Del DNA a la proteína: regulación de la expresión génica

Transcripción

1 Genética Médica Tema 3 Del DNA a la proteína: regulación de la expresión génica Griffiths AJ et al., (2000) Tamarin RH (1996) Klug WS y Cummings MR (1999) Solari AJ (1999) Animaciones: Genética Médica Introducción Regulación de la expresión génica Metilación Impronta genómica Lionización del cromosoma X 1

2 Sabemos que Los productos de todos los genes son los RNA (ácidos ribonucleicos) i Transcripción: copia de DNA a RNA (transcritos) Estos RNA serán traducidos en la síntesis de una secuencia polipeptídica Traducción RNA Diferencias con el DNA Constituido por una sola cadena de nucleótidos puede adoptar muchas formas tridimensionales complejas El azúcar de sus nucleótidos es una ribosa. Presenta también esqueleto fosfato-ribosa Contiene Uracilo en lugar de Timina U A Tipos: RNA informativo RNA funcional 2

3 Tipos de RNA 1. RNA informativos: mrna (mensajeros) Es el intermediario en la síntesis del producto funcional definitivo del gen, la proteína. En eucariotas el transcrito se procesa para dar lugar al mrna 2. RNA funcionales Tipos de RNA RNA transferente (trna): transportadores de a.a. en la traducción RNA ribosómico (rrna): componentes de los ribosomas. Guías de ensamblaje de los a.a. en la traducción. RNA de interferencia (irna) / microrna: pequeñas moléculas que intervienen en la regulación génica RNA nuclear pequeño (snrna): implicados en la maduración del mrna, regulación de FT y mantenimiento de los telómeros RNA citoplasmático pequeño (scrna): involucrados en el transporte de proteínas Otros: snorna (modificaciones del rrna), scarna (biogénesis de snrnp), grna (edición del RNA), etc. 3

4 Tipos de RNA micro RNA Las operaciones que utilizan DNA y RNA se basan en la complementariedad de las secuencias nucleotídicas y en la unión de proteínas a sitios específicos 4

5 Transcripción: fases Iniciación Elongación Terminación Procesamiento del RNA Transcripción: fases 1. Iniciación en eucariotas: En los promotores de RNApol II: secuencias TATA Ei Existen otras secuencias reguladoras ld Se necesita la unión de factores de transcipción +1 5 GG(C/T)CAATCT TATA G 3-70 RNA polimerasa Promotor Caja CAAT -25 Caja TATA 5

6 Fases de la transcripción 2. Elongación: La RNA polimerasa cataliza la elongación 3 manteniendo una burbuja de transcripción Superenrollamiento de la cadena de DNA aguas arriba y aguas abajo acción de las topoisomerasas La RNA polimerasa no verifica la fidelidad de la copia Fases de la transcripción 3. Terminación: La polimerasa reconoce las señales de terminación: secuencias ricas en GC seguidas de 6 o más T Estas secuencias suponen la formación de lazos en el RNA y una cola de U El RNA y la polimerasa se disocian del DNA 5 UTR Segmento traducible a proteína 3 UTR Líder Trailer 6

7 Fases de la transcripción 4. Procesamiento del RNA eucariota: La transcripción da lugar al transcrito primario o pre-mrna Cada transcrito contiene un único gen Maduración: Unión de la caperuza: 7-Metilguanosina en el extremo 5 Corte del RNA 20 bases aguas debajo de la secuencia AAUAAA Adición de una cola poli(a) Eliminación de los intrones: mecanismo de corte y empalme Procesamiento del mrna en eucariotas 7

8 Transcripción inversa El RNA puede servir como molde para la síntesis de DNA Todos los virus RNA pueden producir DNA polimerasa dependiente del RNA (transcriptasa inversa o retrotranscriptasa) Eslaformadeinfectarlacélula célula Iniciación Elongación Terminación Traducción: fases 8

9 Iniciación 1. Unión del mrna a la subunidad pequeña del ribosoma 2. AUG primer codón en eucariotas Met 3. Unión del trna-met al sitio P (Peptidil) P A Elongación 4 4. Entra el segundo t-rna al sitio A (Aminoacil) 5. Enlace peptídico por la peptidil transferasa y salida del t-rna descargado 6. Se desplaza el mrna, el peptidil pasa al sitio P y entra el tercer t-rna al sitio A 5 6 P A P A P A 9

10 Terminación 7 7. La cadena se elonga hasta el codón stop 8. El codón stop es reconocido por un factor de terminación 9. El polipéptido se libera del sitio P y las dos subunidades del ribosoma se disocian P A 8 9 P A Resumen La secuencia de un polipéptido está determinada d por la secuencia de nucleótidos del gen en que está cifrada La cadena de mrna tiene la misma secuencia que la cadena sentido de DNA Los ribosomas leen el mrna de 3 en 3 nucleótidos empezando por

