FACULTAD DE MEDICINA DE SEVILLA PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA MEDICA. PRIMER CICLO

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1 FACULTAD DE MEDICINA DE SEVILLA PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA MEDICA. PRIMER CICLO DIAGNOSTICO DIRECTO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS Día 1: Día 2: Día 3: Día 4: Recogida de muestras. Medios de cultivo. Tipos de Siembra Observación macroscópica y microscópica de la siembra Identificación bioquímica. Antibiograma. Lectura e interpretación de las pruebas bioquímicas y del antibiograma Nomenclatura Bacteriana. Taxonomía Bacteriana

2 Día 1. Recogida de muestras. Medios de cultivo. Tipos de Siembra Recogida de muestra: Para un estudio microbiológico, lo primero y más importante es la recogida de una buena muestra, ya que de esto va a depender que los resultados obtenidos sean exactos. Normas generales 1. La muestra debe recogerse antes de la implantación de una terapia de antimicrobiana. Ya que la presencia de antibiótico puede falsear una posible infección. 2. Hay que tener en cuenta el estadio de la enfermedad, así la toma de sangre para hemocultivo debe realizarse cuando está subiendo la fiebre, ya que éste es el momento en el que hay más posibilidad de encontrar microorganismos en sangre y en mayor cantidad. 3. En algunas muestras se necesita la colaboración activa del paciente, por ej. Esputo. 4. La muestra debe tomarse en cantidad suficiente y ser representativa de la lesión. 5. Debe ir acompañada de una orientación clínica, para realizar el procesamiento adecuado en cada caso. 6. La rapidez de la entrega de la muestra al laboratorio es fundamental, ya que algunos microorganismos son muy sensibles y puede que mueran o sean enmascarados antes de ser procesadas la muestra. Ej. Shigella es inhibida en poco tiempo por el resto de la flora intestinal. 7. Rotulación de la muestra para evitar errores en la manipulación. Supervisión del médico!! 2

3 Normas especiales Dependen del tipo de muestra. LCR: Debe ser enviado inmediatamente al laboratorio, sobre todo si se sospecha una meningitis meningocócica, ya que éste germen tiende a lisarse. Incubación a 37ºC hasta su cultivo, igual que la sangre. Orina: Micción espontánea. Debe recogerse la primera de la mañana, después de un lavado de los genitales para evitar la contaminación con gérmenes que constituyen la flora normal de piel. Debe desecharse la primera porción de la micción, así eliminamos los gérmenes que podrían encontrarse en uretra y que darían lugar a resultados erróneos. La orina debe enviarse rápidamente al laboratorio ya que, al ser un excelente medio de cultivo, los microorganismos como por ejemplo E. coli se pueden multiplicar rápidamente, y para cuando la muestra vaya a ser procesada haber alcanzado una concentración en orina compatible con la aceptada para el diagnóstico de infección del tracto urinario ( 10 5 unidades formadoras de colonias/ml), cuando en el momento de la recogida de la muestra la concentración era muy inferior a esta cifra. En caso de que no pueda ser enviada al laboratorio inmediatamente, mantener a 4º C, pues a esta temperatura las bacterias no se multiplican. Medios de cultivo Se denomina medio de cultivo a todos aquellos sustratos sólidos, líquidos o semisólidos que favorecen y permiten el desarrollo de los microorganismos en el laboratorio. Composición 1. Elementos básicos: Carbono. Normalmente lo proporcionan los azúcares. 3

4 Hidrógeno y oxígeno. Nitrógeno. Lo proporcionan las peptonas y aminoácidos 2. Oligoelementos. Son el Na, K, Fe, Mg, Mn, etc. que se administran al medio en forma de sales. ClNa actúa regulando la presión osmótica. Extracto de carne. Constituye una de las bases más importantes del medio de cultivo por su riqueza nutritiva. Extractos de levadura. Es un factor de crecimiento importante para la mayoría de los microorganismos incluso para los más exigentes. Clasificación 1. Según su estado físico: Medios líquidos: Favorecen el crecimiento de microorganismos pero no pueden utilizarse para el aislamiento de gérmenes y la obtención de colonias, sino para observar el tipo de respiración; aerobios estrictos, anaerobios estrictos, microaerófilos y anaerobios facultativos. Medios sólidos: Llevan en su composición una sustancia solidificante que es el agar. Es una sustancia polisacarídica, obtenida de algas marinas y cuya propiedad fundamental es la de formar gel. La gelatina también es una sustancia solidificante, en este caso de naturaleza proteica, pero tiene el inconveniente de que algunos gérmenes actúan sobre ella licuándola por la acción de enzimas proteolíticos producidos por los mismos. Las sustancias solidificantes se añaden al medio en una proporción del 1-2%. 2. Según el crecimiento bacteriano que permitan. 4

