RESOLUCIÓN OENO 5/2007

Transcripción

1 RESOLUCIÓN OENO 5/2007 CODEX - GLICOSIDASA LA ASAMBLEA GENERAL Visto el Artículo 2, párrafo 2 iv del acuerdo del 3 de abril de 2001 por el cual se creó la Organización Internacional de la Viña y el Vino, A propuesta de la Subcomisión de Métodos de Análisis y del grupo de expertos Especificaciones de los productos enológicos, DECIDE completar el Codex Enológico Internacional con la monografía siguiente: Especificaciones generales GLICOSIDASA (actividad ß-D-glucosidasa) (EC CASO n ) Estas enzimas no se encuentran en estado puro, sino que están presentes dentro de un complejo enzimático. Salvo indicaciones contrarias, las especificaciones deben ajustarse a la resolución oeno 14/2003 relativa a las especificaciones generales para las preparaciones enzimáticas que figuran en el Codex Enológico Internacional. 1. Origen y aplicación enológica Las enzimas de tipo glicosidasas se utilizan para revelar aromas de los mostos y los vinos a partir de sus precursores glicosilados. Las preparaciones enzimáticas que contienen estas actividades proceden de fermentaciones dirigidas de Aspergillus niger. Actividades secundarias: proteasas, cinamil esterasa (esta última debe ser lo más limitada posible). El método de medición de la actividad cinamil esterasa se describe en otra parte. En el caso presente, puede aplicarse la cláusula del 50%. 2. Ámbito de aplicación El método de dosificación se ha elaborado utilizando una ß-D-glucosidasa comercializada (5.5). Las condiciones y el método han sido desarrollados para su aplicación a las preparaciones enzimáticas comerciales, como las que hallamos en el mercado enológico. 1

2 Principio La hidrólisis enzimática de la ß-D-Glucopiranosida de p-nitrofenil, que es incolora, libera glucosa y para-nitrofenol (p-np); este último toma una coloración amarilla en presencia de carbonato de sodio, cuya absorbancia es de 400 nm. 3. Aparatos 4.1 agitador magnético 4.2 baño maría a 30ºC 4.3 baño maría a 100ºC 4.4 cubetas de 1 cm de recorrido óptico desechables para espectrofotómetro, para medición en el espectro visible 4.5 hielo picado 4.6 jeringa de precisión µl 4.7 jeringa de precisión 100 µl 4.8 jeringa de precisión µl 4.9 espectrofotómetro 4.10 tubos eppendorf 4.11 matraz graduado de 100 ml 4.12 phmetro 4.14 nevera o sala fría a 4 C 4.14 soporte metálico para tubos eppendorf 4.16 algodón cardado 4.17 papel Kraft 4.17 agitador de tipo vortex 4.18 cronómetro 4.19 tubos de cristal de 15 ml 4. Productos 5.1 Carbonato de sodio (Na 2 CO 3 puro al 99,5% - PM: 105,99 g/mol) 5,2 Acetato de sodio (NaCH 3 COOH puro al 99% - PM: 82g/mol) 5.3 Ácido acético (CH 3 COOH puro al 96% - PM: 60g/mol) 5.4 ß-D-Glucopiranosida de p-nitrofenil (Fluka, ref ), por ejemplo 5.5 ß-D-glucosidasa (Fluka; 250 mg; 6,3 U/mg, ref ), por ejemplo. Una unidad corresponde a la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de glucosa por minuto a ph 5 y 35 C. 5.6 p-nitrofenol (p-np) (C 6 H 5 NO 3 puro al 99,5% - PM: 139,11 g/mol) 5.7 Agua destilada 5.8 Preparación enzimática comercial a analizar 5. Soluciones 6.1 Tampón acetato de sodio (100 mm, ph 4,2) Está formado por las soluciones A y B Solución A: introduzca 0,5 g de acetato de sodio (5.2) en 60 ml de agua destilada (5.7) 2

