IX. Transporte electrónico

Transcripción

1 IX. Transporte electrónico Los electrones generados a partir de la oxidación de los sustratos orgánicos en la rutas de glucólisis y ciclo de Krebs, son canalizados hacia un aceptor final a través de una cadena de transportadores electrónicos. Este proceso ocurre en una gran variedad de organismos tanto de bacterias, de arkeas o de eucariotes. En los eucariotes este proceso ocurre en las mitocondrias, una organela de la célula. Esta organela tiene un sistema de dos membranas, una externa y otra interna. La membrana mitocondrial interna, a diferencia de la externa, se encuentra extensamente invaginada y es impermeable al paso de moléculas pequeñas e iones, que solo pueden atravesarla utilizando transportadores específicos. Al espacio recubierto por la membrana mitocondrial interna se lo conoce como matriz mitocondrial y al espacio encerrado entre las dos membranas como espacio intermembrana. asi todos los transportadores electrónicos de la mitocondria se encuentran íntimamente unidos a la membrana interna. Las enzimas que se utilizan para la síntesis del ATP, también. En los microorganismos, arkeas o bacterias, la membrana plasmática es equivalente a la membrana mitocondrial interna, el citosol a la matriz mitocondrial mientras que el periplasma (el espacio externo a la célula ubicado entre la membrana plasmática y la pared o membrana exterior de la célula) es equivalente al espacio intermembranal. Por ello, en adelante los procesos que describamos en la membrana mitocondrial interna de los eucariotes tendrán su equivalencia con los que ocurren en la membrana plasmática de los procariotes. En los organismos aeróbicos la molécula que actúa como aceptor final de los electrones es el oxígeno molecular, pero algunos microorganismos pueden utilizar como aceptor final otros elementos como iones metálicos, sales nitrogenadas o azufradas, azufre elemental o, incluso, alguna molécula orgánica. La cadena de transportadores electrónicos puede contener un único complejo o varios. En los casos más complejos, se encuentran cuatro complejos macromoleculares que son utilizados para canalizar los electrones hacia el 2. Estos complejos son el que contiene la ADH oxidoreductasa o complejo I, el que contiene la succinato deshidrogenasa (u otras deshidrogenasas que contengan el grupo prostético FAD) o complejo II, el que contiene la Ubiquinona oxidoreductasa o complejo III, y el que contiene la citocromo oxidasa o complejo IV. Este esquema se encuentra en los eucariotes y en algunos microorganismos, mientras que algunas bacterias, contienen pequeñas variaciones del mismo. Por ejemplo, en E. coli los componentes de lo que denominamos complejos III y IV están en un único complejo de manera que el sitio donde se reduce el 2 a H 2 está dentro del mismo complejo donde se reoxida la dihidroquinona. 1

2 La transferencia de electrones a través de estos complejos está asociada con la traslocación de de un lado a otro de la membrana. Esta membrana corresponde a la membrana mitocondrial interna en los organismos eucarióticos o a la membrana plasmática de las bacterias o arkeas. La traslocación de genera, entonces, un gradiente electroquímico entre los dos lados de la membrana. Este gradiente es una fuente energética que puede ser utilizada por las células para realizar trabajo o para convertirla en otras formas de energía, como la que es almacenada en forma de enlace químico en el enlace fosfato de alta energía del ATP. Al proceso de conversión de la energía del gradiente de concentración de en ATP, se lo denomina fosforilación oxidativa y se produce a nivel de una enzima de membrana denominada ATP sintasa. El esquema básico que estamos describiendo fue explicado en los comienzos de la década del 60 por Peter Mitchell quien postuló la así denominada hipótesis quimiosmótica. Esta hipótesis, despreciada en el momento de su formulación, implicaba que como producto del transporte de electrones a través de los complejos transportadores en la membrana interna mitocondrial, se producía un intermediario de alta energía. Lo inusual del planteo de Mitchell, fue proponer que ese intermediario no era ninguna especie química de alta energía, como la mayoría de los científicos del momento esperaban encontrar, sino más bien estaba conformado por el gradiente de potencial electroquímico generado por la traslocación de iones (en este caso ). Para que su teoría tuviera algún respaldo experimental Mitchell propuso tres postulados que deberían cumplirse (y que podían ser falseados experimentalmente) si su hipótesis fuera correcta. Los postulados implicaban lo siguiente: 1. debería existir una conformación especial de los complejos transportadores de electrones en la membrana de manera que se realice en forma concomitante la traslocación de. Para ello, las reacciones donde se absorben deberían estar localizadas en el lado de la membrana que está en contacto con la matriz mitocondrial (o el interior de la célula de un microorganismo) y las reacciones donde se liberan deberían estar localizadas en el lado de la membrana que está en contacto con el espacio intermembranal (o el exterior de la célula de un microorganismo). Este concepto de reacciones "vectoriales" para las transformaciones realizadas en el interior de las membranas, en contraposición a las "escalares" que se darían en solución, fue una propuesta totalmente novedosa para la época. 2. Para que exista como tal el gradiente electroquímico de como una forma de acumulación de energía en la célula, debería existir un sistema de membranas intacto. Además este sistema de membranas debería ser impermeable a los iones (en este caso ) que forman el gradiente electroquímico. 2

