Análisis de Proteínas

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1 Análisis de Proteínas Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección advansta

2 Análisis de Proteínas Análisis de Proteínas: Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitación. Un manual de laboratorio de la empresa Advansta Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al 1, permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés. Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras. Esta guía de laboratorio describe los pasos involucrados en la realización de un Western blot, incluyendo la preparación de muestras, la separación de proteínas, la transferencia y la detección. Índice de Contenidos Página 1. Western Blot: Visión General 2 2. Preparación de las muestras 4 3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida 5 4. Transferencia Electroforética Hibridación Anticuerpos Detección Solución de Problemas Herramientas y Referencias Técnicas Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9): Página 1

3 Western Blot: Visión General 1. Western Blot: Visión General Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso. a. Preparación de la muestra Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química. Los materiales de partida incluyen planta, tejidos animales, células cultivadas, levadura, o bacterias. La disrupción mecánica con un homogenizador disgrega los tejidos. Procesos adicionales logran el fraccionamiento subcelular Se usan tampones conteniendo detergentes para la lisis celular Figura 1. Preparación de muestras b. Electroforesis en gel de Acrilamida Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis. Se prepara un gel de acrilamida, bisacrilamida. El dodecilsulfato de sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere, de forma proporcional a la masa de cada proteína, una carga negativa a cada una de ellas. Se añade un colorante de carga. Así, la migración de la muestra se puede monitorizar. Se utiliza una pipeta para cargar las muestras en los pocillos del gel Una fuente de alimentación proporciona el voltaje El gel se coloca dentro de un tanque de electroforesis lleno de tampón, que conducirá la corriente. La proteínas con carga negativa migran desde el ánodo. Figura 2. Electroforesis en Acrilamida c. Transferencia electroforética a una membrana Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana, dónde quedan inmovilizadas. El gel y la membrana se coloca entre papel de filtro y almohadillas de esponja.. Se aplica voltaje en el tanque de transferencia y las proteínas migran desde el gel a la membrana. Un cartucho aplica presión y mantiene un estrecho contacto entre el gel y la membrana. Figura 3. Transferencia de Proteínas a la Membrana Página 2

4 Análisis de Proteínas a. Hibridación del Anticuerpo La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos. A continuación se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana. Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma específica al anticuerpo primario, proporcionando una forma de detección. Los materiales de partida incluyen tejidos vegetales, tejidos animales, células en cultivo, levadura, o bacterias. Figura 4. Hibridación de Anticuerpo e. Detección de las Bandas Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido, se procede a detectar la localización de la banda en la membrana. Para la detección de quimioluminiscencia, se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima peroxidasa (HRP); la adición de un sustrato de HRP provoca una reacción enzimática que da como resultado final la emisión de luz. Dicha luz puede ser detectada en una película de rayos X, o de forma digital, mediante un sistema de captación de imágenes. La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz emitid por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario. Figura 5. Detección quimioluminiscente de las bandas de proteínas Página 3

5 Preparación de la muestra 2. Preparación de la muestra Una adecuada preparación de la muestra es esencial para tener éxito en un ensayo de Western Blot. En la mayoría de ensayos, las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o mecánicos. El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida, de la localización subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epítopo proteico. En la tabla 1 se resumen los métodos mecánicos que habitualmente se utilizan en la extracción de proteínas para inmunotransferencia. A menudo, en muestras tisulares de plantas y animales, se requiere el uso de un proceso mecánico para la disrupción de la compleja matriz celular. Disrupción mecánica que suele preceder a un proceso químico de lisis celular, mediante el uso de solución tampón que contiene detergentes, que va dirigida a enriquecer la proteína de interés dentro del extracto final. Las células en cultivo, frecuentemente, se suelen lisar utilizando una solución tampón con detergente y sin la aplicación de métodos mecánicos. La estructura química de los detergentes permite romper las membranas celulares y solubilizar las proteínas. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar según las características del grupo polar: iónicos si el grupo polar tiene carga positiva o negativa, no iónicos si no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga negativa y positiva y la carga neta es 0. La elección de la substancia detergente, depende en parte de la localización, dentro de la célula, de la proteína de interés, citoplasmática, unida a la membrana, dentro de orgánulos celulares como el núcleo y las mitocondrias, etc...las proteínas citoplasmáticas se pueden unir a las proteínas del citoesqueleto, afectando así a los procesos de fraccionamiento subcelular. En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampón y detergentes, más utilizados habitualmente, según el tipo de proteína y localización subcelular. Tabla 1. Métodos físicos para la dirupción de muestras Método Descripción Tipo de muestra Licuadora Homogenizador Dounce Homogenizador de ultrasonidos Pulverización en Nitrógeno líquido Perlas de vidrio La muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias Tubo de vidrio con pistón ajustado maja las células por acción de corte. Ondas de sonido emitidas por una sonda para romper las membranas celulares La muestra se pulveriza utilizando un mortero y una almirez refrigerados La ruptura celular se produce por agitación de las perlas de vidrio Gran cantidad de tejido Células tisulares; útil para protocolos de enriquecimiento de proteínas mitocondriales o nucleares Células, tejidos, bacterias. Tejido animal o o vegetal Levaduras Tabla 2. Soluciones Tampón y detergentes, según el tipo de proteína de interés y la localización subcelular Tipo/Localización Proteína de interés Nativa (no desnaturalizada) Citoplasmáticos (soluble) Citoplasmático (unida a citoesqueleto) Membrana mitocondrial o nuclear Lisado total de células Detergente o Solución Tampón Detergente suave no iónico Tris-HCl Tris-Triton NP-40, RIPA (multiples detergentes), Triton X-100 NP-40, RIPA, Triton X-100 TComentarios Evitar detergentes desnaturalizantes (SDS, Deoxicolatos) Puede combinarse con métodos mecánicos, tales como el homogenizador Dounce Los detergentes Triton son suaves y no iónicos Para antígenos con niveles bajos de expresión pueden ser necesarios procesos de enriquecimiento Página 4