3 6.1.2 Solución B: introduzca 1 ml de acetato acético (5.3) en 175 ml de agua destilada (5.7) Preparación del tampón acetato de sodio: mezcle 47,8 ml de solución A (6.1.1) +152 ml de solución B (6.1.2). Compruebe el ph del tampón con un phmetro (4.12). Conserve a 4 C. 6.2 Solución de p-nitrofenil ß-D-Glucopiranosida 4mM Ponga 0,096 g de ß-D-Glucopiranosida de p-nitrofenil (5.4) en 80 ml de tampón acetato de sodio (6.1.). 6.3 Solución de carbonato de sodio 1M Disuelva 10,6 g de carbonato de sodio (5.1) en 100 ml de agua destilada (5.7) en un matraz graduado de 100 ml (4.11). La solución debe conservarse a 4 C (4.13). 6.4 Solución madre de p-nitrofenol (p-np) a 125 µg/ml Disuelva 0,01 g de p-np (5.6) en 80 ml de agua destilada (5.7). La solución madre debe prepararse en el acto. 7. Preparación de la gama patrón de p-nitrofenol (p-np) de 0 a 50 µg/ml Está formada a partir de la solución madre de p-nitrofenol (p-np) (6.4.), como se indica en la Tabla 1. Tabla 1: gama patrón de para-nitrofenol Cantidad de p-np (µg) Concentración de p-np (µg/ml) Concentración de p-np (µmol/ml) 0 0,072 0,14 0,22 0,29 0,36 Volumen solución madre (6.4) (µl) Agua destilada (5.7) (µl) Preparación de la muestra Es importante homogeneizar la preparación enzimática antes de tomar la muestra, por ejemplo por inversión. La solución enzimática y los blancos deben prepararse en el acto. 8.1 Solución enzimática a 10 g/l Introduzca 1 g de preparación comercial (5.8) en un matraz graduado de 100 ml (4.11), complete con agua destilada (5.7) y agite (4.1) para obtener una mezcla homogénea. 8.2 Blanco desnaturalizado por calentamiento Introduzca 10 ml de la solución enzimática a 2 g/l (8.1) en un tubo de 15 ml (4.19), tape con algodón cardado (4.15) recubierto de papel Kraft (4.16) y ponga el tubo durante 5 minutos al baño maría a 100 C (4.3). 3

4 9. Modo operatorio 9.1 Reacción enzimática: los tubos se realizan como mínimo por duplicado. En 5 tubos eppendorf (4.10) numerados del 1 al 5, colocados en un soporte (4.14) en hielo picado (4.5), introduzca 100 µl de la solución de ß-D-Glucopiranosida de p-nitrofenil (6.2) con una jeringa de precisión (4.7), 100 µl de la solución enzimática a 2 g/l (8.1) y ponga en marcha el cronómetro (4.18) Después de agitar (4.17), coloque los tubos eppendorf al baño maría a 30 C (4.2) durante 1 min para el tubo n 1 durante 2 min para el tubo n 2 durante 5 min para el tubo n 3 durante 10 min para el tubo n 4 durante 15 min para el tubo n 5 La reacción se detiene poniendo los tubos numerados del 1 al 5, inmediatamente después de retirarlos del baño maría a 30 C, en un baño de hielo picado (4.5). 9.2 Dosificación del p-nitrofenol liberado A partir de los tubos eppendorf que contienen los diferentes medios reactivos (9.1) Añada 600 µl de solución de carbonato de sodio (6.3) con una jeringa de precisión (4.8), 1,7 ml de agua destilada (5.7) con una jeringa de precisión (4.6). Ponga la mezcla resultante en una cubeta (4.4). Mida enseguida la absorbancia a 400 nm con un espectrofotómetro (4.9). 9.3 Blancos Opere como se explica en 9.1, sustituyendo la solución enzimática a 2 g/l (8.1) por el blanco desnaturalizado por el calor (8.2). Lo ideal es realizar la reacción enzimática de los blancos al mismo tiempo que la de la solución enzimática. 9.4 Curva patrón Opere como se explica en 9.2, sustituyendo el medio reactivo (9.1) por los diferentes medios de la gama patrón de p-nitrofenol de 0 a 50µg/ml (7). 10. Cálculos 10.1 Realización de una cinética De forma general, el cálculo de la actividad enzimática sólo puede realizarse si el sustrato y la enzima no existen en cantidades limitantes. En tal caso nos situamos en la fase ascendente de la representación cinética: la actividad enzimática es lineal en el tiempo. De lo contrario, la actividad se subestimaría (Figura 1). 4