3 3. Deberían existir enzimas embebidas en el mismo sistema de membranas cuya actividad se encuentre asociada a la utilización de la energía aportada por el gradiente electroquímico. Para ello estas enzimas deberían poseer un canal específico para lo iones que posibilite que estos sean transportados a favor del gradiente generado. Además, asociado a este transporte de iones, la enzima debería cambiar su conformación o la del sustrato de forma de favorecer la reacción que está catalizando. ada uno de estos postulados fue ensayado en sistemas libres de células. Primero se utilizaron mitocondrias aisladas para demostrar que, en presencia de un aceptor de electrones como el 2, estas preparaciones eran capaces de cambiar el ph de la suspensión únicamente si se agregaba al medio un dador de electrones, como el succinato. Alternativamente se demostró que la cadena de transporte electrónico estaba funcionando cuando se utilizó en lugar de un aceptor electrónico natural, como el 2, un aceptor electrónico artificial, como el colorante azul de metileno. Este colorante es capaz de recibir electrones aportados por el complejo III, y al reducirse se transforma desde su forma coloreada a una incolora, lo que permite seguir la cantidad de electrones transferidos. Por otra parte, si estas mitocondrias eran tratadas con un detergente débil, el cambio de ph no se observaba en ninguna condición. El detergente induce la formación de poros y roturas en la membrana mitocondrial, de manera que este experimento demuestra el requerimiento de la integridad del sistema de membranas. Además, se demostró la impermeabilidad de la membrana mitocondrial a los, incubando las mitocondrias aisladas a ph= 9 hasta que el ph interno y el externo se equilibren, y luego pasándolas a una solución de ph = 7. En esta nueva solución se midieron los cambios de ph y se determinó que las mitocondrias podían mantener el ph interno durante un tiempo suficientemente largo. Para ensayar el tercer postulado se utilizaron liposomas reconstituidos in vitro en presencia de uno o varios de los componentes proteicos de la membrana de transporte. En el experimento crucial, se armaron vesículas lipídicas que solo contenían los dos componentes de la ATP sintasa (F 0 y F1) y una proteína extraída del microorganismo Halobacterium halobium. Esta proteína es la bacteriorodopsina, que actúa como una bomba impulsora de en presencia de luz. Los investigadores pudieron demostrar que el ATP era sintetizado únicamente cuando estas vesículas eran iluminadas, o sea únicamente cuando se había generado un gradiente de a través de la membrana. Además este experimento permitió mostrar que la síntesis de ATP no requería en forma directa de la cadena de transporte electrónico, pero si de la presencia de un gradiente de, no importa como fuera este generado. 3