5 Medios enriquecidos. Son aquellos que contienen una serie de sustancias que favorecen el crecimiento de todos los microorganismos: Columbia. Medios de enriquecimiento. Son aquellos que llevan un sustrato determinado para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos: Caldo Selenito. Medios selectivos y diferenciales. Son aquellos que llevan sustancias inhibitorias que impiden el crecimiento de determinados microorganismos. Ej. Levine, MacConkey. Muestras que se van a procesar en las prácticas: ORINA FROTIS NASAL Medios que se usan en la práctica. COLUMBIA: Está compuesto de extracto de carne, extracto de levadura, peptonas, glucosa, NaCl y sangre (ésta favorece el crecimiento de microorganismos. Patógenos para el hombre). MACCONKEY: En su composición hay sales biliares y violeta de genciana (inhibidores del crecimiento de los microorganismos Gram positivos), por lo que es un medio selectivo, pero también es un medio diferencial (permite conocer si las bacterias que crecen son capaces de fermentar o no la lactosa por el tipo de colonia que presenten, los fermentadores de lactosa dan colonias de color rosa y los no fermentadores dan colonias no coloreadas). TIOGLICOLATO: Medio semisólido compuesto de Cistina (aminoácido azufrado que actúa con función reductora) tioglicolato, agar y resazurina que se colorea de rosa en presencia de oxígeno. Este medio sirve para conocer si los 5

6 microorganismos son aerobios estrictos, anaerobios estrictos, microaerófilos o anaerobios facultativos. Inoculación o Siembra: ORINA: Se inocularán los medios de cultivo rotulados con número impar. * Tioglicolato: Recoger una gota con el asa previamente esterilizada en la llama del mechero, e introducir en el tubo hasta el fondo y sacarlo. Flamear la boca del tubo antes y después de introducir el asa. * Columbia: Depositar una gota de orina recogida con el asa sobre el centro de la superficie del medio. Realizar una siembra en tapiz que permitirá valorar la concentración de bacterias que existe en la orina. * MacConkey: Depositar una gota de orina recogida con el asa sobre un extremo de la superficie del medio. Hacer estrías muy juntas sobre la superficie, hasta haber cubierto aproximadamente un tercio de la superficie. Volver a esterilizar el asa y tocando las últimas estrías comenzar a hacer estrías en otra dirección y más separadas entre sí, con objeto de obtener colonias aisladas. Este tipo de siembra se denomina siembra por agotamiento o en aislamiento. FROTIS NASAL: se inocularán los medios rotulados con número par. * Tioglicolato: Una vez tomada la muestra con la torunda, introducirla en el tubo hasta el fondo y sacarla. Flamear la boca del tubo antes y después de introducir la torunda. * Columbia: En el borde de la placa, hacer la inoculación con la torunda, haciendo estrías muy juntas hasta cubrir aproximadamente un tercio de su superficie. A partir de este 6

7 punto y con el asa previamente esterilizada y enfriada continuar la siembra, tocando las últimas estría y realizando estrías en otra dirección más separadas (siembra por agotamiento). TODOS LOS MEDIOS DE CULTIVO SERÁN INCUBADOS EN LA ESTUFA A 35ºC DURANTE 24 HORAS. 7