6 Análisis de Proteínas Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de interés. Por tanto, es importante evitar, durate la preparación de la muestra, cualquier actividad proteásica. La siguiente estrategia ayuda a evitar la degradación de proteínas: Evitar excesivos ciclos de congelación/ descongelación. Trabajar rápido y mantener las muestras en frío durante todo el proceso. Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis. Además de inhibir la actividad de la proteasa, puede ser interesante reducir la actividad de la fosfatasa alcalina, en particular en estudios de fosforilación. En la tabla 3 se muestran los inhibidores deproteasa y fosfatasa de uso más habitual. Tabla 3. Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la extracción de proteínas. Inhibidores Proteasas Concentración en el Tampón de lisis Enzimas diana Aprotinina 1-2 µg/ml Proteasas de Serina EDTA 1-10 mm Mg ++ /Mn ++ Metaloproteasas EGTA 1-10 mm Ca ++ Metaloproteasas Leupeptin 1-2 µg/ml Proteasas de Serinas, Cisteinas Pepstatina A 1µg/ml Proteasas de Aspartico PMSF Inhibidores Fosfatasas ( µg/ml) O,1 1 mm Concentración en el Tampón de lisis Proteasas de Serina Enzimas diana - Glicerofosfato 1 mm Fosfatasas Serina/ Treonina EDTA 1-10 mm Mg ++ /Mn ++ Metaloproteasas EGTA 1-10 mm Ca ++ Metaloproteasas 3. Electroforesis en Acrilamida Las proteínas del extracto se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). En primer lugar, las proteínas, se revisten con carga negativa, mediante la acción del detergente Dodecilsulfato Sódico (SDS), así Las proteínas, se pueden separar en el gel según su tamaño (SDS- PAGE). Leupeptin 1-2 µg/ml Proteasas de Serinas, Cisteinas Pepstatina A 1µg/ml Proteasas de Aspartico PMSF ( µg/ml) O,1 1 mm Proteasas de Serina Medición de proteína total Previamente a la electroforesis, es importante determinar la concentración de proteínas por las siguientes razones: 1. Asegurar la carga de la cantidad correcta de proteínas en el gel. La cantidad de proteína óptima a cargar dependerá de la prevalencia de la proteína de interés y de la sensibilidad del anticuerpo primario. Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un mayor ruido de fondo y unión no específica de los anticuerpos. A menudo, para determinar la carga de proteína apropiada, se requiere hacer experimentos preliminares con cantidades seriadas de proteínas. Nota: con el kit Afyon SDS-PAGE de preparación de muestra, se puede controlar la cantidad de carga de la proteína mediante la cantidad de resina utilizada, evitando la necesidad de determinar la concentración de proteína. Por ejemplo, para 5 µg de proteína se utilizan 20 µl de resina Afyon. Información para pedidos K Afyon SDS-PAGE ssmple preparation kit Página 5

7 Absorvancia Electroforesis en Acrilamida 2. Realización de Western Blots cuantitativos o semi-cuantitativos. Si la cantidad de proteína cargada por carril es la misma, se pueden comparar los niveles relativos de la proteína de interés. Un experimento de Western Blot cuantitativo es útil para estudio de cambios de expresión de proteínas o de modificaciones proteicas como la fosforilación. Descripción del método Existen diversos métodos para medir la proteína total de una muestra. Los más habituales son los métodos Lowry, Bradford y Ácido Bincocinico (BCA) (Tabla 4). Estos ensayos colorimétricos se basan en las reacciones que se producen entre las proteínas de la muestra y los reactivos de detección. Con el fin de determinar la concentración de proteínas totales en una muestra, se debe realizar una curva estándar en cada ensayo. Esto se logra con la realización de un ensayo de concentración crecientes, de proteína pura. El estándar utilizado con mayor frecuencia es la albúmina de suero bovino (BSA), aunque se puede utilizar cualquier proteína producida en el laboratorio o disponible comercialmente. En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva estándar. Los valores de absorvancia se trazan en función del contenido conocido de la proteína estándar utilizada. El contenido de la proteína de interés en la muestra (línea verde) se puede determinar mediante la extrapolación de la absorvancia obtenida a la cantidad o concentración de proteína correspondiente. Tabla 4. Métodos físicos para la dirupción de muestras Ensayo Descripción Ventajas Inconvenientes Bradford BCA Lowry El colorante azul de Coomasie se une a las proteínas y sufre un cambio de absorvancia Reducción de iones de Cu 2+ mediante interación con las proteínas, el BCA se une a los iones de Cu 1+ y forman un producto coloreado que se puede medir espectrofometricamente (reacción de Biuret) Similar al BCA (reacción de Biuret) La realización de los ensayos son generalmente rápidos y sencillos Compatible con la mayo - ría de detergentes Comercialmente disponible en formato compatible con agentes reductores. Menos variación proteína-proteína que en el método Bradford. Muy bien citada en literatura Interferencia de SDS o de otros detergentes a altas concentraciones. Rango lineal pequeño. Interferencia con agentes quelantes o reductores del Cobre El tiempo de ensayo puede ser mayor que en otros métodos No es práctico para grupos grandes de muestras Se pueden formar precipitados Elección de un ensayo de proteínas Hay muchos kits de determinación de proteínas disponibles comercialmente. La elección depende de muchos factores: El equipo de lectura disponible en el laboratorio (espectrofotómetro, lector de placas, etc ). Los reactivos del tampón de lisis - revisar el protocolo del fabricante para identificar sustancias interferentes. La cantidad de muestra disponible. La facilidad/rapidez del ensayo. Proteína (mg) Figura 6. Ejemplo de la curva estándar de un ensayo de proteínas. Se representa la absorvancia de las soluciones estándar que contienen la proteína conocida (línea roja). La concentración de la proteína de interés se puede determinar extrapolando la absorvancia obtenida en la curva patrón o estándar (línea verde de puntos). Página 6

