GUIA 7 Cinética y reactores enzimáticos

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1 GUIA 7 Cinética y reactores enzimáticos Un pesticida inhibe la actividad de una mezcla alfa, que luego deberá ser utilizada para la detección de este pesticida. A partir de los valores consignados en la tabla adjunta, determinar: V (ml/l min) 10-6 S (mol/l) Sin inhibidor 10-5 M inhibidor a) Parámetros cinéticos b) Expresión de la cinética de inhibición correspondiente a partir del equilibrio cinético c) 50 ml de la misma solución enzimática de la parte (a) se mezcla con 50 ml de una solución M de sustrato y 25 ml de muestra problema (con pesticida), observándose una velocidad inicial de 43 µmol/min. Calcular la concentración de inhibidor en la muestra problema, asumiendo que en ella no existe cantidad alguna de sustrato Un reactor batch de tanque agitado, esta produciendo Magneso peroxidasa a través del cultivo de Trametes versicolor, cuando se introduce a la corriente de alimentación un inhibidor que actúa competitivamente con el sustrato. Determine el tiempo necesario para convertir una concentración inicial de S o a S de sustrato. Deje la expresión en función de los parámetros cinéticos (K m, K i, V m ), concentración de células, S o y S En relación con cinética enzimática, responda las siguientes preguntas: a) Explique cuáles son las diferencias que presenta una gráfica 1/v vs 1/S de una inhibición no competitiva frente a una inhibición competitiva por sustrato. b) Qué pasa con los valores de K M y V máx en cada caso? c) Diseñe un experimento para mostrar en forma comparativa, cuándo la enzima es inhibida en forma competitiva y cuando es no competitiva Se conoce parcialmente la reacción de inhibición de la hidrólisis de la urea por ureasa. Los datos de la hidrólisis de la reacción se dan a continuación para dos concentraciones de sustrato. a) Determine la constante de Michaelis-Menten para esta reacción. b) Qué tipo de inhibición tiene esta reacción? Fundamente su respuesta. c) Basada en la respuesta de la parte b, Cuál es el valor de Ki?. S 1 = 0.2 M S 2 = 0.02M 1/v I 1/v I

2 7.5.- Los siguientes datos fueron obtenidos para dos concentraciones iniciales de enzima para una reacción catalizada por esta enzima: [ S ] (g/l) V (g/l min) [E 0 ] = g/l V (g/l min) [E 0 ] = g/l a) Encontrar K m b) Encontrar V m para [E 0 ] = g/l c) Encontrar V m para [E 0 ] = g/l d) Encontrar K 2 (referida a reacción limitante) En el estudio de la cinética de la acción de una enzima que está sujeta a inhibición se han obtenido los siguientes datos experimentales. S (mmol) V (I = 0.1) V (I = 0.5) V (I = 0) I = mmol V = mmol/h a) Determine los parámetros cinéticos para cada una de las reacciones b) Qué tipo de inhibición es la que presenta el inhibidor sobre la enzima? Justifique Un carbohidrato A se descompone en presencia de enzima E. Se sospecha que el carbohidrato B, también presente en la mezcla, tiene algún efecto en esta descomposición. Para estudiar este fenómeno se realizaron experimentos con diferentes composiciones de A y B y flujo a través de un reactor perfectamente agitado (continuo operado en regimen estacionario) de volumen 240 cm 3. a) A partir de los datos mostrados en la tabla, encuentre la ecuación de la velocidad de reacción de descomposición de A b) Qué puede señalar respecto al papel de B en la descomposición S 0 (mol/m 3 ) A (mol/m 3 ) B (mol/m 3 ) F (cm 3 /min) E 0 (mol/m 3 )

