UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA

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1 UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA ESTUDIO QUÍMICO Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS ANTOCIANOS PRESENTES EN LOS FRUTOS DE MAQUI MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADO EN TECNOLOGÍA MÉDICA Alumna: Verónica Olate Olave Profesor Guía: Dr. Iván Razmilic Bonilla TALCA-CHILE

2 Al Alfa y Omega, al Inmortal. Con todo el corazón, dedico esta memoria: A mis padres, Washington y Verónica, A mis hermanas Keila y Noemí, A mis tíos Benjamín y Pabla, Samuel y Eliana Y a mi querido abuelo, don Benjamín Olave Román. 1

3 AGRADECIMIENTOS Mi más sincero agradecimiento a: Dr. Iván Razmilic Bonilla, profesor guía de esta tesis, quien hizo posible su realización. Gracias por su apoyo, por su disposición, y por su gran ayuda en la recolección de los frutos de maqui. Don Sergio Reyes, por la desinteresada entrega de sus conocimientos, por su colaboración, por su compromiso y por su grata compañía durante el verano en que se realizó esta investigación. También gracias a su esposa, señora Irene, por la sonrisa obsequiada cada mañana en el laboratorio. Todo el equipo del Instituto de Química de Recursos Naturales, por hacer muy gratas mis largas jornadas de trabajo en el laboratorio. Don Mauricio Ponce Donoso, por su incalculable ayuda en el análisis estadístico de los resultados de este trabajo. Mi padre, mi madre y mi hermana Keila, por su preocupación y agradable compañía durante la búsqueda de los preciados frutos, y por ayudarme en la ardua tarea de desgranar maqui. 2

4 INDICE DE CONTENIDOS PÁGINA DEDICATORIA 1 AGRADECIMIENTOS. 2 ÍNDICE DE CONTENIDOS. 3 ÍNDICE DE FIGURAS.. 6 ÍNDICE DE TABLAS RESUMEN INTRODUCCIÓN OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ESTRÉS OXIDATIVO DEFINICIÓN MECANISMOS DE PROTECCIÓN CONTRA EL ESTRÉS OXIDATIVO ANTIOXIDANTES CLASIFICACIÓN DE LOS ANTIOXIDANTES ANTIOXIDANTES PREVENTIVOS ANTIOXIDANTES SECUNDARIOS ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICOS ANTIOXIDANTES NO ENZIMÁTICOS ESTUDIO DE LOS OXIDANTES Y ANTIOXIDANTES DETERMINACIÓN DE LOS PRODUCTOS TERMINALES DE LA ACCIÓN SOBRE BIOMOLÉCULAS DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE 19 3

5 4.3. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE FLAVONOIDES POLIFENÓLICOS DERIVADOS DE FRUTAS Y VERDURAS ANTOCIANOS GENERALIDADES AISLAMIENTO DE ANTOCIANOS APLICACIÓN DEL ESTUDIO DE LOS ANTOCIANOS EL MAQUI: ANTECEDENTES GENERALES DESCRIPCIÓN DEL MAQUI UTILIDADES COMPOSICIÓN ANTOCIANINAS EN FRUTOS DE MAQUI.. 5. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL VEGETAL 5.2. PREPARACIÓN DE UN EXTRACTO DE FRUTOS DE MAQUI PURIFICACIÓN DEL EXTRACTO DE FRUTOS DE MAQUI FRACCIONAMIENTO DE ANTOCIANINAS 5.5. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO DE FRUTOS DE MAQUI CUANTIFICACIÓN DE ANTOCIANOS TOTALES CARACTERIZACIÓN FÍSICA DE LOS FRUTOS DE MAQUI 5.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO RESULTADOS ANÁLISIS DE ANTOCIANOS MEDIANTE HPLC CONTENIDO DE ANTOCIANOS TOTALES EN LOS FRUTOS DE MAQUI ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE FRUTOS DE MAQUI 6.4. CARACTERIZACIÓN FÍSICA DE LOS FRUTOS DE MAQUI 7. DISCUSIÓN ANÁLISIS DE ANTOCIANOS MEDIANTE HPLC CONTENIDO TOTAL DE ANTOCIANOS CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS FRUTOS DE MAQUI

6 7.4. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DE LOS FRUTOS DE MAQUI CONCLUSIONES. 56 BIBLIOGRAFÍA

7 INDICE DE FIGURAS PÁGINA FIGURA 1. ESTRUCTURA DEL RADICAL DPPH FIGURA 2. FRUTAS Y VERDURAS CON MAYOR CAPACIDAD ANTIOXIDANTE CULTIVADAS EN CHILE FIGURA 3. COMPARACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE FRUTOS CON Y SIN CÁSCARA.. 23 FIGURA 4. COMPARACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE ALIMENTOS CRUDOS Y COCIDOS 23 FIGURA 5. ESTRUCTURA QUÍMICA DE LOS ANTOCIANOS. 25 FIGURA 6. CROMATOGRAMA DE UN EXTRACTO DE MAQUI OBTENIDO POR HPLC.. 32 FIGURA 7. IDENTIFICACIÓN PROBABLE DE ANTOCIANINAS PRESENTES EN EL MAQUI. 32 FIGURA 8. FRUTOS DE MAQUI. SECTOR CONCORDIA, REGIÓN DE LOS LAGOS, CHILE FIGURA 9. COLUMNA UTILIZADA PARA LA PURIFICACIÓN DE LOS EXTRACTOS FIGURA 10. CROMATOGRAMAS OBTENIDOS POR HPLC A 520 nm 42 FIGURA 11. COMPOSICIÓN PORCENTUAL DE LOS PRINCIPALES ANTOCIANOS PRESENTES EN LOS FRUTOS. ANÁLISIS MEDIANTE HPLC. REGIÓN DE O HIGGINS. 43 FIGURA 12. COMPOSICIÓN PORCENTUAL DE LOS PRINCIPALES ANTOCIANOS PRESENTES EN LOS FRUTOS. ANÁLISIS MEDIANTE HPLC. REGIÓN DEL MAULE. 43 FIGURA 13. COMPOSICIÓN PORCENTUAL DE LOS PRINCIPALES ANTOCIANOS PRESENTES EN LOS FRUTOS. ANÁLISIS MEDIANTE HPLC. REGIÓN DEL BÍO BÍO. 44 6