4 Sin embargo, en las mitocondrias intactas los procesos de transporte electrónico y de fosforilación oxidativa se encuentran íntimamente acoplados. De hecho si uno de los dos es detenido por la presencia de un inhibidor específico, el otro también se frena. X. Mecanismos de transporte electrónico y traslocación de. Lado P (++++) it c (red) 2 Q QH. 2Q 2Q bl bh (Fe-S) 2 it c 2 it c1 (ox) ½ 2 hemo a ua hemo a3 ub AD (Fe-S) n FM FMH. QH. 4 (Fe-S) 3 FADH. FAD Q 2 2 ½H 2 2H+ AD + FMH 2 Q Succinato FADH 2 Lado (----) Fumarato omplejo I omplejo II omplejo III omplejo IV En la figura se muestra la estructura de los cuatro complejos de transporte electrónico de la membrana mitocondrial interna.. Aclarar lado y lado P omplejo I Este complejo esta formado por un core 14 subunidades conservadas en procariotas y eucariotas, pero su estructura terciara aun no has sido dilucidada. Sin embargo este complejo adopta una forma de L invertida, en donde se distinguen dos módulo, uno hidrofóbico asociado a la membrana con capacidad de translocación de protones y otro hidrofílico que se extiende hacia el espacio matriz mitocondrial y que presenta actividad ADH oxireductasa. 4

5 En el complejo I los electrones del ADH son transferidos a una proteína integral del complejo, la ADH oxidoreductasa, que tiene un grupo de FM fuertemente unido. El FM recibe un par de electrones del ADH, su y toma un de la matriz mitocondrial para convertirse en FMH 2. Los nucleótidos de flavina (FM o FAD) así como la coenzima Q que veremos más adelante, son capaces de intervenir en transferencias electrónicas de a dos electrones al mismo tiempo o de sólo un electrón por vez. En este último caso se genera un intermediario (que incluso puede tener una carga negativa como en el caso de la oq) que contiene un electrón desapareado. Estos intermediarios del FAD, FM o de la oq, son semiquinonas que, a diferencia de las formas totalmente oxidadas o totalmente reducidas de las coenzimas, son normalmente incapaces de moverse libremente a través de la membrana. Generalmente, estas semiquinonas tienen sitios de anclaje a una proteína, perteneciente a alguno de los complejos donde actúan, siempre en un sitio adyacente a una de las soluciones acuosas en contacto con la membrana, ya sea la matriz o el espacio intermembrana. El FMH 2, cede un electrón a una proteína de Fe-S, la cual convierte un Fe +3 en Fe +2, reduciéndose en el proceso. En forma concomitante un proveniente del FMH 2 es liberado a la matriz mitocondrial y se genera el intermediario radicalario FMH.. Para que el proceso continúe, la proteína de Fe-S transfiere su electrón hacia adelante, convirtiendo su Fe +2 en Fe +3, oxidándose, y preparándose para recibir el otro electrón que queda en el intermediario FMH.. A B 5 H 5 H 1 H 2 H H H H H H H 2 H - P P H 2 H H H H H H FM (en negro) o FAD (en negro y azul) los átomos reactivos están en rojo H 2 H 1 R Flavoquinona (FM o FAD) H H 5 H 1 H R Flavohidroquinona (FMH 2 o FADH 2 ) H 5 H 1 R Flavosemiquinona (FM. o FAD. ) A continuación, la proteína Fe-S cede sus electrones a una cadena de centros Fe-S localizada en el brazo hidrofílico del complejo I. Finamente, los 5