8 Análisis de Proteínas Tampón de carga de muestras Una vez se tienen las muestras de proteína, se pueden conservar congeladas, teniendo cuidado en evitar ciclos repetitivos de congelación/ descongelación. Alternativamente, se pueden utilizar inmediatamente, combinándolas con un tampón de carga y cargar la muestra en un gel de electroforesis. Los componentes del tampón de carga varían, dependiendo de las condiciones deseadas. Los ingredientes típicos de un tampón de carga para detectar proteínas bajo condiciones desnaturalizantes/reductoras se describen en la Tabla 5. No se utilizarán ni SDS, beta mercaptoetanol o ditiotreitol, si se necesitan condiciones no desnaturalizantes /no reductoras. Previamente a la carga del gel, las muestras se someten a una incubación a 95ºC durante 5-10 minutos, para asegurar que la desnaturalización/ reducción es total. En condiciones no desnaturalizantes/no reductoras, esta incubación no es necesaria. En la Figura 7 se ilustra cual es el mecanismo de desnaturalización del SDS. La proteína se encuentra en su estado conformacional, manteniendo su carga intrínseca SDS Figura 7. Mecanismo de desnaturalización por SDS de las proteínas. Tabla 5. Componentes del tampón de carga. El SDS se une a la proteína y da lugar a una linearización y a una uniformidad de la carga negativa de ésta. Reactivo Propósito Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y garantizan que las muestras se separan de forma reproducible, carril a carril y gel a gel. Advansta dispone de tampones de carga reductores y no reductores. Información para pedidos R B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x) R B10 Reducing protein sample loading buffer (2x) Glicero. Azul de Bromofenol SDS Beta Mercaptoetanol o DTT Tampón Tris Pepstatina A Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar la muestra la fondo del pocillo y evitar que se extienda a los pocillos adyacentes. Molécula colorante pequeña: Da color a la muestra para ayudar a la carga. Migra por delante de las proteínas, de modo que se puede hacer el seguimiento del movimiento de las muestras en el gel. Detergente desnaturalizante Cola hidrofóbica que rodea la esqueleto peptídico. Unión a la proteína de forma regular, aportando carga negativa de forma proporcional al tamaño de la proteína. Evita las interacciones hidrofóbicas y rompe los enlaces de hidrógeno. Destruye la estructura secundaria/ terciaria y lineariza la proteína. Agentes reductores Evita la oxidación de cisteínas. Completan la linearización de la proteína al romper los puentes disulfuro. Mantiene el ph adecuado Página 7

9 Electroforesis en Acrilamida Gel de Electroforesis Si se requieren condiciones naturales para que el anticuerpo pueda detectar el epítopo, en la electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en el tampón de electroforesis. En esta situación, también conocida como PAGE nativo, las proteínas mantienen su estructura tridimensional y la migración en el gel depende de su masa: relación de carga de la proteína por encima de su tamaño. Sin embargo, la mayoría de ensayos Western Blot, se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reducción, las proteínas cargadas negativamente, cuando se someten a un campo eléctrico, migran al electrodo positivo. Debido a que el SDS iguala la carga en todas las proteínas, la tasa de migración viene determinada por su peso molecular. Las moléculas más pequeñas migran más rápidamente que aquellas con pesos moleculares mayores. Tabla 6. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis de proteínas Reactivos Acrilamida Bisacrilamida SDS Tampón Tris Persulfato de Amonio TEMED Propósito Moléculas que polimerizan para formar cadenas. Forman uniones con las cadenas de acrilamida para formar un entramado. Mantiene la linearidad y la uniformidad de carga de las proteínas según la electroforesis. Mantiene el ph adecuado. Generación de radicales libres que catalizan la reacción de polimerización. Aumenta la generación de radicales libres por el persulfato de amonio. Los geles de SDS-PAGE están disponibles comercialmente o se pueden elaborar en el propio laboratorio. Los geles pre-fabricados son muy prácticos pero debido al coste, no son tan rentables como los elaborados por el usuario. En la tabla 6, se describen los componentes químicos de un gel de SDS-PAGE. Elección del grosor del gel y del tamaño de poro El tipo de muestra y el peso molecular de la proteína de interés dictan el espesor y tamaño de poro del gel. Los espaciadores de gel (ver Figura 8) controlan el espesor del gel. Están disponibles en diversos tamaños. Los geles con mayor espesor, pueden aceptar mayor volumen de carga. También se procesarán más lentamente y requieren tiempos de transferencia mas largos que los geles más delgados Tabla 7. Rango de separación de proteínas según el porcentaje de acrilamida. Porcentaje 7, Rango Peso Molecular (kda) El porcentaje del gel, según la cantidad de acrilamida y bisacrilamida, determina el tamaño del poro. A más porcentaje menos tamaño de poro. El tamaño de poro determina la ratio de separación de las proteínas. (tabla 7) Página 8