8 FIGURA 14. COMPOSICIÓN PORCENTUAL DE LOS PRINCIPALES ANTOCIANOS PRESENTES EN LOS FRUTOS. ANÁLISIS MEDIANTE HPLC. REGIÓN DE LOS LAGOS 44 FIGURA 15. CONTENIDO DE ANTOCIANOS TOTALES PRESENTES EN LOS FRUTOS DE MAQUI.. 45 FIGURA 16. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DEL MAQUI. IC 50 DE CADA POBLACIÓN FIGURA 17. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DEL MAQUI EQUIVALENTE A ÁCIDO ASCÓRBICO. 47 FIGURA 18. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS FRUTOS DE MAQUI EQUIVALENTE A ÁCIDO ASCÓRBICO. ANÁLISIS POR CADA REGIÓN

9 INDICE DE TABLAS PÁGINA TABLA 1. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EQUIVALENTE A TROLOX (TEAC) DE PATRONES DE ANTOCIANOS POR MÉTODO ABTS TABLA 2. CONTENIDO E IDENTIFICACIÓN PROPUESTA PARA ANTOCIANINAS DETECTADAS EN MAQUI. 33 TABLA 3. PROTOCOLO PARA ANÁLISIS DE ANTOCIANINAS MEDIANTE HPLC TABLA 4. PROTOCOLO PARA ENSAYO DEL MÉTODO DPPH.. 38 TABLA 5. POSIBLES IDENTIDADES PARA LOS COMPUESTOS ANTOCIÁNICOS ENCONTRADOS MEDIANTE HPLC. 50 8

10 1. RESUMEN Hoy en día, aquellos productos que contienen antioxidantes han adquirido gran importancia debido a que numerosos estudios revelaron que su consumo es altamente beneficioso para la salud humana, ya que son capaces de prevenir ciertas enfermedades ocasionadas por el estrés oxidativo, y además pueden mejorar la calidad de vida de las personas. Dentro de los estudios realizados a varios frutos nativos de nuestro país, es importante destacar que el Maqui posee innumerables cualidades, que lo convierten en un fruto muy atractivo para la economía chilena. Debido al alto contenido de antocianos presentes en estos frutos, es de suma importancia estudiar su capacidad antioxidante in vitro. Para ello, se preparó un extracto a partir de frutos de maqui, mediante un protocolo de trabajo que incluye etapas de lavado, eliminación de interferentes y eliminación de azúcares. A partir del extracto puro obtenido, se determinó espectrofotométricamente el contenido Antocianos totales; por otro lado, se realizó un perfil cromatográfico de las antocianinas, utilizando un equipo de Cromatografía Líquida de Alta Precisión (HPLC). Posteriormente, se evaluó la capacidad antioxidante, a través del método del Difenilpicrilhidracilo (DPPH). Los resultados obtenidos al analizar frutos de maqui provenientes de las regiones de O Higgins, Maule, Bío Bío y Los Lagos muestran gran variabilidad en el contenido de Antocianos totales en los frutos de maqui recolectados, pero sólo ligeras diferencias en el perfil de Antocianos que componen estos frutos. Además se puede confirmar la gran capacidad antioxidante que poseen estos frutos. 9

11 2. INTRODUCCIÓN En la naturaleza existen numerosas sustancias, factibles de ser utilizadas en diversos ámbitos, adquiriendo cada vez una mayor importancia aquellos productos elaborados en base a elementos naturales. Es importante reconocer que Chile es un lugar privilegiado desde el punto de vista económico, dada la gran variedad de especies presentes a lo largo de nuestro país, y debido a esto es que posee numerosos productos naturales, los cuales pueden ser utilizados como materia prima para la elaboración de una gran gama de productos. Con respecto a ello, es conveniente conocer y estudiar algunas de las características del fruto del Maqui, especie Eleocarpácea denominada Aristotelia chilensis, la cual crece en la zona Central y Sur de nuestro país. El Maqui ha sido utilizado desde la antigüedad. Nuestros antepasados conocieron muchas de sus aplicaciones. Por ejemplo, era ampliamente utilizado como antidiarreico, antifebril y en el combate de varias enfermedades. En la actualidad el fruto de maqui es utilizado como una fuente de colorantes naturales debido a su alto contenido de antocianos. Los antocianos o antocianinas son compuestos con propiedades colorantes, a las que también se atribuye capacidad antioxidante, cualidad que les confiere una gama de utilidades en las distintas áreas del desarrollo industrial. Los antocianos son vulnerables a ciertas condiciones ambientales, por lo que es importante conocer sus propiedades químicas, con el fin de optimizar su utilidad. Hoy en día se realizan variados estudios acerca de las antocianinas, ya que cada vez se descubren nuevas aplicaciones, por lo cual es necesario conocer a fondo las propiedades de los 10

12 antocianos presentes en los frutos del Maqui y otros frutos autóctonos del país. Todo esto conferiría a los frutos una gran oportunidad de ser utilizados en el mercado nacional e internacional, como materia prima para la elaboración de innumerables productos. En nuestros días, el Maqui no es un fruto consumido con tanta popularidad como otros frutos de nuestro país. Es bien sabido que este noble fruto se utiliza para la elaboración de mermeladas, pero si se analiza la gran vulnerabilidad de las antocianinas a las altas temperaturas, es posible asumir que todos los potenciales beneficios de consumir este producto natural se pierdan frente a esta condición. En este sentido, se debe destacar que los antocianos son compuestos lábiles, y que su contenido en frutos de maqui puede variar si se consideran los factores ambientales, razón por la cual se puede inferir que existe variabilidad entre los frutos provenientes de distintos sectores del país. Además, como ha sido comprobada la gran capacidad antioxidante de las antocianos, sería posible deducir que esta capacidad varía en frutos de distinto origen. Por lo tanto, si estos frutos se consideran una buena fuente de antioxidantes, la obtención de un extracto de frutos de Maqui tendría innumerables aplicaciones en la ciencia y la medicina, ya que su consumo podría prevenir ciertas enfermedades causadas por estrés oxidativo. 11

13 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GENERAL Determinar la variabilidad en el contenido de antocianinas y la actividad antioxidante en frutos de Aristotelia chilensis provenientes de diferentes regiones de nuestro país. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Analizar y cuantificar antocianinas presentes en frutos de maqui. Determinar la capacidad antioxidante en extractos del fruto de maqui fresco. 12

