WHO Global Sal-Surv. Surv Curso Nivel III América Central

Transcripción

1 WHO Global Sal-Surv Surv Curso Nivel III América Central Guatemala de marzo 2007 Aislamiento y Caracterización de Salmonella spp. a partir de muestras clínicas María Inés Caffer Jefe Servicio Enterobacterias Departamento Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas A.N.L.I.S. Dr. Carlos G. Malbrán

2 TAXONOMIA DEL GENERO Salmonella El Género Salmonella comprende 2 especies: Salmonella enterica que se divide en 6 subespecies: Salmonella enterica subespecie enterica (I) Salmonella enterica subespecie salamae (II) Salmonella enterica subespecie arizonae (IIIa) Salmonella enterica subespecie diarizonae (IIIb) Salmonella enterica subespecie houtenae (IV) Salmonella enterica subespecie indica (VI) Salmonella bongori (V)

3 Flujograma de Aislamiento e Identificación n de Salmonella spp. a partir de materia fecal 1er. día MATERIA FECAL (HISOPO) Suspensión en solución fisiológica Caldo de enriquecimiento (1) Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2) hs, 37ºC Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (2) Colonias típicas (3) 2do. día TSI LIA Estría 3er. día hs, 37ºC Colonias típicas (3) Lectura (4) Serotip. O (6) P. bioq. (5) Caldo Flagelar TSI LIA Estría hs, 37ºC Lectura (4) Serotip. O (6) Lectura Serotip. H 4to. día P. bioq. (5 y 7) (1) Caldo selenito. (2) Agar MacConkey, agar SS, o agar Hektoen, o agar XLD, o agar BG. (3) Se pican de 2 a 3 colonias. (4) Si TSI y LIA dan resultados compatibles con Salmonella, se siembran Pruebas bioquímicas (P. bioq.) complementarias y se realiza la serotipificación O (Serotip. O). (5) P. bioq. complementarias: SIM, RM-VP, decarboxilasas, dulcita, malonato. (6) Serotipificación: Si la serotipificación somática O de las colonias obtenidas por ambos procedimientos de aislamiento diera igual, la serotipificación flagelar H debe hacerse en una sola de ellas. (7) Si la serotipificación somática O de las colonias obtenidas por ambos procedimientos diera igual, no es necesario sembrar P. bioq. complementarias

4 Identificaci Identificaci Identificaci Identificaci Identificaci Identificaci Identificaci Identificación y Caracterizaci Caracterizaci Caracterizaci Caracterizaci Caracterizaci Caracterizaci Caracterizaci Caracterización Bioqu Bioqu Bioqu Bioqu Bioqu Bioqu Bioqu Bioquímica mica mica mica mica mica mica mica de de de de de de de de Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella spp. spp. spp. spp. spp. spp. spp. spp.

5 Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de Salmonella Pruebas bioquímicas S. enterica subesp. enterica (I) S. enterica subesp. salamae (II) S. enterica subesp. arizonae (IIIa) S. enterica subesp. diarizonae (IIIb) S. enterica subesp. houtenae (IV) S. enterica subesp. indica (VI) S. bongori (V) Dulcita d + ONPG d + Malonato Gelatina Sorbita KCN L(+) tartrato Mucato (70%) Salicina Lactosa (75%) + (75%) - d - Habitat de la mayoría de las cepas Animales de sangre caliente Animales de sangre fría y medio ambiente + 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes reacciones

6 Pruebas bioquímicas de Salmonella enterica subesp. enterica (I) Pruebas bioquímicas Salmonella enterica subep. enterica (I) Fermentación de lactosa *** - ONPG - Producción de SH 2 + Fermentación de glucosa *** +/con gas Fermentación de dulcita *** + Fermentación de adonita *** - Decarboxilación de lisina ** + Decarboxilación de ornitina ** + Hidrólisis de arginina ** + Hidrólisis de urea ** - Producción de indol - Hidrólisis de gelatina **** - Reacción de rojo de metilo * + Reacción de Voges Proskauer * - Citrato de Simmons ** + Utilización de malonato * - *Lectura a los 2 días; ** Lectura hasta los 4 días; *** Lectura hasta los 7 días; **** Lectura hasta los 30 días

7 Caracteres bioquímicos diferenciales entre S. Typhi, S. Paratyphi A y Salmonella spp. P. bioquímicas S. Typhi S. Paratyphi A Salmonella spp. SH 2 (TSI) Trazas - + Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arginina dehidrolasa Glucosa (gas) Citrato Simmons % ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos

8 Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella enterica subesp. enterica (I) y Proteus mirabilis Pruebas bioquímicas Salmonella enterica subesp. Proteus mirabilis enterica (I) SH 2 (TSI) + + Hidrolisis de urea - + Fenilalanina deaminasa - + Lisina decarboxilasa + - Ornitina decarboxilasa + + Lactosa - - Dulcita + - ONPG % ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos

9 Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella enterica subesp. enterica (I) y Citrobacter freundii Pruebas bioquímicas Salmonella enterica subesp. Citrobacter freundii enterica (I) SH 2 (TSI) + + Urea (hidrólisis) - d Lisina decarboxilasa + - Ornitina decarboxilasa + d Lactosa (fermentación) - d Sacarosa (fermentación) - d Dulcita (fermentación) + d Malonato (fermentación) - d ONPG % ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes reacciones

10 Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella enterica subesp. IIIa y IIIb y Citrobacter freundii Pruebas bioquímicas Salmonella subesp. enterica Citrobacter freundii IIIa y IIIb Lisina decarboxilasa + - Ornitina decarboxilasa + - (con excepciones) Glicerol - + Malonato + - Hidrólisis de gelatina + (lenta) % ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos

11 Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella enterica subesp. enterica (I), Edwarsiella tarda y Escherichia coli SH 2 + P. bioquímicas S. enterica subesp. E. tarda E. coli SH 2 + enterica (I) Indol Citrato Simmons Lisina decarbox Arginina dehidrol /+ Manita Dulcita + - +/- Ramnosa Xilosa ONPG % ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos

12 Serotipificación de spp. Salmonella spp. Esquema de Kauffmann-White

13 ANTIGENOS DEL GENERO Salmonella El estudio de la estructura antigénica del género Salmonella permite tipificar las bacterias que lo componen en serovariedades (serotipos). La serotipificación completa se basa en la determinación de los antígenos somáticos O, los antígenos flagelares H y el antígeno capsular Vi (si está presente). La serotipificación: Es un importante complemento de la identificación bioquímica. Permite determinar la prevalencia de una serovariedad en distintas zonas geográficas. Es de utilidad en el estudio de brotes y en la vigilancia basada en el laboratorio

14 Componentes estructurales de una célula bacteriana Localización de antígenos de Salmonella spp. Citoplasma Pilus Flagelo bacteriano Ag flagelar H Ribosomas ADN Membrana plasmática Cápsula Ag Vi Pared celular LPS LPS Core Core Lípido pido A Ag somático O

15 I.- Antígeno somático O ESTRUCTURA DEL LPS S. Typhimurium Antigeno O CORE Exterior Interior Hep PP EIN Gal GlcNAc Glc Hep Hep KDO LIPIDO A Abe Glc Gal P KDO P Man Rha Gal n KDO Ein Abe: Abecuosa Man: D-Manosa Rha: L-Rhamnosa Gal: D-Galactosa GlcNAc: N-Acetil-D-Glucosamina Glc: D-Glucosa Hep: L-Glicero-D-Manoheptosa KDO: 3 Deoxi-D-Acido Manooctulosilonico EtN: Etanolamina P: Fosfato Rick,P. E. coli and S. Typhimurim Celular and Molecular Biology. Vol 1, 1987

16 I.- Antígeno somático O CLUSTER DE GENES rfb DEL ANTIGENO O Codifica las enzimas involucradas en la biosíntesis y ensambles del Antígeno O Dentro del cluster se encuentra 3 tipos de genes diferentes 1.- Genes que codifican las enzimas involucradas en las síntesis de azúcares que forman la subunidad O 2.- Genes que codifican transferasas que ensamblan azúcares sustitutivos dentro de la subunidad O 3.- Genes que codifican proteínas involucradas en los pasos del procesamiento y ensamble para la construcción del antígeno O desde la subunidad O, por ej. wzy (polimerasa del antígeno O) y wzx (transportador del antígeno O)

17 I.- Antígeno somático O CLUSTER DE GENES rfb DEL ANTIGENO O S. enterica Serogrupo O:6,14 Fitzgerald. et all. Appl. Environ. Microbiol. 69: , 2003