10 Análisis de Proteínas Elaboración del gel Si el gel de acrilamida esta elaborado en el laboratorio, los distintos reactivos se mezclan y se vierte en el molde, formado por el conjunto de dos cristales, espaciadores lateral, espaciador inferior, peines y un sistema de sujeción (Figura 8), dónde la acrilamida se polimeriza en aproximadamente 30 minutos. Para mejorar la nitidez de la banda el gel resolutivo se corona con una acrilamida de menor porcentaje (stacking gel). 1. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre los cristales. 2. Tras fijación de los lados, verter el gel resolutivo y esperar que el gel se polimerice. 3. Colocar el peine en la parte superior del gel. Diseño Experimental; Controles y Estándares Antes de la carga del gel, es importante diseñar el experimento incorporando los controles y estándares necesarios para la validación de los resultados. Los tipos de estándares y controles utilizados incluyen: 1. Marcadores de Peso Molecular. Son una mezcla de proteínas purificadas de peso molecular conocido. Se utilizan para verificar si la proteína de interés está dentro del rango de tamaño apropiado. Disponible en diversos intervalos de pesos moleculares, así como teñidos o incoloros. Las versiones preteñidas se utilizan para controlar el progreso de la electroforesis y comprobar la eficacia de la posterior transferencia. Pueden estar marcadas por la detección por fluorescencia o quimioluminiscencia. 2. Controles Positivos. Para verificar si el anticuerpo primario se une a la proteína correcta. Generalmente, si está disponible, son una muestra de la proteína de interés purificada. Puede ser una línea celular que sobreexprese la proteína de interés. Puede ser una muestra de tejido del que se conozca que expresa altos niveles de la proteína de interés. Se pueden utilizar otras especies como tejido de control si el anticuerpo tiene reactividad cruzada apropiada. 4. Verter el stacking gel y quitar el peine una vez el gel haya polimerizado. Lavar los pocillos con ddh20. El gel está listo para cargar las muestras y la electroforesis. Figura 8. Preparación del gel de electroforesis para la separación de proteínas. Controles de carga Como norma general se utilizan proteínas con niveles de expresión constante para todas las muestras. Similar a los housekeeping genes en Biología Molecular. Algunos tratamientos pueden alterar la expresión de estas proteínas housekeeping. Se utiliza para verificar que la carga de proteína por carril es más o menos igual, así los niveles de proteínas se pueden comparar de forma cuantitativa. La expresión cuantitativa de la proteína de interés puede normalizarse con la del control de carga para cada muestra. Péptidos de bloqueo Algunos proveedores ofrecen péptidos de bloqueo para sus anticuerpos. El péptido de bloqueo se mezcla con el anticuerpo primario antes de la incubación con la membrana y evita la uníón del anticuerpo a la proteína diana. Por tanto no se detectará ninguna banda. Estos estudios demuestran que el anticuerpo utilizado se une de forma específica a la proteína de interés. Página 9

11 Electroforesis en Acrilamida Inicio de Electroforesis Las muestras se cargan en los pocillos del gel mediante una pipeta. Normalmente se cargan de 20 a 40 µg de proteína total por carril. Es importante conocer de antemano, el volumen que se puede cargar por pocillo, para así evitar sobrecargas que pueden dar lugar a la pérdida de muestra o derrames en pocillos adyacentes. Una vez finalizada la carga, el gel se somete a un campo eléctrico generado por una fuente de alimentación. El tampón utilizado durante la electroforesis, contiene Tris (mantiene el ph), Glicina (conductor electricidad) y SDS (mantiene las proteínas cargadas negativamente). El progreso en el gel se monitoriza observando el frente coloreado por el colorante presente en el tampón de carga y la posición de los marcadores de tamaño siempre que estos estén teñidos. Gly Proteinas CL - Gly Proteinas Muestra (ph 6,8) Stacking Gel ph 6,8 Resolving Gel ph 8,8 La técnica de electroforesis más habitualmente utilizada es la de Laemmli. En este método, los valores de ph de la capa de gel de apilamiento o concentración (Stacking Gel) y el gel de resolución (Resolving Gel) son diferentes. La figura 9 ilustra el flujo de iones durante la electroforesis. Tampón de Electroforesis (ph 8,3) La glicina tiene carga negativa en el tampón de electroforesis a ph 8,3. Con la aplicación de un campo eléctrico, la glicina, en el Stacking Gel, se aleja del electrodo negativo. La glicina empieza a perder su carga a ph 6,8 y ralentiza su movimiento. Los iones de cloruro avanzan por delante de la Gly. El aumento de la resistencia, obliga a las proteínas a alejarse, de forma apilada, del electrodo negativo. La glicina, debido a un mayor ph del Resolving Gel, aumenta su carga negativa y se mueve por delante de las proteínas. Las proteínas se separan según su peso molecular por el Figura 9. Concentración de bandas de proteínas por el flujo iónico en el sistema discontinuo de Laemmli. Página 10