6 electrones son trasportados a una coenzima Q oxidada la que se transforma en el intermediario de semiquinona, Q., proceso que ocurre en este brazo hidrofílico. El siguiente electrón es entonces transferido desde el FMH. hacia la primer proteína de Fe-S, que vuelve a convertir su Fe +3 en Fe +2, de esta a la siguiente proteína de Fe-S y así sucesivamente hacia la semiquinona de la coenzima Q. Esta última se transforma en coenzima Q totalmente reducida, capta 2 de la matriz y se libera hacia la membrana donde es soluble pasando a formar parte de todo el conjunto de coenzimas Q reducidas (también denominadas dihidroquinonas) que existe en la membrana mitocondrial interna. Hasta aquí se han tomado de la matriz 1 para la reducción del FM y 2 para la reducción de la quinona, pero se han liberado 2 a la matriz producto de la oxidación del FMH2. De forma neta estos procesos consumen 1 de la matriz por cada dos electrones transferidos del ADH a la quinona. Por otra parte, además de los protones involucrados en la reducción de la quinona, cuatro protones se toman de la matriz mitocondrial y se liberan en el espacio intermembrana. El mecanismo de esta translocación de protones no esta totalmente establecido, pero probablemente intervenga un antiportador H+/a+ ubicado en el módulo de membrana. El mismo parece estar acoplado a cambios conformacionales en la estructura del complejo I debido a la reacción de oxidación de ADH. La ecuación neta que describe los procesos que acontecen en el complejo I se muestra a continuación: AD Q + 5 => AD P omplejo II Se denomina complejo II a una familia de complejos diferentes que son capaces de extraer una par de átomos de H de una variedad de sustratos diferentes. Todos estos complejos se diferencian en la enzima que comienza el sistema de captura de los átomos de H, y son idénticos en el resto de los componentes que transfieren estos átomos a la coenzima Q. En estos complejos no hay mecanismos asociados de translocación de. El más conocido de estos complejos es el que contiene como primer enzima a la succinato deshidrogenasa. En este complejo los electrones del succinato son transferidos a la enzima succinato deshidrogenasa, una proteína integral del complejo, que tiene un grupo FAD fuertemente unido. El FAD recibe un par de 6

7 electrones del succinato, juntamente con su par de para convertirse en FADH 2. El FADH 2, cede sus electrones, de a uno a la vez, a una proteína de Fe-S, la cual convierte un Fe +3 en Fe +2, reduciéndose en el proceso. En forma concomitante, los 2 provenientes del FADH 2 son liberados a la matriz mitocondria. Los electrones son transportados, de a uno a la vez, a través de tres centros Fe-S en el interior del complejo. El aceptor final de estos electrones, es la coenzima Q oxidada que se transforma en tomando dos de la matriz mitocondrial. Este complejo no genera una translocación neta de protones. La ecuación global de este complejo se muestra aquí: Succinato+ Q => Fumarato + omplejo III Los electrones transportados por la son cedidos de uno a la vez hacia el citocromo para producir dos moléculas de citocromo reducidas. De esta manera las quinonas son las coenzimas solubles que hacen de nexo entre dos complejos. Uno de ellos, el dador de electrones, puede ser el complejo I o el II y el otro, el aceptor de electrones, es, en este caso, el complejo III. En el esquema mostrado más abajo se indica cómo es la ruta de transferencia electrónica y de translocación de en el complejo III. omo se ve, el complejo puede dividirse en dos partes, una conformada por las proteínas de Fe-S y los citocromos de tipo, que se encuentra anclada a la membrana adyacente al exterior de la célula o al espacio intermembranal, y la otra, conformada por los citocromos de tipo b, que es un complejo proteico integral a la membrana que tiene dos sitios de unión a la oenzima Q, cada uno situado en un sitio de la membrana adyacente a una solución acuosa y ubicados en puntos opuestos de la misma. Ubiquinona (oenzima Q) H H 2 H 2 H 6-10 H H H 2 H 2 H Plastoquinona 2 H R R 2 H R ambios en los estados de oxidación de la Ubiquinona 7

8 El sistema implica una ruta de reoxidación de la dihidroquinona en forma cíclica que se denomina ciclo Q y que es análogo a uno que se encuentra en la cadena de transporte de la membrana tilacoidal de los organismos fotosintéticos. 1ª Etapa Q Q.- 2 Espacio intermembrana o exterior celular Fe-S c 1 c c red b 566 Membrana mitocondrial interna o membrana plasmática b 560 Q Q.- Matriz mitocondrial o citosol 2ª Etapa Q Q.- 2 Espacio intermembrana o exterior celular Fe-S c 1 c c red b 566 Membrana mitocondrial interna o membrana plasmática b 560 Q.- 2 Matriz mitocondrial o citosol Q Reacción global 2 Q 2 Q 2x Espacio intermembrana o exterior celular 2x 1 Fe-S c 2x 1 1 2x 1 c 2x c red b 566 2x 1 + Membrana mitocondrial interna o membrana plasmática Q b 560 Q.- 2 Matriz mitocondrial o citosol Gracias a este ciclo, como puede observarse en la reacción global, un par más de son transportados de un lado al otro de la membrana comparado con lo que se obtendría de una transferencia lineal de los electrones. En síntesis, una cede sus dos electrones (de a uno por vez) a la proteína de 8