14 4. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4.1. ESTRÉS OXIDATIVO Definición El estrés oxidativo se define como un daño a nivel molecular, producido por acción de radicales libres o especies reactivas del oxígeno, como producto de un desbalance en la producción de antioxidantes y prooxidantes en las células. Este tipo de daño es capaz de ocasionar modificaciones irreversibles en distintos órganos, debido a alteraciones en las moléculas de DNA, situación que predispone a los individuos a desarrollar ciertas patologías, como cáncer, aterosclerosis, entre otras, además del envejecimiento celular (Olinsky et al., 2007, Stryer et al., 2003). Las especies reactivas del oxígeno (ROS, reactive oxygen species ) generadas en el metabolismo oxidativo ocasionan daños en todos los tipos de macromoléculas y pueden conducir, en última instancia, a la muerte celular. En efecto, las ROS están implicadas en muchas enfermedades humanas. El glutatión reducido (GSH), un tripéptido con un grupo sulfhidrilo libre, es necesario para combatir el estrés oxidativo y mantener el estado reducido normal de la célula. El glutatión oxidado (GSSH) se reduce mediante el NADPH generado por la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa de la vía de las pentosas fosfato. Así pues, las células son sensibles al estrés oxidativo, y éste se acentúa aún más en el eritrocito, ya que, al carecer de mitocondrias, no dispone de medios alternativos para generar poder reductor (Stryer et al. 2003). 13

15 Los organismos superiores, como el ser humano, no pueden existir sin el oxígeno. Sin embargo, el oxígeno es peligroso para su existencia, lo que algunos investigadores han denominado la gran paradoja del oxígeno. Este peligro del oxígeno es inherente a su estructura, debido a que, cada átomo de oxígeno tiene un electrón impar en su órbita externa, lo que le confiere la condición de radical libre. La molécula de oxígeno tiene 2 electrones impares, por lo cual, se puede afirmar que es un birradical libre (Pérez, 2000). La reducción tetravelente del oxígeno en la mitocondria para producir agua mediante la cadena transportadora de electrones es relativamente segura. Sin embargo, la reducción univalente del oxígeno genera intermediarios reactivos. El ambiente reductivo celular favorece reducciones univalentes del oxígeno no programadas. Así, en un ambiente aeróbico, se produce el peróxido de hidrógeno, un radical aniónico superoxidado, y el radical hidroxilo, que es extremadamente reactivo, considerándose a estos, como los responsables de la toxicidad del oxígeno (Pérez, 2000) Mecanismos de protección contra el estrés oxidativo Para poder sobrevivir en un medio tan adverso, como se describió anteriormente, los organismos vivos generan y obtienen del medio, compuestos antioxidantes solubles en agua o en lípidos. También sintetizan una serie de enzimas antioxidantes cuya función es interceptar e inactivar intermediarios reactivos del oxígeno. A pesar de su extrema importancia, los compuestos y enzimas antioxidantes no son completamente efectivas para prevenir el daño oxidativo (Pérez, 2000; Stryer et al., 2003). Para contrarrestar el daño que aún ocurre, el organismo sintetiza una serie de enzimas capaces de remover y reparar proteínas, lípidos y DNA. Finalmente, como los niveles de estrés oxidativo pueden variar de tiempo en tiempo, los organismos son capaces de 14

16 adaptarse a esas fluctuaciones, con la consecuente inducción de la síntesis de enzimas antioxidantes y enzimas removedoras/reparadoras de daño (Pérez, 2000) ANTIOXIDANTES Los radicales libres son protagonistas de numerosas enfermedades que provocan reacciones en cadena; estas reacciones solo son eliminadas por la acción de otras moléculas que se oponen a este proceso tóxico en el organismo, los llamados sistemas antioxidantes defensivos (Céspedes, 2000). Un antioxidante con función biológica se define como aquella sustancia que presente en concentraciones muy pequeñas comparadas con las de un sustrato oxidable, disminuye o evita la oxidación del sustrato toda vez que resulta un agente reductor más potente. En bioquímica inorgánica puede considerarse como un donador de electrones capaz de evitar una reacción en cadena de oxidorreducción (Hicks, 2001) Clasificación de los antioxidantes Existen dos maneras de clasificar a los antioxidantes. Una de ellas es según su mecanismo de acción, distinguiéndose dos tipos de antioxidantes: 15

17 Antioxidantes preventivos Estos actúan al inicio de una cadena de oxidación para reducir o impedir el comienzo de una cadena de oxidorreducción. Algunos ejemplos comprenden los reductores de peróxidos orgánicos e inorgánicos, como las enzimas glutatión peroxidasa, catalasa y peroxidasa (Hicks, 2001) Antioxidantes secundarios Son interruptores que actúan al bloquear en alguna etapa la cadena de oxidación ya iniciada al captar radicales libres y al acortar la longitud de la cadena de oxidación y sus consecuencias, por ejemplo las vitaminas E y C y la enzima superóxido dismutasa (Hicks, 2001). Otra manera de clasificar los antioxidantes considera su estructura química y su función biológica y, en este sentido, pueden ser: Antioxidantes enzimáticos Son aquellos que protegen al organismo contra la formación de nuevos radicales libres. Destaca la enzima Superóxido Dismutasa (SOD), que consiste en una glicoproteína tetramérica inducible por corticoides y por su estructura polimérica se presenta en varias 16

18 isoenzimas para catalizar la dismutación del anión superóxido, posiblemente el radical más común, con la inactivación consecuente (Hicks, 2001; McKee, 2003). Otra enzima que funciona en la protección antioxidante es la Catalasa presente en los peroxisomas, la cual resulta importante en la eliminación del peróxido de hidrógeno al impedir la catálisis de los metales hacia el OH; sin embargo, su escasa presencia en el plasma dio lugar a buscar con éxito, un aumento de su vida circulante mediante cambios estructurales en el laboratorio (Hicks, 2001; McKee, 2003). Otro grupo de enzimas antioxidantes lo constituyen las peroxidasas, destacando la Glutatión Peroxidasa, enzima dependiente de selenio que convierte el peróxido de hidrógeno y los peróxidos lipídicos en moléculas inofensivas antes de que puedan formar radicales libres (Céspedes, 2000; Hicks, 2001; McKee, 2003; ) Antioxidantes no enzimáticos Los seres vivos utilizan moléculas antioxidantes para proteger su organismo de los radicales libres (McKee, 2003), entre estas se puede mencionar compuestos no enzimáticos como las vitaminas C y E, el beta-caroteno, ácido úrico y la bilirrubina, entre otros (Hicks, 2001). El principal antioxidante liposoluble es la vitamina E, encontrándose en el plasma vinculada a los lípidos circulantes, con concentraciones plasmáticas dependientes de la cantidad aportada por los lípidos circulantes, y también es posible encontrarla en todas las membranas celulares (Hicks, 2001; McKee, 2003). 17