12 Análisis de Proteínas 4. Transferencia a una Membrana Una vez la electroforesis del gel ha terminado, las proteínas se transfieren a una membrana. La membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las proteínas, permitiendo así que la hibridación de un anticuerpo las pueda detectar. La mayoría de los sistemas de transferencia utilizan la generación de un campo eléctrico para conducir a las proteínas desde el electrodo negativo al positivo. Los sistemas de transferencia están disponibles en formato semiseco o húmedo. Los sistemas semisecos son más rápidos y requeiren menor cantidad de volumen de Tampón que los sistemas húmedos, sin embargo no son apropiados para transferencia de proteínas de gran tamaño (>70 kda) y pueden causar, según el sistema de detección, un mayor ruido de fondo. Ambos métodos requieren, para una transferencia efectiva de las proteínas, un estrecho contacto entre el gel y la membrana. Aunque ambas funcionan bien en experimentos de inmunotransferencia, las diferencias en sus características puden influir a la hora de la elección. La membrana de PVDF, ofrece una mayor resistencai mecánica, resistencia la SDS y una mayor unión que la nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa tiene la ventajas de proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol. Recientemente se han desarrollado, con el objetivo de reducir el ruido de fondo al utilizar métodos de detección de fluorescencia, membranas PVDF de baja autofluorescencia. Previamente a la transferencia, tanto el gel como la membrana se equilibran en una solución tampón pre-enfriada. Típicamente, el tampón de transferencia contiene Tris, Glicina, SDS (opcional) y metanos (para membranas de nitrocelulosa). La figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la membrana en un transferencia semiseca o húmeda. Figura 8. Transferencia de proteínas a una membrana. Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre -cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamaño de minigel. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiempo y elimina la contaminación accidental de las membranas con guantes o tijeras contamindas. Información para pedidos L L L Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm Membrana Nitrocelulosa 0,45 µm 8x10 cm Membrana Nitrocelulosa 0,22 µm 8x10 cm Página 11

13 Electroforesis en Acrilamida A continuación se describen algunas sugerencias para la consecución exitosa de una transferencia: Evitar la manipulación de las membranas con las manos desnudas. Las proteínas y aceites de la piel pueden adherirse a la membrana y pueden dar lugar a manchas no deseadas en la membrana. Las burbujas de aire entre el gel y la membrana pueden causar transferencia defectuosa y desigual. Se pueden eliminar haciendo rodar suavemente una pipeta Pasteur por encima del sándwich formado por el gel/ membrana/papel de filtro. No permitir un sobrecalentamiento durante la transferencia. Es aconsejable utilizar tampón frio, un sistema de refrigeración o hacer la transferencia en una cámara fría. Disminuir el voltaje o el tiempo si fuera necesario. Ajustar las condiciones de transferencia al tamaño de la proteína. Las proteínas más pequeñas se transferirán más rápidamente y pueden atravesar la membrana. Reducir o eliminar el SDS o utilizar una membrana con un tamaño de poro menor puede ayudar a una mayor retención de la proteína. Incrementar la cantidad de SDS y disminuir la concentración de Metanol pueden facilitar la transferencia de proteínas de gran tamaño. Bloqueo El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incubando con una solución diseñada para reducir los lugares de unión no específicos al anticuerpo. A menudo, son soluciones a base de proteínas, como la leche descremada en polvo o la albúmina de suero bovino (BSA). La primera elección, cuando se inicia un nuevo protocolo, es la utilización de la leche descremada en polvo, ya que es más rentable que el BSA, sin embargo y debido a la presencia de biotina en las fosfoproteínas, puede que no sea la mejor elección cuando se van a utilizar anticuerpos fosfoespecíficos o en métodos de detección de biotina. Es preferible, para estas y otras situaciones, el uso de agentes bloqueantes no proteicos. El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampón Tris salino) o en PBS (Tampón Fosfato salino); se puede añadir también detergente Tween 20. Una incubación durante una hora (temperatura ambiente o a 4ºC) suele ser suficiente para un bloqueo de los lugares de unión no específicos del anticuerpo. Si los niveles del ruido de fondo son demasiados altos, se pueden seleccionar otras soluciones de bloqueo alternativas. La aparición de marcadores de tamaño preteñidos en la membrana es indicación que se ha completado la transferencia. El colorante Ponceau S puede utilizarse para teñir la membrana y asegurarse de la eficacia de la transferencia. La membrana debe ser desteñida antes del proceso de transferencia. La tinción con Coomassie puede usarse para la tinción del gel una vez realziada la transferencia y comprobar los residuos de proteína en el gel. Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo y de lavado para su línea de reactivos de detección, WesternBright, así como soluciones tampón en polvo de PCS, TBS,...que facilitan una rápida y fácil preparación Información para pedidos R D50 R D20 R R AdvanWash TM, 500 ml AdvanBlock TM -PF, 200 ml AvantTM Buffer Pouches - PBS AvantTM Buffer Pouches - TBS Página 12