3 7.8.- Durante la purificación de una proteína (A) se encuentra que la acción enzimática es inhibida por un compuesto (B). A partir de la siguiente información encuentre el tipo de inhibición y todos sus parámetos. S Velocidad de consumo de la proteína (µmol / L min ) Concentración de proteína (µmol/l) V (sin inhibidor) V ( I = 2.5 µmol/l ) Usted está trabajando con una enzima sujeta a inhibición por sustrato. Los parámetros cinéticos son: V m = 1 min -1 K m = 2 mmol K SI = 0.1 mmol Cuál será el tiempo de residencia que necesitaría usar en un reactor de tanque agitado para obtener una conversión del 50%, si la concentración de sustrato en la alimentación es de 100 mmol? La cinética de conversión de lactosa por β-galactosidasa se puede asumir sigue la cinética de Michaelis-Menten, con parámetros K 2 = 0.6 (mmol/mg ε min) y K m = 0.5 mm. Si la concentración de lactosa en la alimentación es de 10 mm, calcule: a) El tiempo de reacción en operación batch en un reactor perfectamente agitado si se necesita una conversión del 95% de lactosa para una concentración de enzima de 75 mg/ml. b) El tiempo de residencia en un reactor continuo para el mismo grado de conversión con las mismas concentraciones de enzima y lactosa Para la determinación de V max y de K m por inspección, no es necesario recurrir a métodos gráficos muy sofisticados. Dichos valores pueden determinarse rápidamente a partir de las velocidades de reacción con concentraciones de sustrato crecientes. Empleando las definiciones de V max y de K m, calcular el valor aproximado de los parámetros antes mencionados de la reacción catalizada por una enzima a partir de la cual se obtuvieron los siguientes datos: [S] (M) 2.5 x x x x x x x x 10-2 V (mol/l min) En un experimento de laboratorio dos estudiantes aislaron independientemente la anzima lactato deshidrogenasa de corazón de pollo, que cataliza la reducción de piruvato a lactato. La enzima se obtuvo en forma de disolución concentrada. Los estudiantes midieron después la actividad de sus propias disoluciones enzimáticas en función de la concentración de sustrato en condiciones idénticas y determinaron de este modo la V max y la K m de sus preparaciones. Cuando compararon sus resultados observaron que sus valores de K m eran idénticos pero sus valores de V max eran radicalmente diferentes. Uno de los estudiantes argumentaba que los diferentes valores de V max confirmaban que habían aislado diferentes formas de la enzima. El otro estudiante razonaba que a pesar de la diferencia de los valores de V max habían aislado la misma forma de la enzima. Cuál de los estudiantes formulaba la afirmación correcta?, explicar. Cómo podrían resolver la discrepancia? Explicar De acuerdo a la relación de la velocidad de reacción y la concentración de sustrato, según la ecuación de Michaelis-Menten, determinar: a) A qué concentración de sustrato mostrará una enzima la cuarta parte de su velocidad máxima, si el máximo de velocidad en la transformación del sustrato es de 30 µmol/min mg y K m = M? b) Determinar la fracción de V max que se encontraría a una concentración de sustrato de ½ K m, 2K m y 10K m 3