19 La vitamina C (ácido ascórbico) consiste en una molécula hidrosoluble, con gran ventaja sobre la vitamina E, por su capacidad para regenerar la variante reducida (antioxidante) de la vitamina E al interactuar con el radical tocoperoxilo para regenerar al alfa-tocoferol a su estado activo (Hicks, 2001). El beta-caroteno, un pigmento presente prácticamente en todas las plantas y el cual constituye el precursor más importante de la vitamina A, presenta también actividad antioxidante. Es la molécula que reacciona más eficazmente con el singulete de oxígeno. Sin embargo, la vitamina A no interacciona con el singulete de oxígeno y carece de actividad para la depuración de los radicales libres (Hicks, 2001). La defensa antioxidante, enzimática y no enzimática protege al organismo contra el daño oxidativo, pero no con el 100 % de eficiencia. Los antioxidantes no enzimáticos son frecuentemente añadidos a los alimentos para prevenir la peroxidación lipídica que se asocia a numerosas patologías y a estados de estrés oxidativo. La cardiopatía isquémica y el infarto agudo del miocardio son la expresión de un proceso que comienza con un exceso de radicales libres, los cuales inician el proceso aterosclerótico por daño en la pared vascular, provocando la penetración al espacio subendotelial de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y por ende a la placa aterosclerótica (Céspedes, 2000). Estudios epidemiológicos han mostrado una disminución de la incidencia de enfermedades cardiovasculares en personas con suplementación antioxidante, donde las vitaminas E y el Beta caroteno disminuyen el riesgo de accidentes fatales. Otros estudios han revelado que la incidencia de enfermedades coronarias es inversamente proporcional al consumo de vitaminas A, E y Beta caroteno. En estudios realizados sobre el efecto de la peroxidación lipídica y el estado antioxidante en la arterosclerosis se encontró que bajos niveles de antioxidantes y la peroxidación lipídica están involucrados en las fases tempranas del proceso aterosclerótico (Céspedes, 2000). 18

20 Estudio de los oxidantes y antioxidantes Es posible medir y evaluar el daño provocado por el estrés oxidativo, a través de varias técnicas de laboratorio, clasificadas como métodos directos e indirectos. Entre los primeros es posible mencionar la medición de agentes antioxidantes, lo cual resulta, en cierto modo, difícil por su corta vida media y el alto costo de los equipos, lo que obliga a medirlos indirectamente mediante algunas técnicas, de las cuales se analizan las principales a continuación (Rodriguez, J.; et al., 2001) Determinación de productos terminales de la acción oxidante sobre biomoléculas Es el método de elección para probar el papel de los oxidantes en algún tipo de daño celular, por ejemplo, la medición de Malondialdehído (MDA) (Rodríguez, J.; et al., 2001) Determinación de la capacidad antioxidante Existen varios métodos para evaluar la capacidad antioxidante. Por fines prácticos, en situaciones asociadas a la salud humana, sólo se determinan los niveles plasmáticos de antioxidantes como las vitaminas E, C, coenzima Q (ubiquinol) y glutatión (Rodríguez, J.; et al., 2001). También se ha reportado la medición del contenido total de antocianinas presentes en el plasma después de la administración de jugo de naranja (Giordano et al., 2007). 19

21 Una buena alternativa para la evaluación de la actividad antioxidante en vegetales y frutos, es el método del 1,1-difenil-2-picrilhidracilo (DPPH). El DPPH es un radical libre, de color violeta, que posee la particularidad de absorber a longitudes de onda cercanas a 520 nm, al encontrarse disuelto en etanol. Cuando se combina con sustancias capaces de donar átomos de hidrógeno adopta su forma reducida, con la consecuente pérdida de su coloración característica, razón por la cual es ampliamente utilizado para evaluar la capacidad antioxidante de algunos compuestos (Molyneux, P.; 2004). Su estructura química se muestra en la figura 1. Este método es sencillo, rápido, y no requiere instrumental muy sofisticado, en comparación con otras técnicas. Es por esta razón que se le conoce como un método adecuado para evaluar la capacidad antioxidante en extractos de plantas y frutas. FIGURA 1. ESCTRUCTURA DEL RADICAL DIFENILPICRILHIDRACILO. (A) DIFENILPICRILHIDRACILO EN SU FORMA DE RADICAL LIBRE. (B) DIFENILPICRILHIDRACINA, SU FORMA NO RADICAL (Fuente: Molyneux, P.; 2004) 20

22 4.3. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE FLAVONOIDES POLIFENÓLICOS DERIVADOS DE FRUTAS Y VERDURAS La actividad antioxidante relativa, contra radicales generados en fase acuosa, de una gama de flavonoides polifenólicos derivados de plantas, componentes de frutas, vegetales, té y vino, ha sido ampliamente estudiada. Los resultados muestran que los componentes como quercetina y cianidina, con 3, 4 dihidroxi-sustituyentes, en el anillo B y la conjugación entre el anillo A y B, tienen potenciales antioxidantes cuatro veces la actividad del Trolox, un análogo de la vitamina E. Removiendo la sustitución orto-dihidroxi, como en kaempferol, o el potencial para la delocalización de electrones por reducción del 2,3 doble enlace en el anillo C, como en la catequina y epicatequina, disminuyen la actividad antioxidante en más del 50%, pero estas estructuras son aún más efectivas que el alfatocoferol o el ascorbato (Rice-Evans et al., 1995). La actividad antioxidante de algunas verduras y frutas, para el método FRAP (Araya et al., 2006), fluctúa entre milimoles de Fe/100 g en zanahoria cocida, hasta 1.91 en ají rojo, y desde los milimoles de Fe/100 g en pepinos hasta en maqui, respectivamente. Se destaca la alta capacidad antioxidante de algunos frutos. Por ejemplo, la frutilla con 3.10, y la zarzamora con 3.55 milimoles de Fe/100 g. Los valores más bajos pertenecen a algunas frutas de consumo habitual, como peras, manzanas y duraznos (Araya et al., 2006). Es claramente evidenciable que aquellos alimentos que presentan colores en la gama del rojo al vino tinto, poseen una mayor capacidad antioxidante, vale decir: maqui, zarzamora, frambuesa, guinda, ají rojo, mora y uva, como se muestra en la figura 2. Es importante destacar, que el maqui presenta la mayor capacidad antioxidante, el cual posee un color rojo vino tinto, atribuido al gran contenido de antocianinas. 21

23 FIGURA 2. FRUTAS Y VERDURAS CON MAYOR CAPACIDAD ANTIOXIDANTE, CULTIVADAS EN CHILE. (Fuente: Araya et al., 2006). La capacidad antioxidante puede variar con la forma en que se consuma los alimentos. Es así como se ha comprobado que la capacidad antioxidante de las frutas varía si estas se consumen sin cáscara, debido a que en ella se ubica la mayor cantidad de polifenoles (Figura 3). Por otro lado, esta capacidad también puede variar en alimentos crudos y cocidos, siendo la cocción un proceso que disminuye el poder antioxidante (Figura 4). Esto se puede explicar por la sensibilidad de los polifenoles a la temperatura y la solubilización de los mismos en el agua de cocción (Araya et al., 2006). Otro aspecto importante es que las antocianinas son muy vulnerables frente a las condiciones ambientales, y se ha determinado que existen algunos factores que alteran la estabilidad de las antocianinas, por ejemplo, la luz. Por otra parte, la presencia de oxígeno es un factor que tiene acción destructora sobre los pigmentos antociánicos. El ph y las temperaturas de almacenamiento también influyen sobre la estabilidad y la vida media de los pigmentos antociánicos, siendo mayor la vida media de estos a ph cercanos a 7.0, a bajas temperaturas (-20 ºC), considerando además, la ausencia de oxígeno (Deguchi et al., 2000; Miguel et al., 2004; Koyama, et al., 2007; Sadilova et al., 2007). 22