14 Análisis de Proteínas 5. Hibridación del Anticuerpo. Después del proceso de bloqueo, la membrana se incuba con el anticuerpo primario. En general, los anticuerpos reconocen una secuencia de aminoácidos pequeña (epítopo) que queda expuesta al eliminar la estructura tridimensional de la proteína en condiciones desnaturalizantes y reductoras. Los geles nativos se pueden utilizar cuando los anticuerpos requieren de la proteína plegada para el reconocimiento del antígeno. Anticuerpos Primarios: Monoclonal vs Policlonal. En la transferencia Western se pueden utilizar, tanto anticuerpos primarios monoclonales como policlonales. Los dos tipos tienen distintas ventajas y desventajas y se diferencian según la forma en la que se sintetizan. El primer paso en la producción de ambos anticuerpos, es la inyección de un antígeno en un animal, para provocar una respuesta inmune. Los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir del suero del animal, comúnmente conejo, cabra, burro u oveja y son finalmente purificados y probados. Los anticuerpos policlonales reconocen múltiples epítopos del antígeno y en cambio los monoclonales reconocen un único epítopo de la proteína. Para la síntesis de un anticuerpo monoclonal, las células que sintetizan anticuerpos se aíslan del bazo del animal y se fusionan con células del mieloma. Lo hibridomas resultantes secretan anticuerpos al medio de cultivo, el cual se analiza y determina la afinidad al antígeno. Los hibridomas con secreción más estable se seleccionan y pueden ser cultivados indefinidamente. Algunas características de los anticuerpos monoclonales y policlonales se describen en la Tabla 8. Tabla 8. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales. Reconocimiento epitopo y sensibilidad Reactividad cruzada potencial Tiempo requerido para su producción Coste de Preparación Variabilidad Tolerancia a condiciones variables Anticuerpos Monoclonales Reconocimiento de un único epítopo Menos sensibilidad debido a que sólo un anticuerpo se une a cada proteína Reactividad cruzada menos probable. Potencial para reconocer otras proteínas que contengan el epítopo. Largo Mayor coste - requiere personal capacitado y equipamiento especializado. Los lotes de un mismo hibridoma son muy estables. Poca tolerancia - puede dejar de reconocer al antígeno en condiciones de desnaturalización/reducción de la proteína, o por modificaciones químicas (glicosilación fosforilación) o por diferencias en la secuencia peptídica debido a la presencia de polimorfismos. Anticuerpos Policlonales Reconocimiento múltiples epítopos en una proteína Más sensible debido a los multiples lugares de unión de anticuerpo en cada proteína. Bueno para proteínas poco abundantes. Reactividad cruzada más probable. Mayor ruido de fondo potencial debido al reconocimiento de multiples epítopos. Reactividad cruzada con otras especies más probable. Más corto Menor coste Propenso a cierta variabilidad entre lotes. Más tolerante a condiciones variables. Página 13

15 Hibridación Anticuerpos Incubación de los anticuerpos El anticuerpo primario se diluye en tampón de bloqueo, TBST o en un tampón de disolución de anticuerpo comercial. El fabricante puede recomendar una cantidad inicial, pero a menudo la concentración óptima de anticuerpo debe determinarse empíricamente. La afinidad del anticuerpo, la abundancia de la proteína en la muestra y la sensibilidad del sistema de detección afectarán a la cantidad de anticuerpo a utilizar. Generalmente, un periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente suele ser suficiente. También es posible una incubación a 4ºC durante toda la noche. Durante la incubación, la membrana debe someterse a agitación suave y sumergida en la disolución, e incubar en un agitador de vaivén. Un menor volumen puede utilizarse si la membrana se sella dentro de una bolsa e incuba en un agitador orbital. En algunos casos, la disolución con el anticuerpo, puede reutilizarse. Si se utiliza acida sódica como conservante, debe ser totalmente lavada de la membrana, ya que puede eliminar la actividad de la peroxidasa e interferir en los métodos de detección. Nota: Advansta ofrece una línea completa de anticuerpos secundarios marcados para detección mediante quimioluminscencia o fluorecencia. Información para pedidos R IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 50 µl R IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 250 µl Después de la incubación con el anticuerpo primario, se procede a la eliminación del excedente mediante tampones de lavado (TBS, PBS, TBST o PBST). En métodos de detección indirectos (sección 6), es necesario un anticuerpo secundario apropiado. A continuación se describen las consideraciones a tener en cuenta a la hora de la elección de un anticuerpo secundario: R IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón, 50 µl R IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón, 250 µl R R Anticuerpo Secundario conjugado HRP cabra-anti-ratón, 500 µl Anticuerpo Secundario conjugado APC cabra-anti-conejo, 500 µl Las especie del primer Ac dicta la elección del Ac secundario. Si el primer Ac es de conejo, el segundo Ac debe ser anti-conejo, o sea, deber ser producido en otra especie distinta a conejo. Para anticuerpos monoclonales se debe considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) y posiblemente la subclase (IgG1, IgG2a, ). Un anticuerpo con amplia especificidad inmunoglobulínica debería ser suficiente, ya que los anticuerpos específicos para sub-clases se utilian mayoritariamente, en experimentos de doble etiquetado u otras aplicaciones. Página 14