18 I.- Antígeno somático O EXPRESIÓN N DEL ANTIGENO O Expresión del Antígeno somático O La estructura somática se denomina con la letra O seguida de : y luego de números arábigos separados por comas Por ejemplo: S. Typhimurium O:1,4,[5],12 S. Enteritidis O:1,9,12 Los símbolos s para los factores somáticos determinados por conversión fágica están n subrayados (por ej. 1,9,12) [ ] = los factores O entre corchetes, no subrayados, pueden estar presentes o ausentes sin relación con la conversión fágica. Por ej. factor [5] del grupo O:4 (B). Estructura antigénica O + Estructura Flagelar H Fórmula antigénica (Esquema de Kauffmann-White)

19 II.- ANTÍGENO FLAGELAR H Estructura del antígeno flagelar de S. Typhimurium Rick,P. E. coli and S. Typhimurim Celular and Molecular Biology. Vol 1, 1987

20 II.- ANTÍGENO FLAGELAR H GENES QUE CODIFICAN LOS ANTIGENOS FLAGELARES Salmonella spp En la mayoría de los aislamientos de Salmonella spp, 2 genes son los que codifican los antígenos flagelares flic: Codifica los antígenos de la fase 1 (esta localizado en uno de los operones de la biosíntesis flagelar) fljb: Codifica los antígenos de la fase 2 (esta localizado en una región del genoma que es única para Salmonella spp.) Estos genes están expresados coordinadamente por el mecanismo de variación de fase

21 II.- ANTÍGENO FLAGELAR H VARIACION DE FASE Es la variación reversible de los antígenos H. Ocurre en el género Salmonella (Fase 1 y Fase 2) La gran mayoría de las serovariedades son difásicas: pueden expresar alternativamente antígenos flagelares de dos especificidades.

22 II.- ANTÍGENO FLAGELAR H REPRESENTACION ESQUEMATICA DE LA VARIACION DE FASE FLAGELAR S. enterica Bonfield and Hugehs. J. Bacteriol. 185: , 2003

23 II.- ANTÍGENO FLAGELAR H EXPRESIÓN N DEL ANTÍGENO H Expresión del Antígeno flagelar H Unas pocas serovariedades de Salmonella producen una sola fase flagelar, esas cepas se llaman monofásicas, por ejemplo: Salmonella Enteritidis (9,12:g,m:-) Salmonella Typhi (9,12 [Vi]:d:-) La gran mayoría de las serovariedades tienen dos especificidades en su antígeno flagelar o sea son cepas difásicas; por ejemplo: Salmonella Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2) Salmonella Hadar (6,8:z10:e,n,x) Que expresan: 1.- La fase 1 (identificada en los ej. por las fases: i ó z10, que se denominan con letras separadas por comas) 2.- La fase 2 (identificada en los ej. por las fases: 1,2 y e,n,x que se denominan con arábigos o letras separados por comas ). [ ] = Cuando los factores H están entre corchetes significa que ellos se encuentran excepcionalmente en cepas salvajes. Estructura antigénica O + Estructura Flagelar H Fórmula antigénica (Esquema de Kauffmann-White)

24 Estructura antigénica O + Estructura Flagelar H Fórmula antigénica: O:4,5,12 H:i,12 Esquema de Kauffmann White S. Typhimurium

25 Fenómenos de variación n que afectan la serotipificación Variaciones somáticas Variación de S R (Lisa Rugosa) Variación M N (Mucoide No mucoide) Variación V W (Capsular No capsular) Variación S T R Variación de Forma Variación No fimbriada Fimbriada Variaciones flagelares Variación OH O Variación de Fase

26 VARIACION S R No se puede determinar el Ag O Para obtener colonias lisas: Realizar subcultivos en agar sangre o agar Mueller Hinton Reaislar la cepa Si no es posible revertir la rugosidad: Confirmar la identificación por pruebas bioquímicas Determinar el Ag H VARIACION M N No se puede determinar el Ag O Para obtener colonias no mucoides Reaislar la cepa Si no es posible obtener colonias no mucoides: Confirmar la identificación por pruebas bioquímicas Determinar el Ag H

27 VARIACION V - W El antígeno Vi es un antígeno capsular que se encuentra en Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi C y algunas cepas de Salmonella Dublin SUSPENSION BACTERIANA ANTISUERO Vi ANTISUERO O Capsulada V + - Calentada 1 h a 60 º C ó 30 min. a 100º C - + Variación V - W + +

