismos microaerófilos y capnófilos 3.2. Comportamiento de los microorganismos frente a la temperatura 3.3. Comportamiento de los microorganismos frente al ph. Tiempo de incubación 4. Medios artificiales 4.1. Ejemplos de medios de aislamiento primario Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA) Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos) 4.2. Ejemplos de caldos de enriquecimiento Caldo selenito 4.3. Ejemplos de medios enriquecidos Agar sangre 4.4. Ejemplos de medios diferenciales Agar de MacConkey Agar salino manitol (SM)

3 Tema 10. Cultivo y aislamiento de patógenos viables 4. Medios artificiales (continuación) 4.5. Ejemplos de medios selectivos Agentes inhibidores Agar entérico de Hektoen (HE) Agar alcohol fenil etílico (PEA) 4.6. Medios cromogénicos 5. Recuento de patógenos 5.1. Mediante la técnica de estría en placa 5.2. Mediante la utilización de asa calibrada 6. Cultivo de patógenos intracelulares obligados

4 1. Medios de cultivo Regla de oro de la Microbiología Muestra Cultivo y aislamiento de microorganismos Cultivo puro Identificación Realización pruebas susceptibilidad Etapa limitante en la rapidez del diagnóstico microbiológico

5 1. Medios de cultivo Qué es un medio de cultivo?

6 2. Preparación de medios de cultivo artificiales Preparación Esterilización Autoclave Tindalización Filtración Luz UV Horno a 180 ºC Óxido de etileno Adición de sustancias termolábiles Vertido en placas de Petri (medios sólidos) o tubos (medios líquidos o medios sólidos)

7 3. Condiciones para el aislamiento de patógenos Medio de cultivo No exigentes: nutrientes (C, N, S, P), sales, tampón. Exigentes: nutrientes más sustancias complejas (sangre, suero, huevo, patata, factor X, factor V, vitaminas). Condiciones de incubación Atmósfera Temperatura Humedad Tiempo de incubación ph Ausencia de factores inhibidores o antagonistas del crecimiento

8 3.1. Comportamiento de los microorganismos frente al oxígeno Aerobios Anaerobios facultativos Anaerobios Microaerófilos Frascos con vela Agar semisólido Capnófilos Atmósfera de CO 2 Sistemas GasPak, Bio Bag (bicarbonato y ácidos) Utilización de estufas de CO 2 Crecimiento A: Aerobios obligados B: Microaerófilos C: Anaerobios facultativos D: Anaerobios estrictos

9 Incubación de microorganismos microaerófilos y capnófilos

10 3.2. Comportamiento de los microorganismos frente a la temperatura Temperatura de incubación ºC 30 ºC Otras temperaturas Elevadas (42 ºC) Bajas (4ºC) enriquecimiento en frío Intermedias (22 ºC) 3.3. Comportamiento de los microorganismos frente al ph. Tiempo de incubación. ph Tiempo de incubación

11 4. Medios artificiales Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento o medios nutritivos) Medios enriquecidos Caldos de enriquecimiento Medios diferenciales Medios selectivos Medios cromogénicos

12 4.1. Ejemplos de medios de aislamiento primario Agar nutritivo Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA) Agar triptona soja (TSA) Agar sangre Agar chocolate Agar CLED (urocultivo) Caldo con carne picada

13 Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA) Componentes Extracto de cerebro Extracto de corazón Peptona Glucosa Tampón fosfato NaCl Agar Cantidad 7,8 g/l 9,7 g/l 10 g/l 2 g/l 2,5 g/l 5 g/l 15 g/l Propiedad Fuente de nutrientes Fuente de nutrientes Fuente de proteínas Hidrato de carbono Regulación ph Estabilizador osmótico Agente solidificante Medio rico, no selectivo, permite crecimiento de la mayoría de microorganismos no exigentes. Ausencia de agentes inhibidores.

14 Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos) Componentes Cantidad Digerido pancreático de gelatina 4 g/l Digerido pancreático de caseína 4 g/l Extracto de carne 3 g/l Lactosa 10 g/l L-cistina 0,128 g/l Azul de Bromotimol 0,02 g/l Agar 15 g/l La lactosa es el único carbohidrato presente. Permite diferenciar los fermentadores de lactosa de los no fermentadores gracias a la presencia del indicador azul de bromotimol que vira a color amarillo a ph ácido. Debido a su deficiencia en electrolitos, no permite que las colonias de Proteus invadan la placa de cultivo, lo que facilita el recuento. La cistina facilita el crecimiento de los coliformes.

