Detección de Vibrio cholerae en

Transcripción

1 Detección de Vibrio cholerae en Muestras Ambientales Metodología de Análisis TM. Lic Fabiola Rojas C. Enero

2 Muestras para análisis Matriz Alimento Pescados y mariscos Vegetales Alimentos en general Matriz Agua Mar Pozo Aguas servidas 2 2

3 Metodología Microbiología tradicional Referencias Standard Methods for Examination of Water and Wastewater, 21 Ed Bacteriological Analytical Manual Online, BAM Chapter 9 January Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. -- Part 1: Detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae ISO/TS :2007 NCh 2640 Of 2001:Productos hidrobiológicos- Detección de Vibrio cholerae. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Food, 4 Ed Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention. V. Examination of Food and Environmental Samples. 3 3

4 Metodología Microbiología tradicional Detección Aislamiento Identificación Confirmación 4 4

5 Etapas Detección Enriquecimiento Aislamiento en agar selectivo 5 5

6 Etapas Identificación Pruebas bioquímicas Serología 6 6

7 Etapas Confirmación Envío al Centro de Referencia 7 7

8 Consideraciones analíticas para matrices de alimento Aún no se ha desarrollado un buen caldo de enriquecimiento selectivo para V. cholerae. Debido a su rápido tiempo de generación, cortos períodos de incubación son efectivos. APA es un buen medio de enriquecimiento para períodos cortos de incubación, pero en ciertos tipos de muestras la flora competitiva de V. cholerae puede crecer en exceso por períodos más largos de incubación. Incubación de 18 a 24 h no es deseable pero se han aplicado para compatibilizar el análisis de las muestras con el horario de trabajo. 8 8

9 Consideraciones analíticas para matrices de alimento Si el producto ha sido sometido a etapas de proceso como: calentamiento, congelación, deshidratación o bien una baja densidad del microorganismo es esperada, una incubación prolongada es recomendada para una buena resucitación de las células dañadas. Se recomienda la incubación de ostras crudas a 42ºC por ser efectiva para aislar V. cholerae. Algunos autores como Hwang y DePaola encontraron que la incubación del enriquecimiento por 18 a 21 h en lugar de 6 a 8 h permite una mayor recuperación de V. cholerae O1 cuando bajos inóculos son usados. Lo recomendado para ostras crudas es utilizar una proporción 1:100 de muestra:apa. 9 9

10 Consideraciones analíticas para matrices de agua Vibrio cholerae serogrupo O1 y O139 colerágenos están asociados a los brotes epidémicos. Los serogrupos no O1 y no O139 no producen toxina, causan una forma leve de gastroenteritis, se asocian a casos esporádicos y se aislan normalmente de agua de estuarios y en muestras de mariscos y pescados. El aislamiento e identificación de V. cholerae en agua se basa en su rápido crecimiento en condiciones alcalinas en presencia de oxigeno. Normalmente en matrices de agua este microorganismo se encuentra en bajos niveles por lo que se recomienda utilizar técnicas de concentración. Se ha indicado que, en medio acuático, V. cholerae adopta un estado viable pero no cultivable, debido sobre todo a las bajas temperaturas

11 Consideraciones analíticas para matrices de agua La selección del método depende de la naturaleza de la muestra. Muestras de origen marino y estuario que contienen numerosos otros Vibrios se recomienda diluir y utilizar la técnica del Número Más Probable incubándose la muestra a 42ºC. Para muestras de agua claras, sin lodo o sedimento y que contienen una baja densidad de Vibrios se recomienda la técnica de Filtración por Membrana Un método para el aislamiento del Vibrio cholerae O1 a partir de aguas contaminadas es mediante el uso de una Tórula de Moore en un torrente de aguas servidas por un periodo de hasta 1 semana, seguido por una etapa de enriquecimiento y posterior identificación

12 Procedimiento Detección en Alimentos BAM online 12 12

13 Procedimiento Detección V. cholerae en aguas residuales: Tórula de Moore Esquema confección Tórula de Moore Argolla de alambre Base 10 cm Forma final de gasa Largo total 36 cm (doblado 5 veces) Ancho 24 cm Cortes de 4 cm 13 13