24 FIGURA 3. COMPARACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE FRUTOS CON Y SIN CÁSCARA. (Fuente: Araya et al., 2006). FIGURA 4. COMPARACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE ALIMENTOS CRUDOS Y COCIDOS. (Fuente: Araya et al., 2006). 23

25 4.4. ANTOCIANOS Generalidades Los antocianos o antocianinas son colorantes naturales pertenecientes al grupo de los flavonoides. Están presentes en casi todas las plantas, y en todas sus partes, especialmente en flores y frutos (particularmente en bayas). Estudios realizados con compuestos polifenólicos y, especialmente, los flavonoides, demuestran su capacidad antioxidante y su significativa contribución en la dieta, así como su efecto en la prevención de diversas enfermedades, entre ellas, enfermedades cardiovasculares, cancerígenas y neurológicas. (Kuskoski et al., 2004). Los polifenoles son efectivos donadores de hidrógenos, particularmente los flavonoides. Su potencial antioxidante es dependiente del número y de la posición de los grupos hidroxilos y su conjugación, así como la presencia de electrones donadores en el anillo estructural, debido a la capacidad que posee el grupo aromático de soportar el desapareamiento de electrones por desplazamiento del sistema de electrones-π (Kuskoski et al., 2004). Los antocianos, pigmentos flavonólicos, tienen una estructura química adecuada para actuar como antioxidantes, pueden donar hidrógenos o electrones a los radicales libres o bien atraparlos y desplazarlos en su estructura aromática. Una actividad antioxidante óptima se relaciona con la presencia de grupos hidroxilo en las posiciones 3 y 4 del anillo B, los cuales confieren una elevada estabilidad al radical formado (Sánchez-Moreno, C., 2002). Los grupos hidroxilo en las posiciones 3 del anillo C y 5 del anillo A, junto con el grupo carbonilo en la posición 4 son donadores de electrones (Rice-Evans et al., 1996) (Figura 5). La diversidad estructural contribuye favorablemente a la existencia natural de 24

26 unos 300 antocianos con diferentes sustituciones glucosídicas (Harborne y Williams, 1992), en la estructura básica del ión fenil-2-benzopirilo o flavilio (Kuskoski et al., 2004). FIGURA 5. ESTRUCTURA QUÍMICA DE LOS ANTOCIANOS. (Fuente: Kuskoski et al., 2004) Aquellas agluconas con idéntica hidroxilación en los anillos A y C, y compuestos con un solo grupo OH en el anillo B (4 -OH), incluyendo pelargonidina, malvidina y peonidina, presentan menor actividad antioxidante comparado con compuestos que poseen agrupación 3, 4 di-oh sustituidos, como delfinidina y cianidina 3-glucósido (tabla 1). La importancia de los grupos hidroxilos en la posición 3 y 4 del anillo B contribuye a la elevada capacidad antioxidante también encontrada en las flavonas. Los flavonoides con un mayor número de grupos hidroxilos tienen mayor actividad antioxidante. Esto se comprueba para antocianos con grupos hidroxilos en las posiciones 4, 5 y 6, como pelargonidina, cianidina y delfinidina. Así como la eficacia de los flavonoides como antioxidantes está relacionada con el grado de hidroxilación, también desciende con la sustitución por azúcares, presentando los glucósidos menor actividad antioxidante que sus correspondientes agluconas (Kuskoski et al., 2004). 25

27 TABLA 1. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EQUIVALENTE A TROLOX (TEAC) DE PATRONES DE ANTOCIANOS POR MÉTODO ABTS (MEDIA + DE, N=3) Antocianos Determinación TEAC (mm) Delfinidina Cloruro de delfinidina 2.45 ± 0.14 Cianidina 3-glucósido Cloruro de kuromanin 1.85 ± 0.26 Peonidina 3-glucósido Cloruro de peonidina 3-glucósido 1.49 ± 0.19 Pelargonidina 3-glucósido Cloruro de callistephin 1.50 ± 0.08 Malvidina 3-glucósido Cloruro de oenin 1.41 ± 0.07 (Fuente: Kuskoski et al., 2004) Aislamiento de antocianos Hace varias décadas atrás que el estudio del contenido y composición de pigmentos antociánicos presentes en frutos de maqui, ha mostrado gran auge por las innumerables aplicaciones que estos pigmentos tienen en la industria alimentaria (Díaz et al., 1984). Particular interés tiene el estudio de compuestos antociánicos en frutos de distintas especies. En 1986 se logró identificar 16 compuestos antociánicos en una variedad de uvas provenientes de Francia, mediante la técnica de HPLC (Roggero et al., 1986). Por su parte, Kallithraka et al. (2005) estudió la composición de antocianos en 18 variedades de uva a partir de extractos de la piel de los frutos, los cuales se evaluaron mediante HPLC, encontrando 6 compuestos antociánicos derivados de la Cianidina, Delfinidina, Petunidina, Peonidina y Malvidina. Posteriormente, se encontraron 37 antocianos diferentes en la especie Vitis labrusca, claramente identificables mediante una técnica de HPLC que combina los mecanismos de separación por intercambio iónico y fase reversa, lo que facilita en gran manera el análisis de los antocianos presentes en estos frutos (McCallum et al., 2007). 26