15 4.2. Ejemplos de caldos de enriquecimiento Caldo selenito Salmonella Caldo tetrationato Salmonella y Shigella Caldo para Gram negativos Salmonella y Shigella Se debe subcultivar en medios más selectivos al cabo de unas horas

16 Caldo selenito Componentes Peptona Lactosa Selenito de sodio Fosfato de sodio Cantidad 5 g/l 4 g/l 4 g/l 10 g/l Propiedad Fuente de proteínas Fuente de carbono Agente inhibidor de la mayoría de enterobacterias, incluyendo muchas especies de Shigella Tampón Enriquecimiento de especies de Salmonella en muestras de heces, aguas fecales, etc. Subcultivar al cabo de 8-12 horas en medio más selectivo (Agar SS o Agar sulfito de bismuto).

17 4.3. Ejemplo de medios enriquecidos Agar sangre Agar base de Columbia + 5% sangre desfibrinada Componentes Cantidad Peptona 5 g/l Tripteína 12 g/l Extracto de levadura 3 g/l Extracto de corazón (buey) 3 g/l Almidón soluble 1 g/l Cloruro sódico 5 g/l Agar 15 g/l Medio rico y diferencial. La sangre más comúnmente utilizada es la de oveja, al 5%, estéril y desfibrinada. Una vez preparado el medio de cultivo, se enfría hasta 45ºC y se le añade la sangre.

18 Agar sangre CARACTERÍSTICAS DE LA BETA Y ALFA HEMÓLISIS Beta hemólisis Alfa hemólisis Lisis completa de los glóbulos rojos Halo transparente alrededor de la colonia Lisis parcial de los glóbulos rojos Se abren poros en la membrana Salida de hemoglobina al medio Oxidación del grupo hemo Formación de biliverdina (color verdoso) Halo verdoso alrededor de la colonia α β

19 4.4. Ejemplos de medios diferenciales Agar sangre Agar CLED Agar EMB Agar de MacConkey Agar SS Agar entérico de Hektoen (HE) Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) Agar salino manitol (SM)

20 Agar de MacConkey Componentes Peptona Polipeptona Lactosa Sales biliares (conc. moderada) Cristal violeta NaCl Rojo neutro Agar Cantidad 17 g/l 3 g/l 10 g/l 1,5 g/l 0,001 g/l 5 g/l 0,03 g/l 13,5 g/l Propiedad Fuente de proteínas Fuente de proteínas Azúcar fermentable Inhibidor de Gram positivos Inhibidor de Gram positivos Estabilizador osmótico Indicador de ph Agente solidificante Aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos Gram negativos fermentadores y no fermentadores de la lactosa.

21 Agar de MacConkey Colonias rojas/rosa Fermentadores de lactosa No patógenos (E. coli, Citrobacter) Patógenos (Klebsiella, Enterobacter) Colonias transparentes/blancas No fermentan la lactosa Patógenos (Salmonella, Shigella, Yersinia, Proteus) Precipitación en el medio Fermentadores fuertes de lactosa (E. coli, Enterobacter)

22 Agar salino manitol (SM) Medio de Chapman Componentes Extracto de levadura Triptona Gelatina Lactosa Manitol Cloruro sódico Fosfato dipotásico Rojo fenol Agar Cantidad 2,5 g/l 10 g/l 30 g/l 2 g/l 10 g/l 75 g/l 5 g/l 0,025 g/l 15 g/l Se pueden distinguir los estafilococos que fermentan el manitol de los que no lo fermentan gracias al rojo fenol que vira a color amarillo en medio ácido. La mayoría de los microorganismos no crecen a una concentración de cloruro sódico del 7,5%, mientras que los estafilococos sí lo hacen.