14 Técnica aislamiento V. cholerae en matriz agua : Tórula de Moore y Tórula de Spira Tórula de Moore ( aguas residuales) Tórula de Spira (filtrar gran volumen de agua) 14 14

15 Procedimiento Detección V. cholerae en aguas 15 15

16 Medio de cultivo de Enriquecimiento y de Aislamiento MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO Agua Peptonada Alcalina La viabilidad de Vibrio spp. se mantiene intacta a ph alcalino y el uso de agua peptonada alcalina ha sido recomendado para incrementar la recuperación de Vibrio spp. de materia fecal y de otras muestras. El medio contiene peptona de carne, cloruro de sodio y el ph final es de 8.6 ± 0.2 a 25ºC. Se incuba 6 a 8 horas y se siembra en los medios de cultivo. Formulación Peptona NaCl Agua destilada 10 g 10 g l liter Ajustar ph de manera de obtener 8.5 ± 0.2 después de de esterilizar. Dispensar en tubos/frascos tapa rosca Autoclavar por 10 min a 121ºC 16 16

17 Medio de cultivo de Enriquecimiento y de Aislamiento MEDIOS DE CULTIVO DE AISLAMIENTO Agar TCBS ( Tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa-agar) Es un medio selectivo para el aislamiento de Vibrio cholerae. El medio contiene: peptona de caseína, peptona de carne, extracto de levadura, citrato de sodio, citrato de fierro, cloruro de sodio, tiosulfato de sodio, sales biliares y sacarosa y está disponible comercialmente. Se prepara según las indicaciones del fabricante. No se debe autoclavar. ph 8,6± 0,2 a 25ºC Por su doble indicador (azul de timol y azul de brotimotimol) vira al amarillo con pequeñas variaciones de ph por la acidificación de la sacarosa

18 Medio de cultivo de Enriquecimiento y de Aislamiento MEDIOS DE CULTIVO DE AISLAMIENTO ADICIONAL Agar CHROMagar Vibrio Alcance: detección y aislamiento de V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. cholerae Apariencia en el agar: V.parahaemolyticus malva V.vulnificus / V.cholerae verde-azul; azul- turquesa V.alginolyticus sin color Formulación en g/l Agar 15,0 Peptona y extracto de levadura 8,0 Sales 51,4 Mezcla cromogénica 0,3 ph : 9,0 ± 0,

19 Medio de cultivo de Enriquecimiento y de Aislamiento Agar TCBS Apariencia de colonias Planas 2 a 3 mm de diámetro, amarillas Pequeñas, azul-verdoso Microorganismos Vibrio cholerae Vibrio parahahemolyticus Desarrollo Muy Bueno Muy Bueno Largas y amarillas Vibrio alginolyticus Muy Bueno Azules Pseudomonas, Aeromonas y otros Pobre/ ninguno Muy pequeñas y translúcidas Enterobacterias y otros Pobre/ ninguno 19 19

20 Confirmación bioquímica Batería tradicional Kit identificación rápida 20 20

21 Confirmación bioquímica Batería tradicional: Perfil bioquímico Oxidasa String test AGS Tolerancia escala de sal MIO TSI LIA Indol Serología 21 21

22 Confirmación bioquímica Oxidasa + String test

23 Confirmación bioquímica KIA K/K -,- / TSI A/A -,- Tolerancia sal 1% +, 3% +, 6%- LIA K/K -,

24 Confirmación bioquímica Kit comercial API 20 E Reacción negativa PRUEBAS NEGATIVAS Reacción positiva PRUEBAS POSITIVAS 24 24

25 Confirmación bioquímica 25 25

26 Confirmación bioquímica Kit comercial test suplementarios 26 26

27 Confirmación bioquímica Kit comercial IDENTIFICACION PRESUNTIVA Galería Perfil API 20 E V Nota Taxón significativo % ID T Pruebas en contra Vibrio cholerae Taxón siguiente % ID T Pruebas en contra Vibrio mimicus SAC 0% Nota. Suspender la cepa sospechosa de Vibrio en solución salina al 0,85% 27 27