28 En una investigación realizada por Nicoué et al. (2007) utilizando HPLC-MS en arándanos, se encontraron 49 antocianos diferentes, de los cuales 19 fueron reportados anteriormente. En frutillas es posible mencionar que se han encontrado cerca de 25 antocianos diferentes, que corresponden mayormente a derivados de Pelargoninidina y Cianidina, con un porcentaje cercano al 95%. El azúcar sustituyente más común es la glucosa, pero también se encontró rutinosa, arabinosa y rhamnosa, como azúcares minoritarios (Lopes da Silva et al., 2007). En resumen, es posible decir que existe una gran variedad de compuestos antociánicos, identificables mediante diferentes técnicas espectrofotométricas y cromatográficas, y esta variedad se amplía cada vez más con el progreso y evolución de las técnicas de laboratorio Aplicación del estudio de los antocianos Desde hace algún tiempo atrás, el estudio de los antocianos ha cobrado gran importancia debido a las variadas aplicaciones que estos tienen tanto para el desarrollo industrial, como para la salud humana, por su coloración particular y por la actividad antioxidante atribuida a estos. Se ha demostrado que los antocianos aislados de algunas variedades de papa poseen actividad inhibitoria sobre el crecimiento celular e inducen la apoptosis, lo que representa un hito importante en el descubrimiento de nuevos mecanismos de acción contra el cáncer, específicamente el cáncer de próstata, aunque no se ha reportado acción anti cancerígena en otras líneas celulares (Reddivari et al., 2007). 27

29 Es sabido que la deficiencia de vitamina E resulta en un incremento de los índices de peroxidación en sangre y tejidos animales. Los efectos en la concentración de hidroperóxidos en el hígado y la capacidad antioxidante en plasma sugieren que el extracto rico en antocianinas posee capacidad antioxidante in vivo. La aparente capacidad de las antocianinas fuertemente polares de sustituir un antioxidante lipofílico, como la vitamina E, puede ser análogo a la capacidad de la vitamina C para proteger a las membranas biológicas de la peroxidación por una eficiente captación de radicales peroxilo en el citosol. Alternativamente, el efecto antioxidante puede reflejar, en parte, la capacidad de los polifenoles, incluyendo las antocianinas, de intervenir favorablemente en los procesos de formación de radicales (Ramírez-Tortosa et al., 2001). Se sugiere que las antocianinas en extractos altamente purificados poseen una biodisponibilidad considerable, y por lo tanto, un extracto rico en antocianinas, incrementan la capacidad antioxidante del plasma en individuos con deficiencia de vitamina E. Como las antocianinas están distribuidas ampliamente en frutas y especies vegetales, tanto los cultivos hortícolas como silvestres, podrían ser una importante fuente de antioxidantes fotoquímicos (Ramírez-Tortosa et al., 2001) EL MAQUI: ANTECEDENTES GENERALES Descripción del maqui El maqui pertenece a la familia de las Eleocarpáceas. Su nombre científico es Aristotelia chilensis (Mol.) [Stuntz], y es conocido popularmente como maqui. También es conocido como koleón, clon, maquei, y queldrón. Es un árbol perenne, dioico, de tronco delgado y ramas rojizas, que puede alcanzar 4 metros de alto por hasta 4 metros de 28

30 diámetro. Cuando crece en comunidades adquiere forma arbustiva. Las hojas son simples, opuestas y decusadas, de hasta 13 centímetros de largo por 3 a 7 de ancho. Tanto las flores femeninas como las masculinas son amarillentas, se disponen en racimos y en árboles separados (Riedemann y Aldunate, 2004); florece en los meses de octubre y principios de noviembre; sus frutos maduran entre diciembre y enero. Su fruto es una baya redonda, negra, brillante, de 4-5 mm de diámetro, posee 2-4 semillas angulosas, de 3 mm de largo y 2 mm de ancho. Crece desde Coquimbo (IV Región) hasta Aysén (XI Región), y también en Juan Fernández, donde forma extensos matorrales en los valles y penetrando el bosque para alcanzar, en algunos lugares, alturas más o menos considerables. Crece asociado a otras especies, bordeando bosquetes, en lugares húmedos, coloniza con facilidad los suelos que han perdido su cubierta vegetal, transformándose en colonizador de suelos recién quemados o explotados, y además forma comunidades, llamadas macales, que sirven para proteger el terreno de la erosión. La superficie aproximada de maqui en Chile desde la IV a la XI región es de hectáreas, y de acuerdo a los estudios de cosecha realizados en formaciones naturales de maqui en la VII, IX y X regiones, se estiman rangos de producción que fluctúan entre 160 y 280 kilogramos de fruto fresco por hectárea. De estas cifras se calculó una producción promedio por árbol, para individuos de 5 a 7 años de edad, y los rangos van desde 170 a 430 gramos de fruto fresco por árbol (CONAF-CONAMA- BIRF, 1997). Es una especie con carácter muy variable en cuanto a su crecimiento; es así como en la Cordillera de los Andes, a más de 200 metros sobre el nivel del mar, crece como arbustos muy bajos, con las ramas tendidas en el suelo y el margen de las hojas es fuertemente aserrado (Rodríguez et al., 1983). Se propaga fácilmente por semilla macerada en almácigo estratificado, con una mezcla de suelo y una parte de compost, una de tierra de jardín y una de arena. Se repica en bolsa cuando tiene dos hojas verdaderas (Riedemann, y Aldunate, 2004). 29

31 Utilidades En cuanto a sus usos, cabe destacar que hasta el momento no se conocen muchas aplicaciones técnicas de su madera, por ser extremadamente blanda; sin embargo se utiliza en algunos tipos de artesanía popular y en la fabricación de varas, molduras, entre otras. La corteza tiene fibras semejantes a las del cáñamo, pero de inferior calidad y es usada en la confección de cuerdas para atar. Su fruto comestible es muy conocido y a partir de él se preparan jugos, bebidas alcohólicas y además, se emplea como colorante para teñir vinos (Rodríguez et al, 1983). También es posible preparar mermeladas a partir de él y su pulpa es comercializada como materia prima e insumos de otros productos. Cabe destacar que esta especie ha sido ampliamente utilizada por las comunidades mapuches y en medicina popular, ya que sus hojas en infusión presentan propiedades antitumorales y febrífugas; como ungüento tiene actividad cicatrizante, y sus frutos tienen actividad antidiarreica (Escribano-Bailón et al., 2006; Potocnjak, 2007) Composición Con respecto a las sustancias químicas presentes, se puede afirmar que los frutos de maqui contienen antocianinas, responsables del color púrpura de estos. La planta es rica en alcaloides indólicos, aislándose más de 30 junto a una variedad de flavonoides, glucósidos de cianidina, delfinidina, malvidina, petunidina, cumarinas y triterpenos (Potocnjak et al., 2007; Kan et al., 1997). Recientemente, se ha puesto particular atención en los polifenoles y especialmente en las antocianinas presentes en el maqui, no tan sólo por su uso como colorante natural, sino también por su potencial efecto benéfico para la salud humana, incluyendo sugerencias de 30

