RESOLUCIÓN OIV-OENO

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1 RESOLUCIÓN OIV-OENO DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA GLUCOSIDASA EN LOS PREPARADOS ENZIMÁTICOS - REVISIÓN DE LA MONOGRAFÍA (OIV-OENO ) LA ASAMBLEA GENERAL, Visto el artículo 2 párrafo 2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el que se crea la Organización Internacional de la Viña y el Vino, Considerando la resolución Oeno 5/2007 relativa a la determinación de la actividad glucosidasa en preparaciones enzimáticas, Por propuesta del grupo de expertos Especificación de los productos enológicos, Teniendo en cuenta que las moléculas aromáticas se encuentran de forma parcial bajo la forma de glucósidos, que están vinculados principalmente con la glucosa; la medición de la actividad enzimática capaz de cortar este vínculo específico es el objeto de la monografía (Oeno 5/2007). No obstante, esta actividad no es realmente eficaz si la glucosa a su vez está unida a otros tipos de azúcares; siendo este el caso de la mayoría de los precursores aromáticos. Se trata esencialmente de la apiosa, la arabinosa, la ramnosa y la xilosa. Con el fin de medir la eficacia real de la preparación enzimática para obtener el potencial aromático de la uva o del vino, conviene sustituir la monografía relativa a la actividad ß- D-glucosidasa por una nueva que describa las glicosidasas activas en los precursores de aroma heterósidos. DECIDE completar la monografía relativa a la determinación de la actividad glicosidasa en preparaciones enzimáticas que aparece en el Codex Enológico Internacional mediante el siguiente anexo relativo a las mediciones de las actividades arabinofuranosidasa, ß-Dgalactosidasa, ramnosidasa y xilosidasa. 1

2 Determinación de varias actividades glucosidasas en preparaciones enzimáticas β-d-galactosidasa (EC CAS núm ) -L-arabinofuranosidasa (EC CAS núm ) -L-rhamnosidasa (EC CAS núm ) β-d-xilosidasa (EC CAS núm ) Especificaciones generales Estas actividades enzimáticas están presentes normalmente, entre otras actividades, en complejos enzimáticos A menos que se indique lo contrario, las especificaciones deberán cumplir con la resolución Oeno relativa a las especificaciones generales para las preparaciones enzimáticas incluidas en el Codex Enológico Internacional. 1. Origen Se hace referencia al punto 5 Fuentes de enzimas y medios de fermentación de la monografía general relativa a las preparaciones enzimáticas. Las preparaciones enzimáticas que contengan estas actividades proceden de fermentaciones dirigidas directas de Aspergillus niger, por ejemplo. 2. Ámbito de aplicación Se hace referencia al Código Internacional de las Prácticas Enológicas, Oeno 16/04 y 17/04. Las actividades glicosidasa se utilizan para revelar y fomentar aromas en los vinos. Esto se produce mediante la hidrólisis del azúcar de sus precursores glicosilados. También se podrán añadir las enzimas al mosto, pero sus eficacias tecnológicas permanecerán inactivas hasta que finalice la fermentación alcohólica. 3. Principio Las preparaciones enzimáticas comerciales de actividad de glucosidasas contienen enzimas capaces de hidrolizar los vínculos glucosídicos entre la glucosa y otros azúcares, especialmente la apiosa, la galactosa, la arabinosa, la ramnosa y la xilosa que permiten a continuación la liberación de los compuestos aromáticos unidos a la glucosa gracias a la actividad glucosidasa. De la misma manera, estas enzimas pueden hidrolizar el vínculo de compuestos de síntesis constituido por diferentes tipos de compuestos glucosídicos y p-nitrofenol. Esto permite medir estas diferentes actividades. Determinación de la actividad β-d-galactosidasa La hidrólisis enzimática de la β-dgalactopiranosida de p-nitrofenilo, que es incolora, libera galactosa y para-nitrofenol (p- Np); este último toma un color amarillo en presencia de carbonato de sodio, cuya absorbancia se mide en 400 nm. 2