5 cinética de reacción enzimática absorbancia fase ascendente llanura tiempo (minutos) Figura 1: cinética de reacción enzimática Se realiza una cinética durante 12 minutos. La actividad en cuestión se mide a T=1 min T=2 min, T=4 min, T=6 min T=8 min T=10 min, T=12 min Una vez realizada la cinética de reacción enzimática, establezca la curva de variación de la absorbancia en función del tiempo de reacción. La absorbancia corresponde a la diferencia entre la absorbancia en un tiempo T de la preparación enzimática y del blanco correspondiente. A continuación, calcule la ecuación (1) de la recta de regresión, teniendo en cuenta únicamente los puntos de la fase ascendente (véase Figura 1) Realización de la recta de calibrado La recta de calibrado corresponde a la elaboración de un gráfico que tiene en el eje de las abscisas las diferentes concentraciones de la gama patrón de p.nitrofenol (de 0 a 0,36 µmol/ml) y en el de las ordenadas los valores de las densidades ópticas correspondientes, obtenidos en 9.4. A continuación, calcule la recta de regresión (2) resultante de la linealidad de los datos del gráfico Cálculo de la actividad enzimática A partir de la recta de regresión (1), calcule la absorbancia para un tiempo medio T (por ejemplo, 4 min en el caso de la Figura 1) y deduzca la cantidad Q de p-nitrofenol liberado (en µmoles) durante ese tiempo intermedio mediante la ecuación (2). La fórmula para calcular la actividad enzimática en U/g de preparación es la siguiente: 1000 Q T V C Actividad en U/g = ( ) ( ) Donde Q: cantidad de p.nitrofenol formado en µmoles durante un tiempo T (min) V: cantidad de solución enzimática introducida (ml); aquí, 0,1 ml C: concentración de la solución enzimática (g/l); aquí, 2 g/l Seguidamente es posible expresar la actividad enzimática en nanokatales. Esta unidad corresponde al número de nanomoles de producto formado por segundo en las condiciones definidas por los protocolos de las dosificaciones; por tanto: París, 15 de junio de

6 Actividad en nkat/g = actividad en U/g*1.000/ Características La repetibilidad del método se estima mediante la media de las desviaciones estándar de los valores de absorbancia obtenidos de la misma extracción de la preparación enzimática, dosificada 5 veces. Por lo tanto, para la dosificación de la ß-D-Glucosidasa la media de las desviaciones estándar de los valores es de 0,01 con un porcentaje de error de 8,43. El % de error corresponde a: (promedio de las desviaciones estándar de los valores x 100) promedio de los valores de los ensayos Así, el método de dosificación tal como se ha presentado se considera repetible. Los ensayos de reproducibilidad se han realizado utilizando 2 preparaciones enzimáticas y 5 tomas de muestras para cada una. Se han utilizado 2 tests que han permitido determinar la correcta reproducibilidad del método: - el análisis de la varianza (estudio de la probabilidad de aparición de desviaciones entre las tomas de muestras). El análisis de la varianza es un método estadístico que permite demostrar la hipótesis de homogeneidad de un conjunto de k medias. Realizar el análisis de la varianza consiste en buscar si el efecto de tratamiento es significativo o no - la potencia del ensayo con riesgo á de primera especie (5%) (el riesgo á de primera especie es el riesgo de decidir que tratamientos efectivamente idénticos son diferentes). Una potencia baja ( 20%) significa que no se ha detectado ninguna diferencia entre los tratamientos, aunque son pocas las probabilidades de detectar una diferencia si realmente existe alguna. Una potencia elevada ( 80%) significa que no se ha detectado ninguna diferencia entre los tratamientos, aunque si existe alguna disponemos de los medios para detectarla. Los resultados aparecen en la Tabla 2. Dosificaciones Hipótesis del análisis de varianza Probabilidad Potencia del ensayo (α = 5%) Test de Newman- Keuls (*) Test de Bonferroni (**) ß-D-Glucosidasa Respetadas 0, % No significativo No significativo Tabla 2: análisis de la varianza: estudio del efecto de toma de muestra * Test de Newmann-Keuls: este test de comparación de medias permite crear grupos homogéneos de tratamientos: los pertenecientes a un mismo grupo se consideran no diferentes al riesgo á de primera especie elegido. ** Test de Bonferroni: también llamado "test de t corregida", el test de Bonferroni permite realizar todas las comparaciones de 2 en 2 de media, esto es, (t (t-1) )/2 comparaciones antes de los tratamientos, respetando el riesgo α de primera especie elegido. París, 15 de junio de

7 De este modo, los ensayos utilizados permiten apreciar una diferencia, si realmente existe alguna (potencia del ensayo fuerte). Además, el método de dosificación presenta una probabilidad de aparición de desviación de actividad (entre tomas de muestras) inferior al 5%, reforzada por una pertenencia a un mismo grupo (Test de Newmann-Keuls no significativo) y considerada como no diferente al riesgo α de primera especie (Test de Bonferroni no significativo). París, 15 de junio de