32 que el maqui puede ser usado como suplementos dietarios en productos alimenticios funcionales (Du et al., 2004). Los potenciales efectos incluyen actividad antioxidante (Heinonen et al., 1998; Prior et al., 1998; Connor et al., 2002; Miranda-Rottmann et al., 2002) y actividad anti-aterogénica (Miranda-Rottmann et al., 2002), inhibición del virus VIH (Andersen y Helland, 1995), prevención de problemas visuales (Morazzoni y Bombardelli, 1996; Sparrow et al., 2003) y actividad contra algunos tipos de leucemia y carcinoma de colon en humanos (Kamei et al., 1995; Katsube et al., 2003) ANTOCIANINAS EN FRUTOS DE MAQUI Mediante técnicas espectrofotométricas y cromatográficas ha podido identificarse una gran variedad de compuestos antociánicos a partir de los frutos de A. chilensis. Según Díaz et al. (1984) es posible distinguir mediante técnicas cromatográficas unos 9 pigmentos antociánicos derivados de los pigmentos presentes en frutos de maqui, los que corresponderían a derivados de la Cianidina, Delfinidina, Petunidina, Pelargonidina, Peonidina y Malvidina. En la figura 5 se puede observar el perfil de antocianinas presentes en el maqui obtenido mediante HPLC, donde los picos 5 y 7 corresponden a delfinidina 3-glucósido y cianidina 3-glucósido, respectivamente. Los compuestos asociados a los picos 1, 2, y 4 presentan características similares al pico 5, por lo cual, se les denomina derivados de la delfinidina. Por su parte, los picos 3 y 6 se denominan antocianinas derivadas de cianidina. Dada su gran polaridad, se sugiere que los compuestos presentes en los picos 5 y 7 son antocianinas glicosiladas (Escribano-Bailón et al., 2006). Las identidades sugeridas para las antocianinas presentes en el maqui, a partir del cromatograma mostrado en la Figura 6, se muestran a continuación, en la Figura 7. 31

33 FIGURA 6. CROMATOGRAMA DE UN EXTRACTO DE MAQUI OBTENIDO POR HPLC. (Fuente: Escribano-Bailón et al., 2006). FIGURA 7. IDENTIFICACION PROBABLE DE ANTOCIANINAS PRESENTES EN EL MAQUI. Glc, glucosa; Xyl, xilosa. (Fuente: Escribano-Bailón et al., 2006) Las concentraciones medidas de las diferentes antocianinas identificadas a partir del fruto de A. chilensis, se muestran en la tabla 2. Los derivados de delfinidina, equivalentes 32

34 al 73 % del total, predominan ante los derivados de cianidina, que representan un 37%, con una predominancia de delfinidina-3-sambubiosido-5-glucósido, lo que representa el 34% del total de antocianos. El contenido promedio de antocianos fue mg/100 g de fruta fresca ( mg/100 g de peso seco), lo cual es similar para las concentraciones encontradas en otros frutos que se consideran una buena fuente de antocianinas. Una característica prominente de la composición de antocianinas del Maqui es que su ruta biosintética es impulsada hacia la formación de derivados poliglicosilados que son altamente polares y solubles en agua. Estas características son atractivas para su extracción y potencial uso como colorantes en la industria alimenticia, como también para usos farmacológicos (Escribano-Bailón et al., 2006). TABLA 2. CONTENIDO E IDENTIFICAIÓN PROPUESTA PARA ANTOCIANINAS DETECTADAS EN MAQUI. Antocianina Contenido (mg/100 g) Delfinidina-3-sambubiósido-5glucósido 46.4 ± 0.1 Delfinidina-3,5-diglucósido 23.7 ± 0.2 Cianidina-3-sambubiósido-5-glucósido Cianidina-3,5-diglucósido 18.7 ± 0.2 Delfinidina-3-sambubiósido 14.2 ± 0.1 Delfinidina-3-glucósido 17.1 ± 0.2 Cianidina-3-sambubiósido 8.9 ± 0.04 Cianidina-3-glucósido 8.6 ± 0.05 Antocianinas totales ± 0.4 (Fuente: Escribano-Bailón et al., 2006) En resumen, se puede decir que en cuanto a la composición de antocianinas en el maqui es posible identificar al menos ocho pigmentos, los que corresponden a 3-glucósidos, 3,5- diglucósidos, 3-sambubiósidos y 3-sambubiósido-5-glucósidos de delfinidina y cianidina. 33

35 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1. Material vegetal Se utilizarán frutos silvestres maduros de Aristotelia chilensis (Mol.) Stuntz, los cuales fueron recolectados en las regiones de O Higgins, Maule, Bío Bío y Los Lagos, entre los meses de noviembre (2007) y febrero (2008) durante la temporada de verano. Estos fueron congelados en freezer, protegidos de la luz, para su posterior análisis en el Instituto de Química de Recursos Naturales de la Universidad de Talca. En la figura 8 se muestran los frutos de maqui de un ejemplar ubicado en un bosque de la Región de Los Lagos (Sector Concordia, Provincia de Llanquihue). FIGURA 8. FRUTOS DE MAQUI. SECTOR CONCORDIA, REGIÓN DE LOS LAGOS, CHILE. 34

36 5.2 Preparación de un extracto de frutos de maqui Los extractos de frutos de maqui fueron preparados a partir de 5,0 gramos de fruto fresco, los cuales se trituraron en un mortero provisto de colador, agregando volúmenes de metanol/0.1% HCl, hasta retirar la mayor cantidad de color. Luego del exhaustivo lavado, se juntan todos los volúmenes obtenidos (aproximadamente150 ml) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, incluyendo en él los residuos sólidos de maqui, para ser puestos en un sonicador (equipo Ultrasonic cleane, Arquimed ). Pasados 16 minutos se filtraron mediante un embudo provisto de papel filtro Whatman nº 1. Una vez obtenido el residuo sólido, se procedió a lavar nuevamente con metanol/0.1% HCl, para mezclar todos los volúmenes de filtrado obtenidos. Posterior a ello, se agregó al filtrado un pequeño volumen de agua destilada y se colocó en un balón de vidrio, para extraer el metanol en evaporador rotatorio (Heating Bath B-490. Büchi) con temperaturas entre 35ºC y 40ºC y velocidad media, hasta obtener un extracto acuoso. Posteriormente, los extractos acuosos obtenidos se lavaron con n-hexano para eliminar interferentes lipídicos provenientes de la piel y semillas de los frutos, utilizando un embudo de separación. Estos extractos se conservaron refrigerados (5-10ºC) hasta su purificación. 5.3 Purificación del extracto de frutos de maqui Los extractos del frutos de maqui obtenidos, se purificaron mediante cromatografía en columna (20 x 2 cm), utilizando una resina de intercambio catiónico (Amberlita XAD-7) para eliminar los azúcares libres en la muestra (figura 9). Esta resina fue preacondicionada previo a su utilización, lavándola con 4 volúmenes de agua desionizada, y luego, con 4 volúmenes de metanol, según las indicaciones del fabricante (Sigma-Aldrich, 2007). Para 35