9 B Fe-S y esta al citocromo 1, que termina reduciendo al citocromo. ómo dos electrones son transportados en este sistema, dos moléculas de citocromo terminan reducidas (de Fe +3 a Fe +2 ), pueden liberarse de la membrana y transportar los electrones hacia el siguiente complejo. El citocromo es una molécula soluble en solución acuosa que se une débilmente a la membrana plasmática y de esta manera está ubicado estratégicamente para transferir electrones entre los complejos III y IV. Este complejo toma 2 de la matriz mitocondrial y libera 4 al espacio intermembrana por cada par de electrones transportados hacia el aceptor final. Para este complejo, la ecuación global se indica a continuación: 2 it ox + QH2 + 2 => 2 it red + Q + 4 P omplejo IV En el complejo IV los electrones transportados por el citocromo son transferidos al aceptor final. En los eucariotes, este complejo tiene dos citocromos de tipo a y tres átomos de u firmemente unidos a las proteínas del complejo. Los citocromos, tal como todos los componentes de esta familia de proteínas, pueden convertirse entre los estados Fe +3 y Fe +2 mientras que los átomos de u pasan por los estados de oxidación u +2 y u +1 en las reacciones de reducción u oxidación. Los electrones cedidos por el itocromo reducido son inicialmente captados por un centro binuclear de átomos de cobre llamado u A, luego son transferidos a un grupo hemo llamado Hemo a. De allí los electrones se transfieren a un centro binuclear compuesto por un átomo de obre (u B ) y otro grupo hemo (Hemo a3). En el caso de que el aceptor final sea el 2, como sucede en eucariotas y algunas bacterias, este es reducido en etapas que involucran la transferencia de cuatro electrones. Para reducir un átomo de 2 y formar dos moléculas de H 2 se requiere la transferencia de cuatro electrones a través de este complejo, además cuatro protones son tomados desde la matriz mitocondrial. Todo esto acontece en el centro binuclear Hemo a3 - u. B Además, acoplado a este proceso otros cuatro protones son translocados desde la matriz al espacio intermembrana, mediante un mecanismo no conocido. En eucariotas este complejo consume 2 de la matriz y transloca otros 2 al espacio intermembrana por cada par de electrones transportados hacia el aceptor final, la ecuación neta se muestra aquí abajo. 9

10 2 cyt ox + 1/ => 2 cyt red + H P En bacterias existe un complejo de transferencia de electrones a un aceptor final (a veces diferente del 2 ) que guarda semejanza con el complejo IV de eucariotes. Algunos de estos complejos poseen, incluso la misma estequiometría de transporte de que el complejo IV de eucariotes, pero en algunos casos es el doble. tros sin embargo, no tienen el mecanismo asociado de translocación de y, únicamente aportan a la formación del gradiente mediante la captura de un par de durante la formación de la molécula de H 2 o del aceptor final reducido hidrogenado. tros, en los que el aceptor final no se hidrogena, solamente poseen un mecanismo de translocación. En particular en E. coli existen dos ubiquinol oxidasas (en lugar de itocromo oxidasa). Ambas reducen al 2 pero difieren en la afinidad por el mismo y en la estequiometría de translocación de protones. En un caso es de 1H+/e- y en el otro es el doble. Ecuación global Finalmente de acuerdo a lo expresado anteriormente la ecuación global para el transporte de dos electrones a través de la cadena de transporte en una mitocondria eucariota es la siguiente: AD 1/ => AD + + H P XI. Fosforilación oxidativa El mecanismo de la fosforilación mediada por un gradiente de iones ocurre en una proteína integral de la membrana mitocondrial interna o de la membrana citosólica de los microorganismos. Esta proteína es la ATP sintasa. 10