8 DIA 2. Observación macroscópica y microscópica de la siembra Observación macroscópica Medios sólidos: Especificar tipos de colonias, color, brillo, hemólisis, bordes, diámetro... En el caso del medio de Columbia sembrado en recuento correspondiente a la muestra de orina hacer una estimación de la concentración de bacterias en la muestra suponiendo que hubiésemos inoculado 10 μl. Tioglicolato: Especificar formas de crecimiento y tipos de respiración. Observación microscópica: Tinciones Tinción de Gram Esta tinción nos sirve para clasificar a los microorganismos en dos grandes grupos, Gram positivos y Gram negativos. A la vez podemos observar la forma de las bacterias: cocos, bacilos, etc. y cómo se agrupan: parejas, cadenas, etc. Fundamento: La tinción permite dividir las bacterias en dos grandes grupos, Gram positivas y Gram negativas. Se cree que la diferencia de espesor, la concentración de cargas y la composición química de la pared celular, son las responsables de la coloración final con la que permanecen las bacterias teñidas por este método. Las bacterias Gram positivas permiten que un colorante básico (violeta de genciana) se una a las estructuras de la pared, la membrana y el citoplasma; esta unión se refuerza con la adición de lugol. La acción decolorante del alcohol, se ve impedida por las características de la pared celular antes mencionadas de forma que la bacteria permanece teñida con el colorante inicial; la adición de un segundo colorante (safranina) no modifica dicha coloración y la bacteria se observará con una tonalidad azul-violeta. 8

9 En las bacterias Gram negativas, el alcohol arrastra al colorante inicial (por la distinta naturaleza de la pared celular) de manera que la adición de safranina tiñe finalmente la bacteria de color rojo. Técnica. Suspensión Extensión Fijación. Para que las proteínas queden fijadas al porta pasaremos el porta tres veces por la llama del mechero (fijación con calor). Dejar enfriar antes de teñir. Cubrir el porta con Violeta de genciana y dejar actuar 1 min. Lavar con agua. Lugol. Actúa de mordiente formando un complejo con el violeta de genciana que hace que se fije al colorante. 30 seg. Lavar con agua. Decolorar con alcohol seg. Lavar con agua para impedir que el alcohol siga ejerciendo su acción. Safranina. Colorante de contraste. 1 min. Lavar con agua. Secar. Observar al microscopio con objetivo de inmersión. Tinción de Ziehl-Neelsen Esta tinción se utiliza para diagnóstico de BAAR (Bacilos ácido alcohol resistentes) como Mycobacterium tuberculosis. Fundamento. Estos microorganismos poseen en su membrana ácidos micólicos, lo que determina que sean muy difíciles de teñir, pero una vez teñidos es muy difícil decolorarlos, de forma que resisten a la acción decolorante de la mezcla de ácido clorhídrico y etanol. Técnica Suspensión 9

10 Extensión Fijación Fuchina básica. Calentar hasta la emisión de vapores durante 6 minutos (3 veces) con lo cual se favorece la penetración del colorante a través de la cubierta cérea de estos microorganismos. Dejar enfriar Decolorar con etanol- ácido clorhídrico Lavar con agua Azul de metileno 1 minuto (colorante de contraste) Lavar con agua Secar. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión Los BAAR se observan de color rojo sobre un fondo azul. Esta tinción no la realizaremos en prácticas pero podremos observar extensiones con BAAR al final de la práctica. 10

11 DIA 3. Identificación bioquímica. Antibiograma. La identificación bioquímica debe hacerse partiendo de un cultivo puro o colonias perfectamente aisladas. Tras observar la morfología de las colonias, el tipo de crecimiento en medio líquido, la morfología bacteriana y la tinción de Gram, se procede a la identificación empleando diversas pruebas bioquímicas. Pruebas para cocos Gram positivos (frotis nasal): Catalasa Coagulasa Pruebas para bacilos Gram negativos (orina): TSI Urea Prueba de catalasa: Los microorganismos que tienen la enzima catalasa descomponen el agua oxigenada en agua y oxígeno. Al depositar sobre una colonia bacteriana (de un medio sin sangre) una gota de agua oxigenada se observarán burbujas (de oxígeno) si la bacteria produce catalasa. Prueba de coagulasa: La coagulasa es una enzima que tiene la facultad de coagular las proteínas séricas del plasma. Se utiliza para la identificación de estafilococos. Composición del medio: Infusión cerebro-corazón, TSA, manitol, púrpura de bromocresol y suero humano. Forma de siembra: Tomar una colonia y hacer una estría radial en la placa. Lectura: Los microorganismos que son coagulasa y manitol positivos dan un cerco amarillo con precipitado. Los que fermentan el manitol pero son coagulasa negativos dan un halo amarillo pero no precipitado. Los que no 11