28 Caracterización bioquímica 28 Ref: BAM online 28

29 Caracterización bioquímica Número mínimo de características necesarias para identificar cepas V. cholerae Reacción positiva Porcentaje Bacilo Gram-negativo, no esporulado Oxidasa String test KIA TSI Glucosa (producción de ácido) Glucosa (producción de gas) Sacarosa (producción de ácido) L-lisina decarboxilasa a L-arginina dehidrolasa a L-ornitina decarboxilasa a Desarrollo en caldo triptona al 1% b Desarrollo en NaCl 0% Desarrollo en NaCl 1% Voges Proskauer a K/A, no gas, no H 2 S A/A, no gas, no H 2 S / c /0 d e a Con NaCl 1% b Sin NaCl c V. cholerae (y V. mimicus) d V. parahaemolyticus e La mayoría de V. cholerae O1 biotipo El Tor son positivas a VP, mientras que las cepas del biotipo Clásico son negativas. Ref: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention 29 29

30 Caracterización bioquímica 30 Ref: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention 30

31 Confirmación Serológica Flujograma de Serotipificación para Vibrio cholerae Cepa con características bioquímicas de Vibrio cholerae Estría en T1N1 Aglutinación con solución salina 0,85% Negativa Positiva Aglutinación con Polivalente O1 Cepa rugosa Negativa Positiva Vibrio cholerae no O1 Vibrio cholerae O1 Aglutinación con O139 Aglutinación con Inaba Aglutinación con Ogawa Negativa Positiva Positiva Positiva V. cholerae no O1,no O139 V. cholerae O139 V.cholerae O1, Inaba V. cholerae O1,Ogawa 31 31

32 Confirmación Serológica Aglutinación antisuero polivalente O

33 Clasificación general Clasificación Asociado a Epidemia No asociado a epidemia Serogrupos O1 No O1 Biotipos Clásico, El Tor (más frecuente) No aplicable para cepas No O1 Serotipos Inaba, Ogawa, Hikojima (raro) Los 3 serotipos no son aplicable para cepa No O1 Toxina Productor toxina de cólera CT (factor de virulencia) A veces produce otro tipo de toxina Ref: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention 33 33

34 Clasificación general Características de los serotipos de V. cholerae O1 Serotipo Ogawa Principales Factores O presentes A,B Aglutinación Ogawa Inaba + - Inaba A,C - + Hikojima A,B,C + + Ref: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention 34 34

35 DIFERENCIACIÓN ENTRE LOS BIOTIPOS EL TOR Y CLÁSICO El biotipo Clásico es raramente encontrado, los siguientes ensayos opcionales son para diferenciarlo del biotipo El Tor: Beta- hemólisis: El medio más común de diferenciar los biotipos del V. cholerae O1 y tal vez la más fácil es determinar la capacidad de producir β- hemólisis sobre placa de agar sangre de cordero. Las cepas del biotipo El Tor son β- hemolíticas, mientras que el biotipo Clásico no produce una hemolisina. Sembrar el cultivo a ensayar en cuña y superficie en placas de agar sangre de cordero incubar a horas a 35 ºC± 2ºC. La β- hemólisis puede ser determinada por una zona clara alrededor del cultivo

36 DIFERENCIACIÓN ENTRE LOS BIOTIPOS EL TOR Y CLÁSICO Sensibilidad a la Polimixina B: Sembrar profusamente un cultivo sospechoso en una placa seca de agar T 1 N 1. Poner un disco de 50 unidades de polimixina B sobre la superficie. Las cepas del biotipo Clásico son sensibles (una zona de >12 mm); las cepas del biotipo El Tor son resistentes. Si el cultivo sospechoso crece sobre agar mcpc, el cual contiene polimixina B, se considera que se trata del biotipo El Tor

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39 Gracias 39 39