11 Las ATP sintasas conocidas, constan de al menos dos componentes. Uno de ellos es el que forma el canal de transporte de a través de la membrana y se denomina F debido a que el transporte mencionado puede ser bloqueado por el inhibidor oligomicina. El otro componente, está débilmente unido a la Matriz Mitocondrial Membrana Interna Espacio Intermembranal itosol ADP + Pi ATP ATP sintasa F1 Fo ATP ADP Transportadores ADP ATP Metabolismo elular Pi membrana por interacciones con el F y cuando es aislado y separado de la otra subunidad se comporta como una activa ATPasa. En este componente, denominado F 1, se realiza la síntesis de ATP en la membrana. F está constituido por una serie de proteínas con estructura de hélices α que cruzan la membrana ida y vuelta formando un canal. F 1, en cambio está formado por varias subunidades proteicas que le dan una conformación globular. Las proteínas que forman a F 1 toman una simetría ternaria de manera que en todo momento hay tres sitios catalíticos. Estos sitios pueden pasar por tres conformaciones posibles cada uno con respecto a su afinidad hacia los nucleótidos. Estas conformaciones reciben el nombre de abierta, que libera el ATP; débil, que se une débilmente al ADP y al Pi; y fuerte, donde el ADP y el Pi se convierten a ATP. Vista en un momento determinado, F 1 tiene un oligómero en cada uno de los estados mencionados. uando 3 iones atraviesan el poro de F, cada uno de los confórmeros de F 1 cambia su estructura de manera que la conformación abierta se convierte en débil, débil en fuerte y fuerte en abierta. Termodinámicamente el último cambio mencionado (fuerte en abierta) es el que requiere de más energía, por lo que la Pi 11

12 reacción que posee un ΔG muy positivo en esta enzima no es la síntesis de ATP 1 sino la liberación del mismo. Si intentamos calcular el rendimiento de ATP sintetizado por cada una de las moléculas de sustrato que fueron oxidadas en un organismo determinado, hay que tomar en cuenta las características peculiares de su metabolismo. En general, en la literatura vamos a encontrar diferentes estequiometrías con respecto al rendimiento energético del metabolismo aeróbico de la glucosa. Esto se debe a que distintos autores realizan diferentes consideraciones y aproximaciones 2 para acercarse a la resolución del tema. Para responder correctamente a esta cuestión hay que tener en cuenta que el número de moléculas de ATP que se producirán durante la degradación oxidativa completa de un sustrato, hasta 2 + H 2, dependerá de una serie de consideraciones, entre ellas: i. El rendimiento en moléculas de ATP (u otras que contengan enlaces de alta energía) en reacciones de fosforilación a nivel de sustrato. ii. iii. iv. La cantidad y calidad de coenzimas reducidas generadas en la oxidación completa del sustrato. El número de los transportadores electrónicos con capacidad de translocar del organismo. La equivalencia de número de translocados por cada par de electrones que atraviesan a cada uno de los complejos de transporte electrónico del organismo considerado. v. El número de requeridos en la ATP sintasa para sintetizar una molécula de ATP vi. El consumo de energía adicional, en reacciones de transporte intracelular, necesario para llevar al ATP hasta su sitio de utilización mayoritaria en la célula. De esta manera, es posible diferenciar el rendimiento de ATP/glucosa oxidada en los diferentes tipos celulares, bacterias y arkeas por un lado, y eucariotas por el otro. En las consideraciones de los puntos i., ii., y v., hay un acuerdo general en la bibliografía y, además, los resultados son equivalentes en los tres tipos de células. La oxidación completa de una molécula de glucosa rinde 2 moléculas de ATP mediante la glucólisis junto con 2 moléculas de Acetil-oA y una molécula de ATP (o GTP) en el ciclo de Krebs por cada Acetil-oA degradado hasta 2. En total la recuperación de energía en reacciones de fosforilación a nivel de sustrato es equivalente a la síntesis de 4 moléculas de ATP por cada molécula de glucosa oxidada completamente. 1 por medidas realizadas en los últimos años se estima que la reacción entre el ADP y el Pi para dar ATP se encuentra prácticamente en el equilibrio en el seno de esta enzima. 2 generalmente no enunciadas en forma explícita 12

