Aislamiento, identificación n bioquímica y tipificación n de Shigella

Transcripción

1 I Curso Avanzado WHO Global Salmonella Surveillance Costa Rica, 26 de abril 2 de mayo 2009 Aislamiento, identificación n bioquímica y tipificación n de Shigella Elena Campos Chacón Centro Nacional de Referencia en Bacteriología INCIENSA Costa Rica

2 Introducción Shigella: : Familia Enterobacteriaceae Bacilos Gram negativos (0.3 1 µm m de diámetro y 1 6 µm m de longitud) No móviles, m no esporulados,, anaerobios facultativos Oxidasa (-),( fermentan glucosa y otros carbohidratos sin producción n de gas, RM (+) Bastante inactivos: VP (-),( citrato (-),( H 2 S (-),( LDC (-),( ADH (-),( ureasa (-)( Crecimiento óptimo: 37 C

3 Género Shigella Especie Serogrupo Serotipos Observaciones dysenteriae A 12 Serotipo 1 (bacilo de Shiga): forma más m s grave (20% letalidad) flexneri B 14 Más s común n en países sub-desarrollados boydii C 18 Se aísla a con menor frecuencia sonnei D 1 Más s común n en países desarrollados

4 Calidad de la muestra de heces para estudio de Shigella Recolectar en el período agudo de la enfermedad Antes de inicio de la antibioticoterapia Muestra: Heces Hisopado rectal Hisopado fecal Iniciar procesamiento durante las dos horas después s de recolectada, de lo contrario, colocar en Medio Cary Blair + tioglicolato y mantener refrigerado (hasta por 5 días) d

5 Día a 1: 1 Aislamiento de Shigella a partir de muestras clínicas* Observación n microscópica de las heces Inocular caldo de enriquecimiento (GN) Sembrar muestra en medios inhibidores para bacterias Gram negativas: Agar McConkey Agar SS Agar xilosa-lisina lisina-desoxicolato (XLD) Incubar a 37 C por horas * WHO Global Salm Surv Manual de Procedimientos: Diagnóstico y caracterización n de Shigella spp. INEI / Global Salm Surv / OPS - OMS

6 Aislamiento de Shigella a partir de muestras clínicas Día a 2: 2 Seleccionar 2 o 3 colonias sospechosas Agar McConkey Agar XLD Agar Salmonella-Shigella Shigella

7 Aislamiento de Shigella a partir de muestras clínicas Día a 2: 2 Inocular colonias sospechosas en agares TSI LIA TSA

8 Aislamiento de Shigella a partir de muestras clínicas Día a 3: 3 Realizar la lectura de las pruebas bioquímicas: Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Shigella: Sembrar pruebas bioquímicas complementarias: ODC, LDC, manitol, ONPG, indol, acetato, mucato,, citrato Christensen, malonato API o Vitek Realizar la tipificación n somática a partir del crecimiento en TSA TSI LIA

9 Diferenciación n de los génerosg Shigella y Escherichia Característica bioquímica Shigella Escherichia Acetato de sodio - +, (+) Citrato de Christensen - +, (+), - Mucato - + Indol - o + + Movilidad - +, - Lisina decarboxilasa - +, (+), - Gas de glucosa - + Serotipos con características bioquímicas atípicas: S. flexneri 3a y var x (indol +), S. flexneri 4b (acetato +), S. flexneri 6 (manitol -)

10 Diferenciación n bioquímica de las especies de Shigella Especie Manitol ONPG* Ornitina decarboxilasa S. dysenteriae S. dysenteriae reacción n rápidar - S. flexneri S. boydii S. sonnei * ONPG: orto-nitrofenil galactósido

11 Caracterización n bioquímica de Shigella Algunos equipos automatizados (Vitek( Vitek) ) y miniaturizados (API) de identificación n bacteriana, sugieren la especie; sin embargo, el reporte establece la necesidad de confirmar la especie con pruebas serológicas

12 Caracterización n serológica de Shigella Se debe realizar únicamente en organismos bioquímicamente compatibles con Shigella Permite evidenciar los antígenos somáticos (polisacáridos del LPS) de la membrana externa

13 Serotipificación de Shigella Aglutinación: n: organismo (antígeno) + suero inmune (anticuerpo). Cultivo fresco (24 horas) Control de aglutinación (solución n salina 2%) Si el suero contiene aglutininas contra la bacteria se produce rápidamente r una aglutinación n fuerte, firme y granular

14 Antisueros empleados para la serotipificación del género Shigella* Antisueros Nomenclatura Aglutina con: S. dysenteriae OShA (I-) OShA (I+) Serotipos indol (-): 1, 3, 4, 5, 6, 9 y 10 Serotipos indol (+): 2, 7 y 8 Anti-S. dysenteriae 1 S. dysenteriae tipo 1 (Bacilo Shiga) S. flexneri OShB 1 Con cada uno de los 6 serogrupos y antisueros monovalentes para los serotipos OShB 2 de cada serogrupo OShB 3 OShB 4 OShB 5 OShB 6 * Antisueros del Instituto Nacional de Producción n de Biológicos ANLIS Carlos G. Malbrán,, Argentina

15 Antisueros empleados para la serotipificación del género Shigella* Antisueros S. sonnei Nomenclatura OShD Reacción n esperada Aglutina con Shigella sonnei S. boydii OShC (I-) OShC (I+) Aglutna los serotipos indol (-): 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 y 14 Aglutna los serotipos indol (+): 5, 7, 9, 11, 13, 15 * Antisueros del Instituto Nacional de Producción n de Biológicos ANLIS Carlos G. Malbrán,, Argentina

16 Flujograma para serotipificación de Shigella Colonia con características BQ de Shigella SS 2% + Cepa rugosa 100 C / min. Aglutina /5 min. sucesivos hasta x 30 min OShB - OShD - OShC - OShA C / min. S. flexneri Aglutinar con antisueros para serotipos 1 6 S. sonnei S. boydii Aglutinar con C (I-) para serotipos indol - y con C (I+) para serotipos indol + S. dysenteriae Aglutinar con A (I-) para serotipos indol - y con A (I+) para serotipos indol + y con antisuero monovalente anti- S. dysenteriae 1 + Reportar Shigella spp.

17 Shigella: antisueros a probar según n la Shigella especie sugerida por Vitek / API ID según n API 20E o Vitek Vitek: S. boydii / flexneri Antisuero a probar OShB OShC (I-) OShC (I+) Vitek: S. dysenteriae API: Shigella sp. (48%), manitol (-)( API: Shigella spp. OShB (S. flexneri 6) OShB OShD API: E. coli (83%) - Shigella spp. (8%), acetato (-),( indol (+) OShB (S. flexneri 3a o variante x)

18 Flujograma Aislamiento primario Aislamiento e identificación n de Shigella en muestras clínicas Seccionar colonias sospechosas Identificación (API, Bioquímica conv) Tipificación PSA

19 La Carpintera, Tres Ríos, R Costa Rica