37 la elución se utilizó como fase móvil una mezcla de Metanol/0.1% HCl. Luego de su purificación, los extractos fueron concentrados nuevamente en rotavapor, utilizando las mismas condiciones mencionadas anteriormente, para obtener el peso del extracto. Posterior a ello, los extractos fueron aforados en matraces hasta un volumen de 25 ml, utilizando como solvente metanol. Una vez aforados, los extractos fueron introducidos en tubos de vidrio provistos de tapa rosca, para ser almacenados en freezer hasta su análisis. FIGURA 9. COLUMNA UTILIZADA PARA LA PURIFICACIÓN DE LOS EXTRACTOS. 5.4 Fraccionamiento de antocianinas Las muestras obtenidas se estudiaron mediante HPLC (equipo Hitachi L-7100 PAD L- 7455; columna Phenomenex, modelo Luna C18, 250 x 4.6 mm 5 µm). Los extractos almacenados fueron diluidos antes de ser inyectados. Se utilizó una fase móvil consistente en ácido fórmico 10% (solvente A) y acetonitrilo (solvente B), programados como se describe en la Tabla 3. La longitud de onda utilizada en la detección fue de 520 nm. 36

38 TABLA 3. PROTOCOLO PARA ANALISIS DE ANTOCIANINAS MEDIANTE HPLC. Tiempo (min) Proporción A Proporción B Evaluación de la capacidad antioxidante del extracto de frutos de maqui Se evaluó la capacidad antioxidante de los extractos de maqui a través del método del Difenilpicrilhidracilo (DPPH) descrito por Brand-Williams, El reactivo DPPH se preparó a una concentración de 20 mg/l en metanol, manteniéndolo protegido de la luz y a temperaturas bajas (0ºC), resguardando además, el ser utilizado antes de 24 horas después de su preparación. A partir de los extractos de maqui purificados y envasados, se prepararon soluciones estándar, a una concentración de 200 µg/ml de extracto, utilizando como disolvente metanol. A partir de estas soluciones, se realizaron curvas con las siguientes concentraciones de extracto: 200 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml y 12.5 µg/ml. Además, se realizó una curva de calibración para cada partida de mediciones, utilizando ácido ascórbico a las concentraciones de 120, 60, 40, 30, 20 y 10 µm. El ensayo se realizó siguiendo el protocolo propuesto en la tabla 4. 37

39 TABLA 4. PROTOCOLO PARA ENSAYO DEL MÉTODO DPPH. BLANCO MUESTRA BLANCO REACTIVO MEDIO DE REACCIÓN DILUCIÓN EXTRACTO (µl) METANOL (µl) DPPH (µl) Incubar por 15 minutos protegido de la luz Las lecturas se realizaron en triplicado a 515 nm en espectrofotómetro UV-visible (Unicam helios α UV-Vis). El resultado se expresó como el porcentaje de Inhibición (% I) de la oxidación del radical DPPH, utilizando la siguiente fórmula: % I= Absorbancia Control- Absorbancia Muestra x 100 Absorbancia Control 5.6 Cuantificación de antocianos totales Para la cuantificación de Antocianos totales se utilizó el método espectrofotométrico del ph Diferencial (INA, Método ), con una dilución1/125 a partir de los extractos envasados. Para ello, se colocó 40 µl de cada muestra en 2 matraces, aforando a 25 ml con buffer a ph 1.0 y buffer a ph 4.5, respectivamente. La lectura de las absorbancias se realizó a 510 y 700 nm. Para estimar la diferencia de absorbancia a los distintos ph y longitud de onda, se utilizó la siguiente ecuación: 38

40 Absorbancia= (A 510 nm ph 1.0 A 700 nm ph 1.0) (A 510 nm ph 4.5 A 700 nm ph 4.5) Para calcular el contenido de antocianos totales en las muestras analizadas, se utilizó la siguiente fórmula: Donde: A = Absorbancia = Coeficiente extinción molar Cianidin-3-glucósido (26,900) MW= Peso Molecular antocianina (449.2) DF = Factor de dilución V = Volumen final Wt = Peso muestra (mg) L = Ancho cubeta (1 cm) Los resultados se expresaron como % p/p de cianidin-3-glucósido. 5.7 Caracterización física de los frutos de maqui. Para obtener las características físicas de los frutos de maqui se procedió a determinar el porcentaje de humedad en los frutos frescos. Para ello se pesaron 10 gramos de fruto fresco por cada muestra en placas de vidrio. Luego, se colocaron en una estufa a 105ºC por 2 horas aproximadamente, hasta obtener un peso constante. 39

41 Para conocer el porcentaje de pulpa y semillas en los frutos, y además el número de semillas por cada fruto, se procedió a pesar 20 frutos (frescos) para extraer sus semillas mediante un bisturí, registrando el número de semillas para cada fruto. Posteriormente, las semillas fueron secadas a temperatura ambiente para ser pesadas. El porcentaje de semillas y de pulpa en los frutos se calculó de la siguiente forma: % Semillas = Peso (gramos) semillas secas 20 % Pulpa= Peso total frutos peso semillas Análisis estadístico Se utilizó el programa estadístico SPSS 15.0 para obtener los valores más representativos de cada región, en cuanto al contenido de antocianos totales, la actividad antioxidante y las características físicas de los frutos de maqui. Para ello se confeccionaron histogramas con prueba de normalidad, donde H 0 =Existe Normalidad (p >0,05) y H 1 = No existe Normalidad (p <0,05). Para las gráficas en que se aceptó H 0, el valor más representativo fue expresado como el Promedio ± Desviación Estándar y para aquellas en que se rechazó H 0 los valores fueron representados por la Mediana ± Rango Intercuartílico. Además se llevó a cabo un test de ANOVA de un factor para conocer si existían diferencias significativas en el contenido de antocianos totales entre los frutos provenientes de las cuatro regiones incluidas en este estudio. 40

42 6. RESULTADOS 6.1 Análisis de Antocianos mediante HPLC. Es importante destacar que, mediante el análisis de las diferentes muestras por HPLC, fue posible visualizar 10 compuestos diferentes, identificables mediante sus respectivos tiempos de retención. En la figura 10 se puede observar algunos de los perfiles obtenidos mediante HPLC, donde se aprecia claramente la presencia de 10 compuestos diferentes, para las poblaciones pertenecientes a las regiones de O Higgins y del Maule, y 9 compuestos en las poblaciones pertenecientes a la Región del Bío Bío y Los Lagos. La gráfica muestra la Absorbancia a 520 nm en eje de las ordenadas, y el tiempo de retención (minutos) en eje de las abscisas. 41