13 El rendimiento en coenzimas reducidas producidas por cada molécula de glucosa que fue oxidada, es de 2 moléculas de ADH en la glucólisis hasta piruvato, 2 moléculas de ADH en la conversión de 2 moléculas de piruvato en 2 de Acetil-oA y, finalmente, 6 moléculas de ADH y 2 de coenzima por cada par de moléculas de Acetil-oA degradadas hasta 4 2. Además, existe la convicción que se requiere del pasaje de 3 a través del canal de la ATP sintasa, para la síntesis de una molécula de ATP. Hasta aquí todos de acuerdo, con la pequeña salvedad que algunos consideran al FADH 2 en lugar de la coenzima como producto del ciclo de Krebs, lo que a los efectos prácticos del cálculo estequiométrico es indistinto. La reacción catalizada por la enzima succinato deshidrogenasa provoca la eliminación de un par de H de un par adyacente de átomos de carbono internos de la molécula de succinato para generar un doble enlace entre esos carbonos en la molécula de fumarato. Es verdad que el primer aceptor de los electrones puestos en juego en esta reacción es el FADH 2. Sin embargo, la molécula de FADH 2 se encuentra firmemente unida al centro activo de la enzima succinato deshidrogenasa y en la práctica es parte de ella. Por lo mismo el FADH 2 en esta reacción no puede ser considerado la coenzima producto de la misma porque para que la enzima vuelva a ser útil y cumplir otro ciclo catalítico el FADH 2 debe ser reoxidado a FAD cediendo los electrones a la coenzima Q para producir la coenzima Q reducida ( ). El FADH 2 es en realidad un grupo prostético en esta reacción. Esta reacción ocurre en el seno de la membrana (plasmática en el caso de los microorganismos o mitocondrial interna en el caso de los eucariotes) y el producto, oenzima Q, es capaz de moverse dentro de la misma para transportar los electrones de un sitio catalítico hasta otro, la misma función que el ADH realiza en solución. En definitiva, considerar al FADH 2 el producto de la succinato deshidrogenasa, es lo mismo que considerar al FMH 2 como producto de la piruvato deshidrogenasa. De aquí en adelante hay distintas interpretaciones acerca del rendimiento global. En principio la mayoría de los libros de texto consideran solamente la situación de las mitocondrias eucariotas. En realidad, el número de transportadores electrónicos con capacidad de translocar es variable y depende de la conformación de la cadena de transporte particular de un organismo determinado. En las mitocondrias eucariotas se encuentran cuatro complejos de transporte, tres de los cuales pueden translocar protones. En otros organismos 3 el número puede variar entre 1 y 4. Algunos libros de texto, no consideran exactamente el número total de que se translocan por cada par de electrones transportados a través de cada uno de los complejos. En la bibliografía más moderna se reconoce que por cada molécula de ADH que transfiere sus electrones al 2 por medio de la cadena de transporte de electrones se translocan, de un lado al otro de la membrana, un total de 10 para generar el gradiente electroquímico, y que 3 u organelas como el hidrogenosoma de algunos protistas. 13