4 Una enzima fue analizada a una concentración de sustrato inicial de 10-5 M, el valor de K m del sustrato es de 2x10-3. Al cabo de 1 min el 2% del sustrato ha sido convertido en producto. a) Qué concentración de sustrato ha sido convertido en producto al cabo de 3 min y cuál es la concentración de producto? b) Cuál es la velocidad máxima posible? c) Alrededor de qué concentración de sustrato se obtiene V m? d) A esta concentración, Qué porcentaje de sustrato es convertido en producto al cabo de 3 minutos? Determinar en forma directa y de acuerdo a los datos que se entregan a continuación si la reacción (S P) presenta inhibición competitiva o no competitiva (la concentración del inhibidor de la reacción inhibida es de 0.01 mm). Argumente su respuesta. Determine las constantes cinéticas para ambos casos. S (mm) v (mm/min) s/i v (mm/min) c/i Un microorganismo tiene una enzima que hidroliza glucosa 6 fosfato (G6P). El seguimiento de la reacción está basada en el seguimiento de la formación de glucosa. La enzima libre de entrada se caracteriza por tener un K m = 6.7x10-4 M y una V m = 300 mmoles/l min. Se produce una inhibición de tipo competitiva debido a la adición de galactosa 6 fosfato. Para una concentración de 10-5 de galactosa 6 fosfato y de 2x10-5 M de G6P, la velocidad de reacción es 1.5 mmoles/l min. Calcular K I para la G6P Una enzima tiene una constante de saturación K m = 4.7x18-5 M, la velocidad máxima de la preparación es 22 µmol/l min. Qué velocidad observará en presencia de una concentración de sustrato de 2x10-4 M y de un inhibidor a concentración de 5x10-4 M en los casos de: a) Inhibición competitiva b) Inhibición no competitiva c) Grado de inhibición en cada uno de los casos Un extracto de levadura conteniendo lactasa ( lactosa glucosa + galactosa ) tiene condiciones óptimas de actividad de 45 C y ph 6.4. Una forma de determinar la actividad del extracto es por medio del método del ortonitrofenolgalactósido (ONPG), el cual consiste en agregar 1.5 ml de extracto diluido, 2.7 ml de tampón fosfato y 0.1 ml de solución de mercaptoetanol. Se incuba por 3 minutos a 40 C, luego de lo cual se le adiciona 0.1 ml de solución sustrato ONPG 0.068M incubando a diferentes tiempos. La reacción se detiene sumergiendo los tubos en un baño de agua a ebullición por 5 minutos. Luego, se lee la densidad óptica a 410 nm. El coeficiente de extinción es de 0.2, y l=1 dm. La reacción catalizada es la siguiente : ONPG lactasa ONP + Galactósido amarillo, se mide a 420 nm Los resultados de D.O. [g/l*min] son los siguientes : (b) blanco realizado sólo con sustrato y 4.2 ml de tampón t (min) 1:10 1: (b) Determinar la actividad del extracto, si se tiene que 1 UI = cantidad de enzima que libera 1 µmol de ONP en 1 minuto. 4

5 Se diseña un método para determinar la actividad de una enzima. Para ésto se incuban 0.6 ml de muestra con 0.6 ml de celobiosa, deteniendo la reacción con 0.2 ml de Na 2 CO 3. Se sabe que la rección es celobiosa E3 2 glucosa La muestra se obtiene al diluir 1 ml de caldo en 13 ml de H 2 O. En mediciones de absorbancia : ε = 0.22 t 1:5 1:10 1: l = 1 cm de celda A = L * ε * C C [g/l] t [min] [UI] = µmoles de S / seg Para determinar la actividad de β-glucosidasa producida por fermentación de Kluyveromyces fragilis la célula se homogeniza extrayendo con esto la enzima. Las mediciones se realizan con 50 mg de células homogenizadas, las cuales son diluidas, a ph y T óptimos, según: a) 150 ml de tampón, b) 70 ml de tampón, c) 250 ml de tampón. Se mezclan 5 ml de solución de lactosa 50 g/l en tampón ph 6.5 y 1 ml de solución de levadura permeabilizada según (a), (b) y (c). Los resultados, luego de 5 y 10 minutos, son los siguientes: t (min) a b c 5 (b1) (b2) Determinar el rango lineal y la actividad del homogenizado La enzima fructofuranosidasa (invertasa) seca de Sigma Chemical Company, extraída de levadura de panificación, tiene condiciones óptimas analíticas de 55 C y ph 4.5. Para la determinación de la actividad enzimática, se preparó una solución de 500 ppm del preparado enzimático comercial, el cual se utilizó como solución stock. Las muestras enzimáticas (diluidas convenientemente con tampón acetato 0.05M) fueron analizadas incubando 1 ml de muestra enzimática diluida por un lapso de tiempo en 4 ml de solución de sacarosa 50 g/l. Luego de ese tiempo, la enzima es inactivada con 0.1 ml de NaOH 10N, con lo cual la solución enzimática alcanza un valor de ph cercano a 11. La concentración de glucosa es determinada mediante el método de Folin-Wu, leyendo absorbancia a 420 nm. La curva de calibrado para glucosa indica que: D.O. = 1.38 *C donde D.O. = Absorbancia a 420 nm C = [g/l] de glucosa La sacarosa, que viene en polvo, tiene una pureza de un 98% y contiene un 1 % de glucosa. De acuerdo al procedimiento descrito, los resultados fueron los siguientes: Muestra enzimática (D.O.) tiempo de incubación (min) 1 : : * * Para t = 15 min, es 1 ml de enzima diluída en 4 ml de tampón. Determinar las UI del extracto enzimático seco. Indicar cualquier suposición hecha. 5