3 Determinación de la actividad -L-arabinofuranosidasa La hidrólisis enzimática de la -L-arabinofuranosida de p-nitrofenilo, que es incolora, libera arabinosa y p-nitrofenol (p-np); este último toma un color amarillo en presencia de carbonato de sodio, cuya absorbancia se mide en 400 nm. Determinación de la actividad -L-ramnosidasa La hidrólisis enzimática de la -L-ramnopiranosida de p-nitrofenilo, que es incolora, libera ramnosa y p-nitrofenol (p-np); este último toma un color amarillo en presencia de carbonato de sodio, cuya absorbancia se mide en 400 nm. Determinación de la actividad β-d-xilosidasa La hidrólisis enzimática de la β-d-xilopiranosida de p-nitrofenilo, que es incolora, libera xilosa y p-nitrofenol (p-np); este último toma un color amarillo en presencia de carbonato de sodio, cuya absorbancia se mide en 400 nm. 4. Equipo 4.1 Agitador magnético 4.2 Tanque de agua a 40 C 4.3 Tanque de agua a 100 C 4.4 Cubas de 1 cm de recorrido óptico, desechables, para espectrofotómetro, para medición en lo visible 4.5 Hielo machacado 4.6 Jeringas de precisión µl 4.7 Jeringa de precisión 100 µl 4.8 Jeringa de precisión 1000 µl 4.9 Espectrofotómetro 4.10 Tubo Eppendorf 4.11 Matraz aforado de 100 ml 4.12 phmetro 4.13 Cámara de frío a 4 C 4.14 Rejilla metálica para tubos Eppendorf 4.15 Algodón cardado 4.16 Papel Kraft 4.17 Agotador tipo vórtex 4.18 Cronómetro 4.19 Tubos de vidrio de 15 ml 5. Productos 5.1 Carbonato de sodio (Na 2 CO 3 puro a 99,5% - PM : 105,99 g/mol) 5.2 Acetato de sodio (NaCH 3 COO puro a 99% - PM : 82g/mol) 5.3 Ácido acético (CH 3 COOH puro a 96% - PM : 60g/mol) 5.4 p-nitrofenol (p-np) (C 6 H 5 NO 3 puro a 99,5% - PM : 139,11 g/mol) 5.5 Agua destilada 5.6 Preparación enzimática comercial por analizar y en función de la medición de la actividad por considerar: 5.7a β-d-galactopiranosida de p-nitrofenilo (Sigma ref. N1252, 250 mg) a modo de ejemplo 5.7b -L-arabinofuranosida de p-nitrofenilo (Sigma ref. N3641, 10 mg) a modo de ejemplo 5.7c -L-ramnopiranosida de p-nitrofenilo (Sigma ref. N7763, 100 mg) a modo de ejemplo 5.7d β-d-xilopiranosida de p-nitrofenilo (Sigma ref. N2132, 500 mg) a modo de ejemplo 3