11 A lo largo de todo el proceso de transcripción y traducción se mantiene la colinealidad entre la secuencia de nucleótidos de un gen y la secuencia de aa de la proteína final El código genético Regla de correspondencia entre la secuencia de nucleótidos del DNA/RNA y la secuencia de a.a. de las proteínas Codón triplete: cada grupo de 3 nt Los ribosomas leen el mrna de 3 en 3 nucleótidos empezando por 5 3 Hay 4 nucleótidos 4x4x4=64 codones distintos (sólo 20 a.a.) 11

12 El código genético El código genético Ala 3 5 La especificidad codón-a.a. recae en el trna trna: Estructura de trébol El bucle central contiene el triplete denominado anticodón El anticodón se une al codón mediante emparejamientos RNA-RNA El anticodón está orientado 3 5 A ti El bucle 3 reconoce al ribosoma Cada trna es específico de un a.a. (unido a su extremo 3 ) Anticodón 12

13 El código genético El número de codones para un a.a. varía entre 1 y 6 Ala 3 Algunos aa son transportados al ribosoma por varios trna con distintos anticodones Ciertas especies de trna pueden colocar sus aa específicos en respuesta a varios codones mediante una hibridación relajada del extremo 3 del codón y 5 del anticodón tambaleo 5 Anticodón Características del código Desplazamiento de la pauta de lectura No está solapado: una base pertenece a un único triplete No existen signos de puntuación entre codones Es un código degenerado (1aa varios codones) Universalidad (con excepciones) 13

14 El código degenerado da cierta permisibilidad bld d a la aparición de mutaciones sin que suponga un cambio aminoacídico en la proteína Las proteínas Una proteína es una cadena de a.a. (polipéptido) Hay 20 a.a. que pueden constituir proteínas. 4 Niveles de organización de las proteínas: Estructura primaria: secuencia lineal de a.a. Estructura secundaria: interacciones entre a.a. próximos hélice α o láminas β (principalmente) Estructura terciaria: plegamiento de la hélice u otras estructuras secundarias Estructura cuaternaria: unión de dos o más estructuras terciarias La forma es esencial para la función de la proteína 14

15 Genética Médica Introducción Regulación de la expresión génica Metilación Impronta genómica Lionización del cromosoma X Objetivos de la regulación: Armonía estructural, equilibrio celular Diferenciación: típico de eucariotas pluricelulares La célula sólo sintetizará aquellas proteínas o enzimas que necesita. Esta síntesis está regulada de forma estricta. La regulación responderá a un estímulo. 15

16 Expresión génica Transcripcional Regulación de la expresión génica Procesamiento No todos los genes se expresan simultáneamente: Transporte - Genes constitutivos: se expresan a nivel constante - Genes regulados: se expresan en distinto grado según las condiciones DNA Transcripción RNAm maduro Polipéptido Proteína a.a. RNAt Niveles de regulación Traducción Traduccional Ribosoma Regulación génica en eucariotas: Responder a cambios fisiológicos (cambios ambientales) Circuitos genéticos regulados en el desarrollo (regulados por genes del desarrollo) La mayoría de los genes se regulan a nivel transcripcional 16

17 Señales de transcripción en eucariotas: Utilización de tres sistemas de transcripción: Genes de clase I: RNAr 5,8S, 18S y 28S RNA polimerasa I Genes de clase II: RNAm, snrna RNA polimerasa II Genes de clase III: RNAt, RNAr 5s, scrna RNA polimerasa III Cada polimerasa necesita secuencias de regulación diferentes, colocadas en distintos sitios Cada polimerasa requiere distintos factores de transcripción Las secuencias codificantes (exones) se alternan con las no codificantes (intrones) Regulación transcripcional en eucariotas: Control en cis de la transcripción: El promotor mínimo y los elementos proximales: GGGCGG CCAAT TATA -200pb -100pb -30pb mrna Intensificadores: activan la transcripción Silenciadores: reducen la transcripción inhibiendo a los activadores Son capaces de actuar a distancia (>50 kb) Pueden colocarse aguas arriba o abajo del promotor Poseen estructura compleja 17