28 Inversión de Fase Ejemplo: Salmonella Typhimurium (4,5,12.i:1,2) Cultivos de S. Typhimurium 1 2 Flagelos de especificidad H:1,2 Flagelos de especificidad H:i POBLACIÓN BACTERIANA BALANCEADA SE EXPRESAN IGUALMENTE LAS DOS FASES POBLACIÓN BACTERIANA MAYORITARIA EXPRESA FLAGELOS DE ESPECIFICIDAD H:1,2 NO realizar inversión de fase Realizar inversión de fase

29 Flujograma de Inversión de Fase Serotipificación somática O (O: 4,5,12) Serotipificación flagelar H Si la población está balanceada da Fase 1 (H:i) y Fase 2 (H:1,2) Si la población expresa flagelos de fase 1 (H:i) Si la población expresa flagelos de fase 2 (H:1,2) Inversión de fase con antisuero H:i Inversión de fase con antisuero H:1,2 Se expresa fase 2 Se expresa fase 1 Fórmula antigénica: O:4,5,12 H:i:1,2 (Esquema de Kauffmann-White ) Salmonella Typhimurium

30 Flujograma de Serotipifcacion de Salmonella spp. Cepa con características bioquímicas de Salmonella spp. Serotipificación somática Estría en TSA Serotipificación flagelar (aglutinación en lámina) (aglutinación en tubo) Aglutinación con solución salina al 2% Caldo flagelar Negativa Positiva Aglutinación c/ antisueros poliv. flagelares H (4) Aglutinación c/ Cepa Rugosa (2) antisueros poliv. Negativa (5) Positiva somáticos (1) Aglutinación c/ Negativa (3) Positiva antisueros de fases H / factores H (6) Aglutinación c/ antisueros de grupo O Positiva Aglutinación c/ antisueros de factores O Positiva 1 Antisueros polivalentes somáticos: OS-A y OS-B 2.-Para revertir una cepa de la forma rugosa a lisa, se realizan subcultivos en agar sangre o Mueller Hinton. Si no es posible revertir la rugosidad, se debe confirmar la identificación por pruebas bioquímicas y realizar la serotipificación flagelar H. 3.- Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificación somática" 4.-Antisueros polivalentes flagelares: HS-1; HS-A; HS-B; HS-C 5.-Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificación flagelar. 6. Si la serovariedad de Salmonella es difásica y sólo expresa una fase, realizar "Método de inversión de fases" Positiva RESULTADO FINAL

31 Antisueros polivalentes somáticos de Salmonella spp. Antisueros polivalentes O: Estos antisueros sirven para orientar la serotipificación, permitiendo ubicar la cepa en estudio dentro de grandes grupos, que comprenden a varios grupos O del Esquema de Kauffmann White. OS-A :contienen anticuerpos O de los grupos A, B, D1, D2, E1, E4 y L (del Esquema de Kauffmann - White) (O :1,2,12 + 1,4,5,12 +1,9,12 + (9),46 + 3,10 + 1,3, ) OS-B : contienen anticuerpos O de los grupos C1, C2, F, G y H (del Esquema de Kauffmann - White) (O :6,7 + 6,8 + 8, ,13,22 + 1,13,23 + 6,14,24)

32 Antisueros polivalentes flagelares de Salmonella spp. Antisueros polivalentes H HS-1: 1,2 + 1,5 + 1,6 +1,7 + z 6 HSA: a + b+ c+ d + i + z 10 + z 29 HS-B: e,h + e,nx + e,nz 15 + f,g + g,m,s + g,p + m,t HS-C: k +l,v + l,w + r + y + z 4,z 23

33 Esquema de Kauffmann-White M. Y. Popoff et L. Le Minor Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 7th revision. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris, France

34 Nomenclatura de Salmonella spp. Unicamente las serovariedades de Salmonella enterica subespecie enterica (que constituyen más del 99,5 % de los aislamientos de Salmonella) se designan con un nombre, relacionado con el lugar geográfico donde se aisló la primera cepa de la nueva serovaridad. Este nombre se escribe con letras romanas, no en itálica y la primer letra va con mayúscula. Ej. Salmonella enterica subespecie enterica serovaridedad Typhimurium se designa como Salmonella ser. Typhimuirium o Salmonella Typhimurium; Salmonella Oran Las serovariedades de las otras subespecies de Salmonella enterica y las de Salmonella bongori (muy escasas en patología humana y veterinaria) se designan con su fórmula antigénica. Ej. Salmonella IV 50 : b : - ;Salmonella IV 44 : a : -.

35 MUCHAS GRACIAS!!!