16 Análisis de Proteínas 6. Detección. La detección de la proteína se puede hacer mediante métodos directos o indirectos, cada uno con sus ventajas e inconvenientes. Los métodos directos utilizan un anticuerpo primario conjugado con un marcaje detectable, como un enzima, biotina o molécula fluorescente. Los anticuerpos se pueden marcar mediante kits disponibles en le mercado u obtenerlos ya marcados. Lo métodos indirectos utilizan dos anticuerpos; un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario contra la especie del primer anticuerpo. En la detección indirecta, es el anticuerpo secundario el que está conjugado con un marcaje detectable. La figura 11,ilustra los métodos de detección directos e indirectos y en la Tabla 9 se resumen las ventajas e inconvenientes de los dos métodos. Métodos de detección. Figura 11. Detección directa e indirecta de proteínas Tabla 9. Ventajas e Inconvenientes de los métodos de detección Indirecto Directo Los métodos más comúnmente utilizados para detectar proteínas son: 1. Quimioluminiscencia, 2. Fluorescencia y 3. Colorimetría. 1. Quimioluminiscencia. Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan comúnmente anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP). La reacción entre el encima y el substrato produce luz, que puede ser detectada mediante la exposición de la membrana a una película de rayos X o captada de forma digital utilizando una cámara CCD. Ventajas: muy sensible, la membrana puede tratarse para re-utilizarse, se pueden hacer multiples exposiciones en películas de rayos X, fácil de documentar. Inconvenientes: requiere una habitación oscura (película rayos X) o sistemas de imagen caros, semicuantitativa - porque se basa en una reacción enzimática, la película tiene un rango dinámico limitado, la intensidad de la señal puede variar con la incubación o el tiempo de exposición, no son posibles detecciones multiplex (detección de mas de una proteína, sólo un color de reacción) Ventajas Inconvenientes Amplificación de señal debido a la unión de múltiples Ac secundarios a cada Ac primario. Versátil - el mismo Ac secundario puede utilizarse para diversos anticuerpos de la misma especie. Mayor posibilidad de unión no inespecífica. Más pasos. Menos pasos. Menos posibilidades de unión no específica. Puede ser más costoso. La inmunorreactividad del Anticuerpo puede estar afectada por el marcaje. Nota: LucentBlue TM es una película que ha sido optimizada para la detección de señales de quimioluminiscencia en experimentos realizados con los substratos WesternBright HRP, incluyedo Western- Bright TM ECL, Westernbright Quantum y WesternBright Sirius. Información para pedidos L Película Rayos X LucentBlue TM, 20x25 cm, 100 uds L Película Rayos X LucentBlue TM, 13x18 cm, 100 uds Página 15

17 Detección 2. Fluorescencia. El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo, que cuando es excitado emite luz. La luz emitida, se detecta mediante un dispositivo capaz de medir la fluorescencia o mediante una cámara CCD provista con los filtros de longitud de onda apropiada. La imagen se digitaliza para su análisis. Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede incrementarse utilizando el sistema streptavidina/ biotina), apto para ensayos multiplex con múltiples colorantes, amplio rango dinámico, no se requiere el uso de una cámara oscura, aporta datas cuantificables, fácil documentación de resultados, pueden usarse Ac primarios marcados (para proteínas abundantes) y eliminar pasos. Re-utilización de la membrana Después de captar la imagen, la membrana puede ser tratada para volver a ser utilizada para la detección de otra proteína. Este procedimiento puede conservar las muestras, pero consume mucho tiempo. Con la detección multiplex de fluorescencia, se pueden detectar múltiples proteínas de forma simultanea, es ideal para comparar la proteína de interés con un control de carga, o diferentes isoformas de la proteína. Las membranas PVDF son preferibles a la de nitrocelulosa en protocolos de lavados para reutilización. Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento pueden ser costosos, no es tan sensible como la quimioluminiscencia (puede no ser apropiado para proteínas poco abundantes). 3. Colorimetría. Los métodos colorimétricos utilizan un Ac secundario que ha sido conjugado previamente a un enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). El enzima convierte el colorante en un producto insoluble que es visible en la membrana. La cantidad de colorante convertido es proporcional al cantidad en la muestra. La intensidad de la tinción puede ser medida por espectrofotometría o por un densitómetro. Ventajas: sencilla de realizar, no requiere cámara oscura, las membranas se pueden documentar fácilmente mediante fotografía. Inconvenientes: no es tan sensible como los otros dos métodos, el color se desvanece con el tiempo. Nota: WesternBright TM MCF permite la detección, mediante la detección fluorescente multicolor, de dos proteínas en una sola membrana. Perfecto para aquellos experimentos en los que se necesite comparar la proteína de interés con un control de carga. Información para pedidos K WesternBright TM fluorescent Western blotting kit Nota: Advansta suministra una línea completa de reactivos de detección de quimioluminiscencia optimizados para los diferenentes métodos, concentración de muestra y tipos experimentales. Información para pedidos K D10 K D10 K D20 K D10 WesternBright TM Quantum Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm 2 de membrana) WesternBright TM Sirius Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm 2 de membrana) WesternBright TM ECL Western Blotting HRP Substrate (para 2000 cm 2 de membrana) WesternBright TM ECL Spray Página 16

18 Análisis de Proteínas 7. Solución de Problemas Solución de problemas con Western Blot A. No se puede ver la proteína de interés B. Tamaño incorrecto de la banda C. Bandas artefactuales D. Problemas en la electroforesis E. Ruido de fondo excesivo Preparación Muestra (ver 1) La proteína es menor de lo esperado (ver 7) Bandas Incompletas (ver 12) El gel polimeriza demasiado rápido o demasiado lento (ver 17,18,19) Bloqueo Insuficiente (ver 24) Transferencia Inadecuada (ver 2) Unión ineficiente del Anticuerpo (ver 3, 4) Problemas con los reactivos (ver 5, 6) La proteína es mayor a lo esperado (ver 8, 9) Bandas Múltiples (ver 10) Las bandas aparecen muy altas o muy bajas en el gel (ver 11) Bandas Difusas (ver 13) Rayas Verticales (ver 14) Distorsión Lateral (ver 15) Bandas distorsionadas (ver 16) El gel corre demasiado rápido o demasiado lento (ver 20,21) Frente corre curvado smiling (ver 22) Frente corre inclinado (ver 23) Lavado inapropiado (ver 25) Contaminación Reactivos (ver 26) Elección de Membrana (ver 27) Unión no específica del Anticuerpo (ver 28) Revelado de la película (ver 29) Página 17