18 Gen eucariota Inicio transcripción Intrón 1 Intrón 2 Intrón 3 Fin transcripción Promotor Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exón 4 Región reguladora aguas arriba 5 UTR Región reguladora interna Unidad de transcripción Región reguladora aguas abajo Regulación transcripcional en eucariotas: Los bucles de DNA acercan las proteínas reguladoras, unidas a intensificadores o silenciadores a las secuencias promotoras. Regulación transcripcional en eucariotas: Control en trans de la transcripción: Proteínas reguladoras que se unen al promotor y elementos proximales y ayudan a la polimerasa de RNA II a iniciar la transcripción (FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN) Tanto la regulación temporal como la específica de tejido dependerá de la presencia de los factores de transcripción Existe gran variedad de factores de transcripción: inductores, represores, mixtos Factores específicos de tejido o de un estadio de desarrollo 1 secuencia cis varios factores, 1 factor - varias secuencias 18

19 Regulación transcripcional en eucariotas: Estructura de las proteínas reguladoras: Presentan un dominio de unión al DNA que sobresale del cuerpo central de la proteína Frecuentemente presentan hélices alfa que encajan en el surco mayor del DNA Distintos motivos de unión al DNA Regulación transcripcional en eucariotas: Quién controla al controlador? Las proteínas reguladoras poseen dominios que interaccionan con señales moleculares del estado fisiológico de la célula Ejemplos: hormonas (determinación del sexo), calor (heat shock proteins), stress, metales, etc. 19

20 Regulación post-transcripcional en eucariotas: Maduración del RNAm: Protección del extremo 5 con CAP (G modificada) Corte 3 a la señal de poliadenilación (AAUAAA) Adición de cola de poli(a) (cientos de bases) Eliminación de intrones (maduración alternativa) Edición del RNA (corrección) Vida media variable Secuencias que otorgan inestabilidad Regulación post-transcripcional en eucariotas: RNA de interferencia (sirna) El RNA de interferencia es una técnica consistente en la introducción de un RNA exógeno de doble cadena (dsrnas) complementario a un RNAm conocido con el fin de destruir específicamente dicho RNAm, disminuyendo o impidiendo la expresión génica. El RNA de interferencia es una técnica de silenciamiento génico utilizada para estudiar la ausencia de una acción génica normal en cultivos celulares. El RNA de interferencia regula la expresión a nivel de RNAm y ofrece una vía rápida y sencilla de determinar la función de un gen in vitro. 20

21 Regulación post-transcripcional en eucariotas: RNA de interferencia (RNAi): Andrew Fire & Craig C. Mello (Nobel de Medicina 2006) Introducción dsrna Degradación del mrna homólogo Regulación post-transcripcional en eucariotas: microrna RNAs endógenos de doble cadena imperfecta que dan lugar a un microrna activo Función: Regulación de la expresión génica (disminuye) Funciones reguladoras del: Ciclo celular, división celular en el desarrollo embrionario, apoptosis, control del tamaño de órganos y tejidos Regulación de la producción de micrornas: promotores tipo RNA polimerasa de tipo II 21

22 microrna Animales: Unión a la 3 UTR 22

23 micrornas expresados en SNC de ratón Utilización en terapia Difícil introducir cadenas largas de dsrna en las células de mamíferos debido a la respuesta del interferón. Aplicaciones potenciales: Tratamiento de la degeneración macular y virus sincitial respiratorio Tratamienot de fallo hepático en ratones. Terapia antivírica (VIH, hepatitis) Tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Cáncer 23

24 Regulación post-traduccional en eucariotas: Proteolisis intracelular: Señales para la proteolisis: El extremo amino: metionina aa estabilizantes o desestabilizantes Secuencias PEST corta vida media (enzimas del control metabólico, factores de transcripción, quinasas, fosfatas y ciclinas) Cajas de destrucción RAALGNISN (ciclinas) Motivos KEFRQ degradación lisosomal Sistemas de proteolisis intracelular: Lisosomas (endopeptidasas y exopeptidasas) Ubiquitinación: unión de ubiquitina Calpaínas: proteasas dependientes de Ca Proteosoma 26S:cuerpo catalítico complejo Regulación post-transcripcional en eucariotas: Acumulación proteica: Alzheimer β-amiloide,, Tau Parkinson Parkina, Tau Creutzfeldt Jakob, kuru Prion Huntington Huntingtina Enfermedad de Pick Tau Demencia frontotemporal Tau Síndrome de down Tau Demencia pugilística Tau 24

25 Genética Médica Introducción Regulación de la expresión génica Metilación Impronta genómica Lionización del cromosoma X Cambios epigenéticos cambios reversibles del DNA (químicos) que permiten que los genes se expresen o no dependiendo de condiciones exteriores. Herencia epigenética transmisión de información (no DNA) a través de la mitosis o meiosis, esta información modula la expresión de genes sin alterar su secuencia. Metilación Metilación en mamíferos: Adición de un grupo metilo a la posición 5 de la dc (d m C) en dinucleótidos CpG (normalmente en las llamadas islas CpG >200bp y %CG>50%) Islas CpG asociadas a promotores en 50% de genes funciones reguladoras 85% de los genes sellados tienen islas CpG Cambios en la estructura de la cromatina 25