12 fermentan manitol y son coagulasa negativos, no producen ni halo ni precipitado. TSI (Triple Sugar Iron): Composición: tres azúcares Glucosa (al 0.1%), Lactosa (al 1%) y Sacarosa (al 1%). más sulfato ferroso, tiosulfato sódico y rojo fenol como indicador. ph ácido color amarillo; ph básico color rojo. Los microorganismos que fermentan la glucosa amarillean el medio sólo en la base, ya que la producción de ácido es limitada, al ser la concentración de glucosa en el medio muy baja. Los que además fermentan los otros azúcares lo amarillean tanto en la base como en el pico. Los no fermentadores hacen que el medio se vuelva más rojo. También se puede observar la producción de gas que se manifiesta por la formación de burbujas en el medio y la producción de SH 2 a partir del tiosulfato a sulfhídrico y luego sulfuro ferroso que es de color negro. Forma de siembra: Tomar una colonia aislada con un asa, pinchar el medio alcanzando la parte inferior del mismo; sacar el asa e inocular la superficie de la lengüeta. Prueba de la ureasa: La ureasa es una enzima que desdobla la urea produciendo amoníaco. Esta sustancia de naturaleza básica eleva el ph del medio haciendo virar el color del indicador de ph. Composición: medio base, agar, urea y rojo fenol. Forma de siembra: Extender la colonia sobre la lengüeta del medio. Interpretación: Rosa ureasa positivo. Amarillo ureasa negativo. Antibiograma 12

13 El antibiograma es el método usual para determinar la sensibilidad in vitro de un microorganismo frente a los antimicrobianos. El estudio de la sensibilidad antimicrobiana de las bacterias es necesario porque el espectro de actividad de los antimicrobianos es limitado y las bacterias tienen capacidad para desarrollar resistencia. Para ello es necesario conocer los conceptos concentración mínima inhibitoria (CMI), que es la menor concentración de antimicrobiano capaz de impedir el crecimiento de un microorganismo en unas condiciones normalizadas, y concentración mínima bactericida (CMB) que es la menor concentración de antimicrobiano capaz de destruir el 99,9% de una muestra inoculada en unas condiciones normalizadas. El estudio de la CMI es el que se realiza de forma habitual en los laboratorios de microbiología. Para llevarlo a cabo se utilizan procedimientos de referencia y cepas control que proporcionan a estos métodos unos resultados reproducibles, comparables y que permiten clasificar los microorganismos en diferentes categorías: a) sensible: Cuando la CMI de un antibiótico para una bacteria se puede conseguir in vivo con dosis terapéuticas y la experiencia ha demostrado su eficacia b) resistente: Cuando el microorganismo no es inhibido por las concentraciones que normalmente se pueden obtener. c) intermedio: Cuando las bacterias se inhiben a concentraciones que no se alcanzan con dosis terapéuticas, pero que pueden alcanzarse con dosis más altas sin que sean tóxicas ó cuando el antibiótico se encuentra a altas concentraciones en el lugar de la infección, generalmente en las vías de eliminación. El medio de cultivo en el que se realizan la mayoría de los antibiogramas (excepto para bacterias exigentes) es el medio Muëller-Hinton (extracto de 13

