PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA (CURSO )

Transcripción

1 PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA (CURSO )

2 PRÁCTICAS A REALIZAR ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA PRUEBA DE BAUER KIRBY (ANTIBIOGRAMA) PRUEBA DE EPSILON (DETERMINACIÓN DE LA CMI) ANÁLISIS CUALITATIVO MUCOSA FARÍNGEA J-1 J-2 J-3 J-4 J-5 J-6 Siembra de Agar Kligler a partir de placa de Agar de MacConkey Siembra de la galería API 20 E a partir de placa de Agar de MacConkey Siembra de una placa de Agar Müeller-Hinton a partir de placa de Agar de MacConkey Siembra de una placa de Agar Müeller-Hinton a partir de placa de Agar de MacConkey Siembra de la galería API STAPH a partir de la placa de Agar Sangre nº 3 Siembra de la galería API STREP a partir de la placa de Agar Sangre nº 3

3 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA IDENTIFICACIÓN DE UNA ENTEROBACTERIA FUNDAMENTO 1. Cada alumno tratará de identificar una enterobacteria (sólo género). 2. Por cada mesa se tratará de identificar una enterobacteria mediante el sistema API 20E (género y especie). METODOLOGÍA A partir de la placa de Agar de MacConkey: Se siembra un tubo de Agar de Kligler. Se prepara una suspensión (de cualquiera de los alumnos pertenecientes a la mesa), y con ella se inocula una galería API 20E.

4 Medio de Kligler Es una prueba múltiple que permite conocer si una determinada bacteria fermenta la glucosa, la lactosa, ambas a la vez o ninguna de ellas. Se puede observar también la producción de gas. Además, sirve para investigar si es capaz de producir sulfhídrico. Medio de cultivo Peptona 20 g/l Lactosa 10 g/l Glucosa 1 g/l Cloruro sódico 5 g/l Sulfato ferroso 0,5 g/l Tiosulfato sódico 0,5 g/l Rojo fenol 0,025 g/l Agar 15 g/l Agua destilada 1 L (ph: 7,4) Pico de flauta Fondo

5 Siembra: con asa o con hilo (fondo en picadura y pico de flauta por estrías). Incubación: horas a 37ºC. Introducir el asa o el hilo sin llegar a tocar el fondo del tubo Hacer estrías en superficie con el asa o con el hilo Retirar el asa o el hilo

6 ANTIBIOGRAMA PRUEBA DE BAUER-KIRBY FUNDAMENTO El método utilizado es el de Bauer-Kirby, un sistema que estandariza las condiciones de la prueba (medio de cultivo, discos, concentración de antimicrobiano, concentración del microorganismo, etc). METODOLOGÍA El medio utilizado es el Agar de Müeller-Hinton, medio de cultivo rico, diseñado especialmente para hacer ensayos de sensibilidad y recomendado por la OMS por no llevar incorporados inhibidores de los antimicrobianos, como, por ejemplo, el PABA (ácido p-amino benzoico), que anula la actividad de sulfamidas y antibióticos.

7 ANTIBIOGRAMA PRUEBA DE BAUER-KIRBY METODOLOGÍA Se prepara una suspensión muy concentrada de bacterias (10 8 /ml) a partir de la propia placa de Agar de MacConkey. El Agar de Müeller-Hinton se siembra con un hisopo estéril. El hisopo se empapa en la suspensión y se escurre sobre la pared del tubo. A continuación, se siembra la placa con estrías muy juntas. Se repite la operación dos veces más, tomando inóculo y cambiando la dirección de siembra, girando la placa un ángulo de 120º, aproximadamente.

8 SIEMBRA DEL AGAR DE MÜELLER-HINTON Y COLOCACIÓN DE LOS DISCOS Se intenta obtener un crecimiento completo en la placa, denominado confluente. Con ayuda de unas pinzas, flameadas en la llama del mechero y dejadas enfriar, se colocan discos de papel impregnados con concentraciones conocidas de los diferentes antibióticos o agentes quimioterapéuticos sobre la superficie del agar.

9 DIFUSIÓN DEL ANTIBIÓTICO El antibiótico difunde radialmente Su concentración disminuye a medida que se va alejando del disco de papel En esa línea circular el antibiótico está en una concentración igual al valor de la CMI Zona superior al valor de la CMI Zona inferior al valor de la CMI

10 LECTURA DEL ANTIBIOGRAMA Tras la incubación de la placa 24 horas a 37ºC, se miden los halos de inhibición de desarrollo y se interpretan de acuerdo a tablas confeccionadas previamente. Los resultados se expresan como: Sensible (S), Intermedio (I) o Resistente (R).

11 La tira E-test incorpora un gradiente exponencial de un antimicrobiano desde uno de sus extremos hasta el otro. PRUEBA DE ÉPSILON (E-TEST) DETERMINACIÓN DE LA CMI CMI A medida que el microorganismo se multiplica, el antimicrobiano difunde hacia el exterior de la tira; la velocidad de difusión es proporcional a la concentración en un punto concreto, lo que determina la zona de inhibición. Permite calcular la CMI (concentración mínima inhibitoria) a partir de la escala que lleva incorporada la banda.