4 6. Soluciones Para la determinación de -L-arabinofuranosidasa o -L-ramnosidasa 6.1 Tampón de acetato de sodio (100 mm, ph 4,0) Constituido por las soluciones A y B Solución A: introducir 0,984 g de acetato de sodio (5.2) en 60 ml de agua destilada (5.5) Solución B: introducir 2 ml de ácido acético (5.3) en 175 ml de agua destilada (5.5) Preparación del tampón de acetato de sodio: Mezclar 78 ml de solución A (6.1.1) ml de solución B (6.1.2). Verificar el ph del tampón con ayuda de un phmetro (4.12). Conservar a 4 C Para la determinación de la actividad β-d-galactosidasa o β-d-xilosidasa 6.1 Tampón de acetato de sodio (100 mm, ph 4,0) Constituido por las soluciones A y B Solución A: introducir 0,984 g de acetato de sodio (5.2) en 60 ml de agua destilada (5.5) Solución B: introducir 2 ml de ácido acético (5.3) en 175 ml de agua destilada (5.5) Preparación del tampón de acetato de sodio: Mezclar 36 ml de solución A (6.1.1) ml de solución B (6.1.2). Verificar el ph del tampón con ayuda de un phmetro (4.12). Conservar a 4 C 6.2 Soluciones reactivas (en función de la medición de la actividad enzimática por considerar) a) Solución de -L-arabinofuranosida p-nitrofenilo 4 mm Poner 0,086 g de -L-arabinofuranosida de p-nitrofenilo (5.4) en 80 ml de tampón de acetato de sodio (6.1). b) Solución de β-d-galactopiranosida de p-nitrofenilo 4 mm Poner 0,096 g de β-d-galactopiranosida de p-nitrofenilo (5.4) en 80 ml de tampón de acetato de sodio (6.1). c) Solución de -L-ramnopiranosida p-nitrofenilo 4 mm Poner 0,091 g de -L-ramnopiranosida de p-nitrofenilo (5.4) en 80 ml de tampón de acetato de sodio (6.1). d) Solución de β-d-xilopiranosida de p-nitrofenilo 4 mm Poner 0,0868 g de β-d-xilopiranosida de p-nitrofenilo (5.4) en 80 ml de tampón de acetato de sodio (6.1). 6.3 Solución de carbonato de sodio 1M Disolver 10,6 g de carbonato de sodio (5.1) en 100 ml de agua destilada (5.5) en un matraz aforado de 100 ml (4.11). La solución puede ser almacenada a 4 C (4.13). 6.4 Solución madre de p-nitrofenol a 125 g/ml Disolver 0,01 g de p-nitrofenol (5.4) en 80 ml de agua destilada (5.5). La solución madre debe prepararse extemporáneamente. 7. Preparación de la gama patrón de p-nitrofenol de 0 a 100 µg/ml Está constituida a partir de la solución madre de p-nitrofenol (6.4) como se indica en la tabla 1. 4

5 Tabla 1: Gama patrón de p-nitrofenol (p.np) Cantidad de p-np (µg) Concentración de p-np (µg/ml) Concentración de p-np (µmol/ml) 0 0,14 0,2 9 0,43 0,5 8 0,72 Volumen de solución madre (6.4) (µl) Agua destilada (5.5) (µl) Preparación de la muestra Es importante homogeneizar la preparación enzimática antes de tomar la muestra, mediante inversión, por ejemplo. La solución enzimática y los blancos deberán prepararse extemporáneamente. 8.1 Soluciones enzimáticas Para la determinación de la actividad -L-ramnosidasa o β-d-xilosidasa Solución enzimática a 10 g/l Colocar 1 g de preparación comercial (5.6) en un matraz aforado de 100 ml (4.11), completar con agua destilada (5.5), agitar (4.1) con el fin de obtener una mezcla homogénea. Para la determinación de la actividad -L-arabinofuranosidasa Solución enzimática a 1 g/l Colocar 100 mg de preparación comercial (5.6) en un matraz aforado de 100 ml (4.11), completar con agua destilada (5.5), agitar (4.1) con el fin de obtener una mezcla homogénea. Para la determinación de la actividad β-d-galactosidasa Solución enzimática a 2 g/l Colocar 100 mg de preparación comercial (5.6) en un matraz aforado de 100 ml (4.11), completar con agua destilada (5.5), agitar (4.1) con el fin de obtener una mezcla homogénea. 8.2 Blanco desnaturalizado por calefacción Poner 10 ml de la solución enzimática (8.1) en un tubo de 15 ml (4.19), tapar con algodón cardado (4.15) cubierto con papel Kraft (4.16) y sumergir el tubo durante 5 minutos en el tanque de agua a 100 C (4.3). 9. Método de trabajo 9.1 Reacción enzimática: Los tubos se realizan por duplicado como mínimo. En 6 tubos Eppendorf (4.10) numerados de 1 a 6, colocados en una rejilla (4.14) de hielo machacado (4.5) introducir 100 µl de la solución reactiva por considerar (6.2), con ayuda de una jeringa de precisión (4.7), 100 µl de la solución enzimática correspondiente (8.1), poner en marcha el cronómetro (4.18) 5