19 Solución de Problemas A. Problema Causa(s) Solución 1. Preparación Muestra Extracción ineficiente Intentar métodos alternativos; incluir control positivo en el gel 2. Transferencia indadecuada Baja expresión de la proteína en el tejido o las células La proteína se ha degradado durante la extracción Tampón de transferencia preparado incorrectamente/demasiado metanol en el tampón Cargar más cantidad de proteína total en el gel; concentrar utilizando Afyon, juntar múltiples muestras Usar inhibidores de proteasa en le tampón de lisis Revisar el protocolo/disminuir metanol 3. Unión ineficiente del Anticuerpo primario 4. Unión ineficiente del Anticuerpo secundario Proteínas de mayor tamaño necesitan mas tiempo/voltaje Contacto insuficiente entre el gel y la membrana Baja afinidad del anticuerpo por la proteína o el anticuerpo es antiguo/débil El Anticuerpo tiene reactividad cruzada débil con las especies de interés El Anrticuerpo se ha eliminado con el lavado Antígeno enmascarado por el agente bloqueante (ej.: Leche, ) Elección de especies errónea Repetir con un tiempo mayor/mayor voltaje Revisar la almohadilla de fibra; sustituir si es muy delgada Incrementar la concentración del Anticuerpo; comprar un anticuerpo nuevo y almacenarlo de forma apropiada Probar con un Anticuerpo primario de diferente origen Usar menor numero de lavados; disminuir la concentración de sales el tampón de lavado Utilizar un agente de bloqueo alternativo (ej.: BSA, ) Usar Anticuerpos dirigidos contra la especie del Anticuerpo primario 5. Conjugado/Substrato Inactivo 6. Reactivo de detección (ECL) Concentración insuficiente del Anticuerpo o Anticuerpo antiguo Reactivos viejos o inestables Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sódica La disolución es antigua o está almacenada de forma inapropiada B. Problema Causa (s) Solución 7. Proteína más pequeña de lo esperado 8. Proteína más larga de lo esperado y/o bandas múltiples Proteólisis; Congelación/descongelación de la muestra Proteína variante (Splicing) Proteínas modificadas de forma natural (glicosilación, fosforilación, acetilación, etc ) Aumentar concentración o comprar uno Anticuerpo nuevo Mezclar conjugado + substrato en un tubo; o luminiscencia en oscuridad - conseguir un nuevo reactivo si no hay señal Evitar utilizar disoluciones conteniendo este agente conservante Comprar reactivo nuevo Uso de inhibidores de proteasa/muestras frescas Consultar literatura/utilizar controles apropiados Consultar literatura para encontrar aditivos que puedan eliminar grupos químicos 9. Proteína más larga de lo esperado Cambio de la expresión de la proteína en la línea celular Agregado de proteínas - puentes disulfuro intactos Utilizar cultivos anteriores; incluir un control positivo Uso de DTT en tampón de muestra; pulso de centrífuga previo a la carga de la muestra Página 18

20 Análisis de Proteínas B. Problema (continuación) Causa(s) Solución 10. Bandas Extras Unión no específica del Anticuerpo primario o secundario 11. La proteína aparece muy alta o muy baja en la membrana Porcentaje erróneo/no óptimo del gel C. Problema Causa(s) Solución Disminuir concentraciones; intentar un experimento de bloqueo de péptido (eliminará la proteína de interés) Incrementar el porcentaje para proteínas de pequeño tamaño; disminuir para proteínas de gran tamaño 12. Bandas Incompletas Burbujas entre el gel y la membrana Usando una pipeta, hacer rodar por encima del paquete gel/membrana para forzar la salida de las burbujas 13. Bandas difusas Migración lenta Incrementar voltaje; asegurarse de la correcta preparación del tampón Las muestras no se han calentado correctamente El SDS del tampón es antiguo Asegurarse que las muestras se han incubado durante 2 min a 90ºC antes de cargarlas en el gel Preparar SDS nuevo para le tampón de muestra 14. Rayas en los carriles Alta concentración de sales en la muestra Disminuir la concentración de sal en el tampón de muestra 15. Distorsión lateral de las bandas Muestra muy concentrada o insuficiente SDS Difusión de la muestra en los pocillos durante la carga 16. Distorsión de las bandas Fallo en la completa polimerización de los pocillos Presión aplicada excesiva a la hora de montar el gel Burbujas en el gel debido al uso de cristales sucios Incrementar concentración/usar más SDS Minimizar el tiempo de carga Incrementar TEMED/AP No apretar en exceso los tornillos del sistema, apretar hasta encontrar primera resistencia Usar guantes en la preparación de los geles Uso de Etanol y H2O desionizada en la limpieza de los cristales Burbujas introducidas en el gel por el dispositivo de llenado (jeringa o pipeta) Burbujas de aire atrapadas por el peine D. Problema Causa (s) Solución No expulsar totalmente el volumen de la mezcla del gel Insertar el peine en ángulo y antes que se polimerice el gel 17. El gel no polimeriza Fallo al añadir el TEMED y AP Repetir con TEMED y AP La disolución AP es estable durante dos o tres días a 4ºC Preparar AP fresco 18. El gel polimeriza muy lento El oxígeno inhibe la polimerización TEMED/AP Insuficiente La disolución de AP ha perdido su actividad Aplicar isopropanol antes de verter el gel de apilamiento (stacking gel) Incrementar la cantidad de TEMED/AP Preparar disolución fresca de AP Página 19