23 4.5. Ejemplos de medios selectivos Moderadamente selectivos MacConkey Enterobacterias EMB Enterobacterias Altamente selectivos Agar salino manitol Staphylococcus Agar SS Salmonella y Shigella Agar entérico de Hektoen (HE) Salmonella y Shigella Agar sulfito de bismuto Salmonella y Shigella Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) Salmonella y Shigella Agar alcohol fenil etílico (PEA) Gram positivos

24 Agentes inhibidores Colorantes (azul de metileno, cristal violeta, verde brillante, eosina) Antibióticos Metales (Se, Bi) Sales biliares Azida Alcoholes (alcohol feniletílico) Sales (cloruro sódico a alta concentración)

25 Agar entérico de Hektoen (HE) Componentes Peptona Extracto de levadura Sales biliares (alta conc.) Lactosa Sacarosa NaCl Tiosulfato de sodio Citrato férrico amónico Azul de timol Agar Cantidad 12 g/l 3 g/l 9 g/l 12 g/l 12 g/l 5 g/l 5 g/l 1,5 g/l 0,04 g/l 14 g/l Propiedad Fuente de C y N Fuente de N Inhibidor de Gram positivos Azúcar fermentable Azúcar fermentable Estabilizador osmótico Fuente de azufre Fuente de hierro Indicador de ph Agente solidificante Aislamiento y diferenciación de especies de Salmonella y Shigella de otros bacilos entéricos Gram negativos en muestras fecales.

26 Agar entérico de Hektoen (HE) Las colonias de los fermentadores de lactosa (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) se ven de color amarillo-naranja. Las de los no fermentadores se ven incoloras. Salmonella tiene un punto negro central por la producción de sulfhídrico (sulfuro de hierro precipitado). La mayoría de las especies de Shigella no producen sulfhídrico.

27 Agar Alcohol Feniletílico (PEA) Componentes Extracto de carne Triptosa Feniletanol Cloruro de sodio Agar Cantidad 3 g/l 10 g/l 2,5 g/l 5 g/l 15 g/l Propiedad Fuente de C y N Fuente de N Inhibidor de Gram negativos Estabilizador osmótico Agente solidificante Aislamiento de microorganismos Gram positivos, especialmente estafilococos y estreptococos, a partir de diversas muestras con microbiota mixta. La adición de alcohol fenil etílico inhibe o reduce drásticamente el crecimiento de bacterias Gram negativas porque inhibe la síntesis de ADN. Además, previene la proliferación de colonias invasivas tipo swarming. El alcohol fenil etílico es un antimicrobiano, antiséptico y desinfectante que también se utiliza como esencia aromática y preservativo en farmacia y perfumería. Las placas de este medio recién preparadas huelen a rosas.

28 Agar Alcohol Feniletílico (PEA) Cuando a este medio se le adiciona sangre de oveja al 5%, se convierte en un excelente medio para el aislamiento de bacterias anaerobias presentes en muestras clínicas donde hay una microbiota abundante y heterogénea que contiene bacterias Gram negativas de crecimiento rápido tal como Proteus.

29 4.6. Medios cromogénicos Medios altamente selectivos y diferenciales. Incorporan sustratos incoloros que se transforman en productos con color (cromogénicos) tras actuar sobre ellos una enzima específica. Detección de actividades enzimáticas características de determinados géneros o especies de bacterias. β- galactosidasa β-glucosidasa β- glucuronidasa La producción de un color característico permite la identificación. β- galactosidasa ONPG ONP + galactosa Incoloro Amarillo

30 4.6. Medios cromogénicos Ejemplos de medios cromogénicos Agar CPS-ID3 Chromogenic UTI CHROMAgar Orientation URI Select 4

31 5. Recuento de patógenos 5.1. Mediante la técnica de estría en placa Estimación del número de microorganismos en la muestra original en función del crecimiento: Escaso Moderado Abundante

32 5.2. Mediante la utilización de asa calibrada

33 6. Cultivo de patógenos intracelulares obligados Crecen sólo dentro de células (clamidias, ricketsias, virus) No se ha encontrado un medio completamente artificial para su desarrollo Legionella pneumophila (Agar BCYE) Cultivos de tejidos en el laboratorio Cultivos primarios (nº cromosomas=2n) Células de riñón Fibroblastos Líneas celulares continuas (aberraciones en el nº de cromosomas, aneuploidía) Hep-2, HeLa, Vero (Virus, ensayos de toxicidad Clostridium difficile) McCoy (Clamidias) A-549, RD, MDCK (Virus)

34 6. Cultivo de patógenos intracelulares obligados