12 La placa se siembra igual que en el caso anterior con los discos, a partir de una de las suspensiones cualquiera preparadas Con ayuda de unas pinzas se coloca una tira (con los números hacia arriba) en el centro de la placa sobre la superficie del agar. CMI = 2 mg/l Se utiliza una tira E-test por cada mesa de trabajo. De esta forma los 12 alumnos llevarán a cabo la determinación de un único valor de la CMI. CMI = 0,64 mg/l

13 ANÁLISIS CUALITATIVO DE FARINGE IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS FUNDAMENTO Identificar los géneros de los cocos Gram positivos sembrados en cada sector (diferenciar Staphylococcus, Micrococcus y Streptococcus). METODOLOGÍA A partir de la placa 3 de agar sangre, se realiza la prueba de la catalasa a cada sector. Staphylococcus: catalasa positiva. Micrococcus: catalasa positiva. Streptococcus: catalasa negativa. Por cada mesa (grupo de 12 alumnos) se seleccionará un posible estafilococo (o micrococo) o un posible estreptococo para identificarlos (género y especie) mediante los sistemas API STAPH y API STREP, respectivamente.

14 Prueba de la catalasa Fundamento Detectar la presencia del enzima catalasa. Catalasa H 2 O 2 H 2 O + O 2 Procedimiento Resuspender la bacteria problema en agua oxigenada al 3% sobre un portaobjetos (o sobre colonias en una placa de agar). Prueba positiva La presencia del enzima se detecta por la aparición casi inmediata de burbujas provocadas por el desprendimiento de oxígeno.

15 Sistemas comerciales de identificación bacteriana Necesidad de mayor rapidez en diagnóstico. Equipos y programas informáticos (ventajas). Sistemas manuales Sistema API Muchos tipos API 20E (enterobacterias) API STAPH (estafilococos) API STREP (estreptococos)

16 Galería API Detalle de un tubo Cúpula Tubo Aceite de parafina

17 Inoculación del API 20E El cultivo elegido será el que mayor probabilidad tenga, entre todos los del grupo, de pertenecer a una enterobacteria (bacilos Gram negativos, oxidasa negativa, procedentes de una colonia seleccionada a partir de Agar de MacConkey o Agar Cromogénico). A partir de la placa de Agar de MacConkey se preparará una suspensión densa en agua destilada estéril. Preparación y llenado de la galería Añadir agua de grifo a la cubeta de plástico hasta llenar todos los alvéolos. Tirar el agua sobrante. Sacar la galería de la bolsa y colocarla en la cubeta. Inclinar la cubeta para inocularla. Aspirar el inóculo con la pipeta Pasteur de plástico y llenar cada tubo apoyando la punta de la pipeta en el borde del tubo, procurando no formar burbujas. IND Llenar sólo el tubo. ADH CIT Llenar el tubo con el inóculo y añadir unas gotas de parafina en la cúpula. Llenar el tubo y la cúpula. Incubar la galería 24 horas a 37ºC.

18 Inoculación de la galería API STAPH El cultivo elegido será el que mayor probabilidad tenga, entre todos los del grupo, de pertenecer al género Staphylococcus o al género Micrococcus. Preparación y llenado de la galería Añadir agua de grifo a la cubeta de plástico hasta llenar todos los alvéolos. Tirar el agua sobrante. Sacar la galería de la bolsa y colocarla en la cubeta. Inclinar la cubeta. Aspirar el inóculo con la pipeta Pasteur de plástico y llenar cada tubo apoyando la punta de la pipeta en el borde procurando no formar burbujas. ADH Llenar el tubo con el inóculo y añadir unas gotas de parafina en la cúpula. Incubar la galería 24 horas a 37ºC.

19 PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN PARA API STAPH El cultivo del sector seleccionado se suspende en el medio contenido en la ampolla API STAPH MEDIUM: 1. Romper la ampolla y colocarla en el Densimat. 2. Recoger inóculo del sector seleccionado con un hisopo y suspenderlo en el medio hasta conseguir una concentración equivalente a 0,5 en la escala de McFarland. Realizar la inoculación con pipetas Pasteur de forma idéntica a la utilizada para inocular el API 20 E.

20 PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN Preparar una suspensión equivalente a 0,5 en la escala de MacFarland (10 8 bacterias/ml) con la ayuda de DENSIMAT

21 Inoculación de la galería API STREP El cultivo elegido será el que mayor probabilidad tenga, entre todos los del grupo, de pertenecer al género Streptococcus. Preparación y llenado de la galería La galería se prepara como en los dos casos anteriores y la inoculación se lleva a cabo con una pipeta Pasteur de plástico apoyando la punta en el borde procurando no formar burbujas. IND Llenar sólo el tubo. ADH CIT Llenar el tubo con el inóculo y añadir unas gotas de parafina en la cúpula. Llenar el tubo y la cúpula. Incubar la galería 24 horas a 37ºC.

22 PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN PARA API STREP Abrir una ampolla conteniendo 2 ml de agua destilada y colocarla en el Densimat. Con un hisopo recoger inóculo del sector seleccionado de la placa de Agar Sangre Nº 3 y resuspender hasta conseguir una suspensión muy densa (4 McFarland). Con esta suspensión inocular los 10 primeros tubos (9 pequeños y 1 grande). Abrir una ampolla de GP Medium y verter su contenido sobre el resto de suspensión. Sembrar con esta suspensión los siguientes tubos.