6 absorbance Tras la agitación (4.17), los tubos Eppendorf se colocan en el tanque de agua a 40 C (4.2) durante 1 min para el tubo núm.1 durante 5 min para el tubo núm. 2 durante 10 min para el tubo núm. 3 durante 15 min para el tubo núm. 4 durante 20 min para el tubo núm. 5 durante 30 min para el tubo núm. 6 La reacción se detiene colocando cada uno de los tubos numerados de 1 a 6 inmediatamente después de que se hayan quitado del tanque de agua a 40 C, en una rejilla de hielo machacado (4.5) 9.2 Determinación del p-nitrofenol liberado A partir de los tubos Eppendorf con los diferentes medios reactivos (9.1), agregar 600 µl de la solución reactiva por considerar (6.3), con ayuda de una jeringa de precisión (4.8) y 1,7 ml de agua destilada (5.5), con ayuda de una jeringa de precisión (4.6). Poner la mezcla resultante en una cuba (4.4). Enseguida medir la absorbancia a 400 nm, con ayuda de un espectrofotómetro (4.9) También se puede simplificar indicando: Véase punto 8.2 de la medición de la actividad β-d-glucosidasa. 9.3 Blancos Operar como se describe en 9.1 reemplazando la solución enzimática (8.1) con el blanco desnaturalizado por calefacción (8.2). Lo ideal es realizar la reacción enzimática de los blancos al mismo tiempo que la de la solución enzimática. 9.4 Gama patrón Operar como se describe en 9.2 reemplazando el medio reactivo (9.1) con los diferentes medios de la gama patrón de p-nitrofenol de 0 a 100 µg/ml (7). 10. Cálculos 10.1 Cinéticas químicas De manera general, el cálculo de la actividad enzimática solo puede hacerse cuando el sustrato y la enzima no están en cantidades limitantes. Nos situamos entonces en la fase ascendente de la representación cinética: la actividad enzimática es lineal en el tiempo. En caso contrario, la actividad sería subestimada (figura 1). cinétique Cinética de de réaction reacción enzymatique enzimática 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 phase ascendante temps (min) plateau 6

7 Figura 1: Cinética de reacción enzimática Se realiza una cinética en 30 minutos. Se mide la actividad considerada en T=2 min, T=5 min, T=10 min, T= 15 min, T=20 min, T= 30 min. Tras haber calculado la cinética de la reacción enzimática, establecer la curva de variación de la absorbancia en función del tiempo de reacción. La absorbancia corresponde a la diferencia entre la absorbancia en un tiempo T de la preparación enzimática y del blanco correspondiente. Después, calcular la ecuación (1) de la curva de regresión tomando en cuenta sólo los puntos de la fase ascendente (véase figura 1) Realización de la recta de muestreo La recta de muestreo corresponde al establecimiento de una gráfica que tenga por abscisa las diferentes concentraciones de la gama patrón de p-nitrofenol (de 0 a 0,72 µmol/ml) y por ordenada los valores de densidades ópticas correspondientes, obtenidos en 9.4. Después, calcular la curva de regresión (2) resultante de la linealidad de los datos de la gráfica Cálculo de las actividades enzimáticas A partir de la curva de regresión (1) calcular la absorbancia para un tiempo medio T (por ejemplo 4 min para el caso de la figura 1) deduciendo la cantidad Q de p-nitrofenol liberado (en µmoles) para este tiempo intermedio con ayuda de la ecuación (2). La fórmula para calcular la actividad enzimática en U/g de preparación es la siguiente: Actividad en U/g = Q/T/V/C*1000 Donde: Q: cantidad de p-nitrofenol en µmoles durante un tiempo T (min) V: cantidad de solución enzimática introducida (ml) aquí 0,1 ml C: concentración de la solución enzimática (g/l) aquí 10 g/l Después, es posible expresar la actividad enzimática en nanokatales. Esta unidad corresponde al número de nanomoles de producto formado por segundo en las condiciones definidas por los protocolos de determinación y por lo tanto: Actividad en nkat/g = actividad en U /g *1000/60 7