14 carne, aminoácidos y almidón. Este medio se puede usar en estado líquido o sólido. Métodos 1.- Difusión en agar, que se puede realizar: a) disco-placa. Con este sistema se puede probar la eficacia de varios antimicrobianos al mismo tiempo realizando una siembra de una suspensión bacteriana, con un inóculo normalizado sobre la superficie de un medio sólido, colocando sobre la misma discos de papel impregnados de una cantidad conocida de antibiótico. Por el agua del medio los antimicrobianos difunden y se crea un gradiente de concentraciones decrecientes a medida que nos alejamos del disco. Tras un periodo de incubación se obtiene, alrededor del disco, una zona de inhibición del crecimiento bacteriano. La valoración del halo se hace por patrones obtenidos de forma que se hayan correlacionado la CMI, el diámetro del halo de inhibición y la carga del antibiótico del disco. Los resultados se expresan en términos de categoría clínica (S, I, R). Es un método sencillo y útil para determinar la sensibilidad de microorganismos de crecimiento rápido, no se debe usar en bacterias de crecimiento lento y anaerobios. Es el método que vamos a utilizar en las prácticas. b) test epsilon (E test). Es un método que utiliza tiras de plástico que contienen un gradiente de antibiótico para la determinación cuantitativa de la sensibilidad o resistencia de los microorganismos. El fundamento es el mismo que el del método disco-placa. Es una técnica sencilla que puede ser utilizada en la mayoría de los microorganismos (aerobios, anaerobios y levaduras). 2. Dilución. Son los métodos cuantitativos de referencia para determinar la sensibilidad y resistencia de las bacterias. Consiste en determinar el crecimiento de una bacteria en presencia de concentraciones crecientes de un antibiótico. Se pueden realizar en medio sólido o líquido; este último en forma de macrodilución en tubo o microdilución en placas de plástico con múltiples 14

15 pocillos. En los medios líquidos, cuando las bacterias se multiplican aparece turbidez, pero cuando el antibiótico inhibe el crecimiento el medio no se vuelve turbio; la dilución del antibiótico correspondiente al primer tubo o pocillo en que no existe crecimiento es la CMI. A partir de los tubos, donde no hay crecimiento se puede determinar la CMB, resembrando el contenido de estos tubos sobre un medio de cultivo y observando si existe o no desarrollo de colonias. Métodos mecanizados y automatizados La introducción de estos sistemas ha relegado a los métodos anteriores en el uso cotidiano del laboratorio de microbiología. La mayoría emplea sistemas de microdilución y la lectura se hace determinado el crecimiento bacteriano por espectrofotometría y nefelometría. La lectura se realiza de forma automática o semiautomática y puede ofrecer la información en forma de CMI o definir si la bacteria es sensible, resistente o intermedia. En todos estos sistemas la interpretación de los resultados la realiza un ordenador que llevan incorporado. La determinación de la sensibilidad de bacterias como micobacterias, treponemas, clamidias, micoplasmas y rickettsias, por tratarse de microorganismos con unas características muy especiales, requieren técnicas complejas. Técnica de difusión con discos a realizar en prácticas: Se prepara una suspensión bacteriana con una turbidez equivalente al 0,5 de McFarland en solución salina. Se introduce una torunda en dicha suspensión y con la torunda se hace una siembra en tapiz en la superficie del medio. Sobre ella se colocan los discos de antibióticos, que llevan una carga determinada. Se incuba a 37º C durante horas. Haremos un antibiograma al bacilo Gram negativo y otro al coco Gram positivo. Lectura e interpretación del antibiograma: Con una regla milimetrada se miden los diámetros de los halos de inhibición que aparezcan alrededor de los discos de antimicrobianos. Los resultados se 15

16 comparan con unas tablas en las que se correlacionan diámetros de halo con categorías clínicas (S, I, R). 16

17 DIA 4. Lectura e interpretación de las pruebas de identificación bioquímica y Antibiograma. NOMENCLATURA BACTERIANA. TAXONOMIA BACTERIANA TAXONOMIA BACTERIANA La taxonomía se define como la ciencia de la clasificación biológica. En principio se utilizó una clasificación filogenética pero se abandonó por la dificultad de establecer relaciones evolutivas. La taxonomía microbiana se encuentra actualmente en un proceso de cambio continuo, debido a la aplicación de técnicas de análisis molecular para el estudio de los microorganismos que aportan nueva y abundante información que permite la definición de nuevos criterios de clasificación. Se han utilizado distintos enfoques: 1. Enfoque clásico: Se valoran características estructurales y morfológicas (forma celular, movilidad, flagelos, esporas...) Estas son más estables e independientes del medio externo que las características fisiológicas y bioquímicas por lo que tienen más peso a la hora de clasificar los microorganismos. 2. Enfoque Adamsoniano: Es una taxonomía numérica en la que todas las características tienen la misma importancia. Requiere el uso de ordenadores. 3. Enfoque genético o molecular: Las características fenotípicas son expresión de un gran número de genes, que son el ADN. Estudiando este, se pueden clasificar los microorganismos más correctamente. Se estudian también diversas propiedades: a. Composición de bases del ADN: Índice G + C 17