26 Metilación Metilación de mantenimiento: adición de grupos metilo a la cadena de DNA recientemente sintetizada mantenimiento del patrón de metilación Enzima: Dnmt1 (DNA metilasa 1) Metilación de novo: adición de grupos metilo en posiciones nuevas en ambas cadenas. Enzimas: Dnm3a y Dnm3b Mutación en Dnm3b síndrome ICF (inmunodeficiencia, inestabilidad centromérica cromosómica y anormalidades faciales) Metilación Mecanismos de regulación: Bloqueo de unión de proteínas (F.T.) a los promotores en las islas CpG Proteínas de unión a metilcitosinas pueden interceptar la interacción con los factores de transcripción Atracción a histonas deacetilasas eliminación de grupos acetilo de las histonas compresión del nucleosoma 26

27 Metilación Funciones: Regula la expresión génica (inhibe) Supresión de genes tumorales Regulación de genes específicos de tejido Metilación anormal: Iniciación y progresión tumoral Inactivación de genes supresores tumorales Promoción de la inestabilidad cromosómica Aumento de mutaciones Metilación La metilación se modifica en numerosas enfermedades y está relacionada con la respuesta a medicamentos Proyecto genoma Proyecto epigenoma: identificar y catalogar las posiciones variables de metilación (VMP) cómo y cuándo se activan los genes? 27

28 Genética Médica Introducción Regulación de la expresión génica Metilación Impronta genómica Lionización del cromosoma X Impronta genética Hemicigosis funcional de ciertos genes producida por el origen parental de los alelos Hemicigosis funcional: uno de los alelos se encuentra silenciado o con expresión diferente. El sello (imprint) se coloca en los óvulos y espermatozoides durante la gametogénesis. Herencia epigenética: sin cambio de secuencia Impronta genómica o sellado genómico: mecanismo de regulación aleloespecífico de la expresión génica Imprinting: impronta, marcaje, marcado, troquelado, impresión, estampación, improntación, SELLADO (silenciamiento) 28

29 Historia: Descubrimiento en mamíferos en la década de 1980 en las experiencias de transplante de pronúcleos a embriones unicelulares Cigotos ginogénicos Cigotos androgénicos No viables Buen crecimiento Placenta pequeña Poco crecimiento Placenta grande Disomías uniparentales fenotipos anómalos y opuetos Inactivación de los cromosomas X parentales en células de membranas extraembrionarias Los genes se expresan de forma distinta según provengan del padre o de la madre Impronta genética Proceso reversible: - Se mantiene tras la fecundación (M) - Se elimina en la línea germinal (E) - Se restablece en la gametogénesis (R) Diferenciación según el origen: Sellos de = sexo E + R Sellos de = sexo E R M M Reacondicionamiento según nuevo sexo Momento del sellado: - Sellado materno: maduración del ovocito - Sellado paterno: en la línea germinal antes de meiosis R E 29

30 N. Herencia bialélica codominante S. Gen sellado (paterno) YY BB YY BB YY YB YB YB YB YY YY YB YB YB YB YY YB YY YB YY YB YY YB YY YB YY YB YY YB YY YB YY Árboles genealógicos hipotéticos que ilustran la herencia de dos alelos Impronta genética El 80% de genes sellados se encuentran agrupados en zonas cromosómicas 11p q11-q13 Regulación coordinada por los centros de sellado IC (imprinting centers) La regulación puede extenderse a miles de pb Error en la regulación expresión anómala del grupo 30

31 Impronta genética Expresión de genes sellados: - La expresión monoalélica puede depender del tejido o de la fase del desarrollo. - Un gen puede comportarse de forma monoalélica en un tejido y bialélica en otro. - El monoalelismo puede perderse en el desarrollo - Un sellado perpetuo estaría implicado en la regulación génica (p.e. tisular). Impronta genética Genes sellados: - Genes de proteínas implicadas en el desarrollo y crecimiento del embrión: factores de crecimiento, receptores de factores de trascripción, factores de corte y empalme, regulación del ciclo celular, canales de iones, RNA no traducible. - Genes de factores cognitivos. - Genes de desarrollo del lenguaje, integración social. - Genes de fenotipos conductuales: propensión al alcoholismo, esquizofrenia, trastornos afectivos bipolares. 31