14 por cada molécula de (o FADH 2 ) que hace lo mismo se translocan un total de 6. De esta manera el cálculo estequiométrico daría 3,3 (y no 3) moléculas de ATP por cada ADH que cede sus electrones al 2 y 2 moléculas de ATP por cada que hace lo mismo. Este cálculo es real solamente para las bacterias y las arkeas que contienen una cadena de transporte formada por 4 complejos equivalentes a los mitocondriales. En estos organismos entonces una molécula de glucosa rinde 4 ATP por fosforilación a nivel de sustrato, 10 ADH y 2 a través de su oxidación completa hasta 2 y H 2, lo que resulta equivalente a un total de 41 moléculas de ATP sintetizadas por cada molécula de glucosa oxidada. En los eucariotes hay que hacer otras consideraciones. Principalmente, la síntesis del ATP se realiza en la matriz mitocondrial mientras que su utilización mayoritaria es en el citosol celular. Además ni el ATP ni el ADH son capaces de atravesar la membrana mitocondrial interna sin gasto energético. Por ello, las moléculas de ADH generadas por glucólisis (en el citosol) deben ser incorporadas en la mitocondria. Esto no ocurre nunca en la realidad. Sin embargo si es posible transportar los electrones del ADH desde el exterior hasta el interior de la mitocondria. En algunos organismos, esto se realiza por mecanismos denominados de lanzaderas en los que están involucrados reacciones redox en ambos lados de la membrana mitocondrial interna, junto con una enzima ubicada en el interior de dicha membrana. Hay dos tipos de lanzaderas conocidas. En uno de ellos el producto es ADH en el interior de la mitocondria mientras que en el otro el producto es coenzima, en la membrana mitocondrial. En este último caso habría que realizar una corrección estequiométrica cuando se considera el rendimiento en ATP a partir de los electrones del ADH citosólico. Sin embargo, la corrección más importante y que pocos realizan, corresponde al gasto asociado al transporte del ATP de la mitocondria al citosol y a la incorporación concomitante del ADP y el fosfato desde el citosol a la matriz mitocondrial. omo está ilustrado en la figura más arriba, debido al funcionamiento de la cadena de transporte electrónico a través de la membrana interna, los son acumulados en el espacio intermembranal de la mitocondria. omo mencionamos antes, se requiere del pasaje de 3 de estos protones de nuevo hacia la matriz mitocondrial a través del poro de la subunidad Fo de la ATP sintasa anclada en la membrana interna, para que se sintetice una molécula de ATP. Esta reacción ocurre en el sitio específico dentro de la subunidad F1 de la ATP sintasa que utiliza al ADP y al Pi como sustratos. La síntesis de ATP consume los sustratos de la ATP sintasa, el ADP y el Pi. omo la síntesis de ATP y el transporte electrónico están acoplados, para que el transporte continúe, el ATP debe ser consumido, para regenerar el ADP y el Pi. El ATP es consumido mayoritariamente en el citosol por el metabolismo 14

15 celular, generando como productos ADP y Pi. Por lo mismo, para que el transporte electrónico (y el metabolismo celular asociado) continúe funcionando, el ATP debe ser exportado de la mitocondria y el ADP y el Pi deben ser importados desde el citosol. Esto ocurre a través de proteínas transportadoras específicas de la membrana mitocondrial interna. Una de estas proteínas es un intercambiador de ATP por ADP. El ATP sale de la mitocondria y el ADP entra en ella, ambos a favor de un gradiente de concentración por lo que el transporte en este caso parece pasivo. Sin embargo, el transporte consume energía del gradiente electroquímico ya que la carga neta del ATP es aproximadamente una unidad más negativa que la del ADP. Por lo mismo, este transporte implica la entrada de una carga negativa hacia el sitio donde más concentradas están estas cargas. Por otro lado, el Pi es incorporado a la mitocondria cotransoportado con un ion. Este segundo transportador utiliza la parte química del gradiente electroquímico de, para incorporar a la mitocondria un Pi necesario para la síntesis del ATP. De esta manera por cada molécula de ATP que es sintetizada en una célula eucariota y transportada hacia el citosol se consumen un total de 4 iones (3 en la síntesis y 1 en el transporte). omo habíamos dicho antes, por cada molécula de ADH que transfiere sus electrones al 2 por medio de la cadena de transporte de electrones se translocan, de un lado al otro de la membrana, un total de 10 para generar el gradiente electroquímico, y que por cada molécula de (o FADH 2 ) que hace lo mismo se translocan, de un lado al otro de la membrana, un total de 6. ómo en este caso, se requieren del pasaje de 4 para la síntesis de una molécula de ATP, el cálculo estequiométrico daría 2,5 (y no 3) moléculas de ATP por cada ADH que cede sus electrones al 2 y 1,5 moléculas de ATP por cada que cede sus electrones al 2. En los eucariotes, entonces una molécula de glucosa rinde 4 ATP por fosforilación a nivel de sustrato, 10 ADH (2 en el citosol y 8 en la mitocondria) y 2 a través de su oxidación completa hasta 2 y H 2. En definitiva, este cálculo es equivalente a un total de 32 moléculas de ATP por cada molécula de glucosa si se utiliza la lanzadera que rinde ADH en el interior mitocondrial y 30 moléculas de ATP por cada molécula de glucosa si se utiliza la lanzadera que rinde en el interior mitocondrial. 15