6 La enzima glutamato deshidrogenasa cataliza la siguiente reacción: glutamato + + NAD P + NADH + H Los siguientes valores experimentales fueron obtenidos en presencia y ausencia del inhibidor salicilato de sodio: S (mm) I = 0 I = 40 mm Calcular los valores de K m y K I e interpretar los resultados Se tiene una mezcla de 2 enzimas: E 1 y E 2, que reaccionan con A para dar un producto B. Obtener la expresión cinética para la reacción que da origen a B Defina el concepto de actividad enzimática y refiérase a la unidad que se utiliza para estandarizar su medición. Comente las razones por las cuales debe ser medida a tiempos iniciales de reacción y los factores que afectan su cuantificación Para el siguiente set de datos: + S (mm) Sin inhibidor Con inhibidor ([I] = 0.02 mm) V (mm/min) V (mm/min) Identificar el mecanismo de inhibición que presenta la reacción, argumentando adecuadamente su respuesta. Determine las constantes cinéticas para ambos casos y la constante de inhibición El Viejo Pascuero ha descubierto una nueva enzima que, por razones propias, denominó pascualasa. La pascualasa permite convertir la renosa (complejo azúcar de la leche de reno) en un azúcar fermentable. Lamentablemente, esta curiosa enzima sufre de inhibición por sustrato (K SI =0,05 mm). Si la concentración inicial de renosa es de 10 mm, con parámetros k 2 =0,6 mmol/(mg min) y K M =0,5 mm. Determine: a. El tiempo de reacción en operación batch en un reactor perfectamente agitado si se necesita convertir el 80% de la renosa presente, para una concentración de pascualasa de 30 mg/ml b. El tiempo de residencia en un reactor continuo operando en estado estacionario para obtener el mismo grado de conversión con las mismas concentraciones de enzima en el medio y lactosa en la alimentación. 6

7 En una reacción enzimática con dos sustratos, deducir la ecuación cinética correspondiente a un mecanismo aleatorio de formación de complejo ternario. Suponga además que el compuesto C, presente en el medio, inhibe competitivamente (inhibidor competitivo total) a la enzima Desarrolle la expresión cinética para la inhibición por sustrato (el sustrato forma un complejo reversible inactivo con el complejo ES). Derive además una expresión que permita determinar el tiempo de residencia en un reactor de tanque agitado para lograr una conversión de sustrato del 50% El Viejo Pascuero descubrió otra enzima, que llamó navidasa. La navidasa permite convertir la renosa (complejo azúcar de la leche de reno) en un azúcar fermentable, pero se inhibe competitivamente con un compuesto presente (1mM, K I = 0,1 mm) en esta leche. Si la concentración inicial de renosa es de 10 mm, con parámetros k 2 =0,6 mmol/(mg min) y K M =0,5 mm. Determine: c. El tiempo de reacción en operación batch en un reactor perfectamente agitado si se necesita una conversión del 90% de la renosa, para una concentración de navidasa de 80 mg/ml d. El tiempo de residencia en un reactor continuo operando en estado estacionario para obtener el mismo grado de conversión con las mismas concentraciones de enzima y lactosa La cinética de conversión de lactosa por β-galactosidasa se puede asumir sigue la cinética de Michaelis-Menten, con parámetros k 2 =0.6 (mmol/mg enz x min) y K M =0.5 mm. La concentración de lactosa en la alimentación es de 10 mm. El compuesto B, presente en el preparado en una concentración de 1 mm, es un inhibidor no competitivo (total). K I = 0.05 mm a. Determinar el tiempo de reacción en operación batch en un reactor perfectamente agitado si se necesita una conversión del 85% de la lactosa para una concentración de enzima de 75 mg/ml. b. Determinar el tiempo de residencia en un reactor continuo para igual grado de conversión con las mismas concentraciones iniciales de enzima y lactosa. 7