32 Impronta genética Implicaciones en Medicina: Errores en la impresión de sellado Neoplasias y enf. mentales Activación de un alelo normalmente sellado o silenciamiento del único alelo expresado Ejemplos: -Síndrome de Prader-Willi (15q11-q13) -Síndrome de Angelman (15q11-q13) q13) -Síndrome de Beckwith-Wiedemann (11p15) Región 15q11-q13 Sellado materno UBE3A (sellado paterno) Genes que se expresan en cerebro SNRPN UBE3A SPW: 1/ nacidos Hipotonía, pobre reflejo de succión, hiperfagia obesidad, pequeña estatura y extremidades, retraso mental moderado. Causa genética: deleción paterna, disomía materna, mutaciones en el IC. SNRPN: Small nuclear riboprotein (splicing) UBE3A: Ubiquitin protein ligase SA: 1/ nacidos Hiperactividad, arranques de risa, Asociación con 20 trastornos torpeza, espasmos, habla mínima, conductuales: retraso mental severo -Autismo Causa genética: deleción materna, - Epilepsia disomía paterna, mutaciones en el gen - Esquizofrenia UBE3A, mutaciones del IC 32

33 Genética Médica Introducción Regulación de la expresión génica Metilación Impronta genómica Lionización del cromosoma X 33

34 Inactivación del cromosoma X (Lyonización, hipótesis de Lyon (Mary F. Lyon, 1961)) Hembras XX Machos XY Cromosoma X supernumerario: Los genes en cromosomas sexuales son poco numerosos no se actúa (mariposa) El cromosoma X del macho se sobre-expresa (drosófila) Los cromosomas X de la hembra se hipo-transcriben (C. elegans) Uno de los cromosomas X de la hembra se inactiva (mamíferos) Inactivación de 150 millones de pb y miles de genes Inactivación del cromosoma X Durante los primeros días de desarrollo embrionario un cromosoma X se inactiva (14 días) Inactivación al azar Clonal Expresión variable de los heterocigotos X*X Mosaicismo (XmXp) La inactivación es inducida por el gen XIC (XIST transcripto específico de la inactivación del X) Mecanismo de compensación génica 34

35 Inactivación del cromosoma X Inactivación del cromosoma X Corpúsculo de Barr Número de corpúsculos de Barr = número de cromosomas X

36 Inactivación del cromosoma X Displasia ectodérmica anhidrótica Mutación en el gen DEA Ausencia de glándulas sudoríaparas Normalmente afecta a hombres Mujeres heterocigóticas para el sindrome ligado al sexo con extensión y localización del tejido al azar MOSAICO QUIMERA 36

37 Inactivación del cromosoma X Ventaja genética para el sexo femenino: Protección del sexo femenino frente a la presencia de mutaciones perjudiciales en uno de los cromosomas X La mujer es funcionalmente hemicigótica pero con dos poblaciones celulares distintas El hombre es hemicigoto obligado y siempre expresará las mutaciones perjudiciales i Compensación de dosis génica Gen XIC=Xist + Tsix (Centro de inactivación cromosómica = transcrito específico de la inactivación del X) Xist en brazo largo proximal de Xq13. Xist se transcribe a una RNA que actúa sobre el propio cromosoma (en cis) Tsix es el antisentido de Xist Acumulación del RNA en la región periférica al gen Cambio en la conformación de la cromatina Extensión del cambio a todo el cromosoma 37

38 Gen XIC=Xist (transcrito específico de la inactivación del X) 8 exones, aprox. 80kb y un transcrito de 15kb. Exones Pasos en la inactivación del X 1. Reconocimiento de los cromosomas X y marcado del gen Xist 2. Extensión de la señal de inactivación (cis) 3. Fijación del efecto mediante metilación de CpG 38

39 Etapas de lionización Pre-lionización: fertilización 14d 2 y 4 blastómeras XX 4 blastómeras: expresión del Xist en Xp expresión preprogramada similar a la impronta genética Inactivación selectiva de Xp en cel. trofoblásticas (no lionización) Lionización: el día 14 a tiempos distintos distribución no regular en los distintos tejidos Post-lionización: i ió permanente salvo en la línea germinal Excepciones en la inactivación de X Genes de la región pseudoautosómica Genes cercanos a la región pseudoautosómica (KALIG1 y STS) Genes cercanos al Xist (RPS4X) Otros del brazo corto: ZFX y UBE1 ANT3 XE7 MIC2 ARDS ARSE GS1 STS KAL XG59 ZFX DFFRX TIMP1 UBE1 PCTK1, DXS423E XE169 RPS4X WI12682 IL9R ALD 39