18 b. Porcentaje de hibridación de los ácidos nucleicos de dos o más microorganismos. c. Secuenciación. NOMENCLATURA BACTERIANA. Consiste en la asignación de nombres a los grupos taxonómicos. A cada especie se le asigna un primer nombre que se refiere al género. Suele ser una palabra latina o latinizada basada en la morfología del microorganismo, el nombre del descubridor u otro carácter diferencial. Se escribe con mayúsculas. El segundo término es el de la especie y suele ser un adjetivo descriptivo del mismo, que se refiere al color, producción de enfermedad, descubridor... Se escribe con minúsculas. Tanto el género como la especie se escriben en cursiva ó subrayado. Ej. Bacillus anthracis. Bacillus: Bacilo Anthracis: Ántrax (carbunco) Shigella: Shiga (científico japonés descubridor) La nomenclatura viene regulada por el International Committee on Systematic and Evolutionary Bacteriology (ICSB) a través del International Code on Nomenclature of Bacteria (ICNB). La lista aprobada de denominaciones bacterianas se publica y actualiza periódicamente desde 1980 en el International Journal of Systematic Bacteriology (IJSB), en su Approbed List of Bacterial Names. El Manual Bergey es un tratado que se ocupa de la identificación y clasificación de las bacterias. Su reconocimiento y prestigio mundial lo han convertido en la referencia y consulta obligada de todos los microbiólogos interesados en taxonomía e identificación. 18

19 Bergey s Manual En 1923, David Bergey, catedrático de bacteriología en la Universidad de Pennsylvania, y cuatro colaboradores más, publicaron un manual sobre características de las bacterias de interés médico conocidas hasta entonces, que podía utilizarse para la identificación bacteriana. Este manual, el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, ha sido utilizado en muchos laboratorios de Microbiología de todo el mundo y ha ido actualizándose a lo largo de los años, hasta que apareció la novena y última edición en En 1984, se publicó la primera edición de un manual enfocado más a la clasificación que a la identificación: el Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Esta publicación constaba de cuatro volúmenes. La clasificación propuesta por esta primera edición del Bergey's Manual of Systematic Bacteriology está basada en la tinción de Gram. Así, agrupa a todas las bacterias en un solo Reino: el Procaryotae, en el que se reconocen cuatro divisiones: Gracilicutes (procariotas, con pared celular fina, gramnegativas), Firmicutes (procariotas, con pared celular gruesa, grampositivas), Tenericutes (procariotas, sin pared celular) y Mendosicutes (procariotas filogenéticamente anteriores a las divisiones mencionadas, como las arquebacterias y otras). Ha habido un progreso considerable en el campo de la taxonomía bacteriana desde 1984, el año de la publicación del primer volumen del Bergey's Manual of Systematic and Bacteriology. El número de especies nombrada se ha duplicado, y hay más de 200 nuevos géneros descritos. En particular, el análisis del rrna, del DNA y de las proteínas, ha hecho posible el análisis filogenético de las bacterias. A consecuencia de ello, la segunda edición del Bergey's Manual of Systematic Bacteriology es fundamentalmente filogenética en vez de fenotípica, y por consiguiente, muy diferente de la primera edición. En 2001 apareció el primero de los cinco volúmenes de la segunda edición del 19

20 Bergey's Manualof Systematic Bacteriology. En 2005 se publicó el volumen 2 y en 2009 se publicó el volumen 3. Los volúmenes 4 y 5 están previstos para este año A diferencia de la primera edición, la clasificación de los procariotas se estructura en dos dominios, Archaea y Bacteria. Nuestro interés se centra en el Dominio Bacteria que posee un total de 25 Phylum. Aunque la edición completa no está disponible, conocemos la organización de su estructura, que se puede consultar en la página web Es la siguiente: Volumen I: Trata del dominio Archaea en su totalidad y de algunas bacterias Gram negativas especiales, como las Cianobacterias. En este volumen no hay casi ninguna bacteria de importancia clínica. Volumen II: Proteobacterias, bacterias Gram negativas. Dividido en cinco secciones (alfa, beta, delta, gamma y épsilon proteobacterias), el reino Proteobacteria agrupa a la mayor parte de las bacterias Gram negativas de importancia clínica. Neisseria, Brucella, Legionella, Pseudomonas, Haemophilus, Campylobacter y Enterobacterias, pertenecen a este reino. Volumen III: Tratá sobre los Firmicutes, grupo de Gram positivos con bajo contenido en G+C. Aquí están géneros como Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium y Bacillus Volumen IV: Contendrá una sola sección que agrupará a todos los Gram positivos con alto 20