8 11. Reproducibilidad La reproducibilidad del método se estima con la media de las desviaciones estándar de los valores de absorbancia resultantes de una toma de muestra de la misma preparación enzimática, determinada 5 veces. La siguiente tabla recapitula los resultados: Actividad Media de las desviaciones estándar de los valores Porcentaje de error (%) -L-arabinofuranosidasa 0 5 β-d-galactosidasa 0,03 3,78 -L-ramnosidasa 0,001 4,66 β-d-xilosidasa 0,03 3,78 El % de error corresponde a: (media de las desviaciones estándar de los valores x 100) media de los valores de los ensayos Así, el método de determinación tal como se presenta es considerado reproducible. Los ensayos de reproducibilidad han sido realizados con ayuda de 2 preparaciones enzimáticas y 5 tomas de muestra para cada una. Se han utilizado 2 pruebas que han permitido determinar la buena reproducibilidad del método: - El análisis de varianza (estudio de la probabilidad de aparición de desviaciones entre las tomas de muestra). El análisis de varianza es un método estadístico que permite probar la hipótesis de homogeneidad de un conjunto de valores k medios. Realizar el análisis de varianza consiste en investigar si el efecto tratamiento es o no - La capacidad del ensayo con riesgo de primera especie (5%) El riesgo de primera especie es el riesgo de considerar que los tratamientos idénticos son diferentes. - Si la capacidad es débil ( 20%), esto quiere decir que no se ha detectado ninguna diferencia entre los tratamientos y que la probabilidad de detectar una diferencia en caso de que realmente existiera, es mínima. - Si la capacidad es alta ( 80%), esto quiere decir que no se ha detectado ninguna diferencia entre los tratamientos, pero que si existiera alguna, tendríamos los medios para detectarla. Los resultados se muestran en la tabla 2. Determinaciones Hipótesis del análisis de varianza Probabilid ad Capacidad del ensayo ( = 5%) Test Newman- Keuls (*) Test Bonferroni (**) -Larabinofuranosidasa Realizadas 0, % No No 8

9 β-d-galactosidasa Realizadas 0,01 75% No -L-ramnopiranosida Realizadas 0,006 65% No β-d-xilosidasa Realizadas 0, % No No No No Tabla 2: Análisis de varianza estudio del efecto toma de muestra * Test Newmann-Keuls: esta prueba de comparación de medias permite constituir grupos homogéneos de tratamientos: los que pertenecen a un mismo grupo no se consideran diferentes al riesgo de primera especie elegido. ** Test de Bonferroni: también llamado corrección de Bonferroni, el test de Bonferroni permite realizar todas las comparaciones 2 a 2 de media, p. ej. (t (t-1) )/2 comparaciones antes de tratamientos, respetando el riesgo de primera especie elegido. Así, los ensayos aplicados permiten ver una diferencia si realmente existe alguna (capacidad de ensayo fuerte), además el método de determinación presenta una probabilidad de aparición de desviación de actividad (entre tomas de muestra) inferior a 5%, reforzada mediante una pertenencia a un mismo grupo (Test Newmann-Keuls no ) y considerada como no diferente al riesgo de primera especie (Test Bonferroni no ). 12. Bibliografía M. Lecas. Thèse de Doctorat, Composition et structure des polymères constitutifs des parois cellulaires de la pellicule de la baie de raisin. Application d enzymes fongiques liquéfiant les parois à fins d extraction des substances odorantes. Dugelay. Thèse de Doctorat, L arôme du raisin : étude des précurseurs hétérosidiques et des activités enzymatiques exogènes impliquées dans leur hydrolyse Applications technologiques. 9