21 contenido en G+C Los géneros más conocidos de este volumen son Mycobacterium y Corynebacterium. El Volumen V: Trata de otras bacterias Gram negativas (Actinobacterias), agrupadas en ocho secciones diferentes. No tienen ningún factor en común. Los géneros más importantes desde el punto de vista clínico son Chlamydia, Treponema, Borrelia y Bacteroides El último índice taxonómico publicado de la clasificación de bacterias se actualiza periódicamente y está disponible en la página web del Manual Bergey: (Taxonomics outlines Release 5.0 May 2004) También en la página se puede ver la clasificación taxonómica actualizada de todos los seres vivos, incluso de virus. 21

22 PLAN DE ACTUACIÓN EN CASO DE ACCIDENTE EN EL LABORATORIO DE PRACTICAS DE ALUMNOS Ante un derrame Usar guantes Los residuos derramados se empaparán en papel secante. El papel utilizado se desechará en el contenedor de residuos. Limpiar la superficie con lejía (las botellas de lejía están situadas en la ultima banca) Ante salpicadura Lavarse con agua y jabón Si la salpicadura se ha producido en el ojo, lavar de manera abundante con suero salino (existe una botella con suero salino en la última banca) Ante una quemadura Lavar la zona afectada con agua No quitar la ropa si está pegada a la piel Acudir a urgencias Ante un fuego Cortar el gas Usar los extintores Retirar los productos inflamables NOTA: No realizar nunca la tinción con el mechero encendido. 22

23 GESTION DE RESIDUOS EN EL LABORATORIO El material contaminado, (placas, tubos, guantes y papel contaminado) se deposita en los contenedores de residuos biológicos con bolsas autoclavables. Posteriormente serán esterilizados en el autoclave. Las torundas, pipetas pasteur y puntas de pipetas. se depositan en los vasos de precipitado autoclavables. Posteriormente serán esterilizados en el autoclave. El material contaminado cortante o punzante y no plástico, se deposita en los contenedores amarillos (portas de cristal y agujas). Estos residuos son retirados por la entidad gestora correspondiente (Universidad) Los restos de basura normal (papel de las manos, folios, etc) se depositan en el contenedor negro de basura normal y posteriormente en los contenedores urbanos. 23

24 IMAGENES RELACIONADAS CON EL PRIMER CICLO DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA Esterilización del asa mediante flameado Inoculación de medio de cultivo sólido Siembra en tapiz, césped o recuento 24

25 Inicio siembra Esterilizar el asa Siembra en aislamiento o por agotamiento Tipos de crecimiento en Tioglicolato: 1. Aerobio estricto 2. Anaerobio facultativo 3. Anaerobio facultativo 4. Anaerobio estricto Crecimiento de bacilos gram negativos en Agar MacConkey: 1. Colonias rosa: fermentador de lactosa 2. Colonias sin color: no fermentador de lactosa 25

26 Pasos de la tinción de Gram Prueba de la Ureasa 26

27 Distintos tipos de T.S.I.: C. Medio sin inocular 1. No fermentador 2. Lactosa neg. SH 2 neg. Gas neg. 3. Lactosa neg. SH 2 pos. Gas neg. 4. Lactosa pos. SH 2 neg. Gas pos. Galerías comerciales para identificación bioquímica de bacterias ç Prueba de la catalasa 27

28 Antibiograma mediante la técnica de difusión con discos Lectura de los halos de inhibición en la difusión con discos Antibiograma mediante técnica de dilución en caldo. Determinación de la Concentración mínima inhibitoria (CMI) 28

29 Epsilon- test Elipse de inhibición alrededor de tira de E-test 29