SECUENCIACIÓN DEL GEN p20 DEL VIRUS TRISTEZA DE CÍTRICOS DE UN AISLAMIENTO MEXICANO

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Patricia Espejo Rico
hace 7 años
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2 SECUENCIACIÓN DEL GEN p20 DEL VIRUS TRISTEZA DE CÍTRICOS DE UN AISLAMIENTO MEXICANO 1 Murga Sánchez, Claudia G., 2 Iracheta Cárdenas, Magdalena, 2 Rocha Peña, Mario A. 2 López Alvarado, Claudia B. y 1 Gómez Treviño, Alberto 1 Laboratorio de Biología Molecular, CELAES, Facultad de Ciencias Químicas, UANL 2 Instituto de Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, UANL Introducción: La Tristeza es una de las enfermedades virales económicamente más agraviantes alrededor del mundo en árboles cítricos y su agente causal es el virus tristeza de los cítricos (Citrus tristeza virus = CTV). Este virus de RNA aparentemente es originario del sureste asiático y ha ocasionado la muerte de más de 40 millones de árboles en el planeta. En México existen más de 500 mil hectáreas de cítricos vulnerables a la infección. El virus tiene un tropismo de floema en las plantas cítricas y su presencia en una plantación se debe generalmente al uso y el movimiento de materiales de propagación infectado (plantas de viveros). La dispersión del virus de árboles infectados a sanos en el campo es llevada a cabo mediante transmisión por varias especies de áfidos en una forma semi-persistente, siendo el pulgón café de los cítricos, Toxoptera citricida (Kirkaldy) el vector más eficiente en la transmisión de las partículas virales. Este áfido se encuentra presente en países del Continente Americano, incluyendo México, lo que hace comprensible el rigor de las políticas de control para su propagación. Aunado a esto, la alta tasa de mutación de los virus de RNA, deriva en variaciones de severidad de las infecciones perfilando a estas mismas como severas o leves, rasgos asociados directamente a las diferencias entre los distintos aislamientos de CTV. Objetivo: Obtener la secuencia nucleotídica del gen p20 del virus tristeza de cítricos de un aislamiento mexicano.

3 Materiales y Métodos: Se extrajo RNA total de tejido vegetal de naranjo diagnosticado positivo para CTV por serología. Se obtuvo el cdna de la proteína p20 por retro-transcripción con primers específicos. El inserto clonado en un plásmido pgem correspondiente al aislamiento MX14 del gen p20 de CTV se sometió a secuenciación nucleotídica. Para ello se aplicó secuenciación basada en el método de Sanger de los fragmentos amplificados y purificados de PCR en un secuenciador automático de AppliedBiosystems Modelo: En el proceso de secuenciación los iniciadores se emplearon a una concentración de 3.2 pmoles. La secuencia nucleotídica resultante se comparó en línea con la secuencia de referencia T36 de CTV en la base de datos del Centro Nacional para la Investigación en Biotecnología del Instituto Nacional de Salud (EE.UU.), con el propósito de establecer el porcentaje de homología entre ambas secuencias. Resultados y Discusión: Se compararon 305 nucleótidos de la secuencia obtenida para los cuales se obtuvo equivalencia con 272 nucleótidos entre la secuencia MX14 y la secuencia de referencia T36. Esto arroja como resultado un 89 % de identidad entre ambas secuencias. El tejido empleado en el presente estudio, previamente fue determinado como positivo para infección del CTV mediante un ELISA-DASI empleando para ello anticuerpos anti-p25, en el reconocimiento de la partícula viral. Al estar presente el virus en la planta, se acumulan proteínas no estructurales a manera de cuerpos de inclusión, donde se ha consignado a la p20 como el principal componente de las inclusiones virales del CTV. De manera que al evaluar el tejido infectado positivo al CTV, los anticuerpos obtenidos para la p20

4 recombinante en otra fase de este proyecto, fueron efectivos para reconocer la p20 codificada por el genoma viral in planta. Si bien las diferencias encontradas no pueden considerarse definitivas para determinar diferencias entre ambos aislamientos, por tratarse de la secuencia nucleotídica de un solo gen, contribuye de manera importante al conocimiento a nivel molecular de los asilamientos de CTV de árboles de la región. Puesto que las tasas de mutación en virus de RNA son altas, el establecimiento de diferencias entre los distintos aislamientos ejerce un alto impacto en la clasificación y designación de cepas severas o leves de CTV Conclusión: La secuencia nuecleotídica del gen p20 de CTV del aislamiento mexicano MX14 presenta un 89% de homología con respecto del aislamiento tipo T36. Bibliografía: 1. Iracheta-Cárdenas, M.M., Almeyda-León, I.H., Manjunath, K.L. Cevik, B., Nibblett, C., Lee, R., and Rocha-Peña, M.A Molecular cloning and expression of the p25 gene of two Mexican isolates of Citrus tristeza virus. Rev. Mex. Fitopatol. 20: Iracheta-Cárdenas, M.M., Metheney, P., Polek, ML, Manjunath, K.L. Lee, R.F., Rocha- Peña, M.A Serological detection of Citrus tristeza virus with antibodies developed to the recombinant coat protein. Plant Disease 93: Herron, C.M., MIrkov, T.E., Solís-García, Kahlke, C.J.Skaria, M. and da Garca, J.V Severity of Citrus tristeza virus isolates from Texas. Plant Desease 89:575: Agrios, George. Plant Pathology. 5 th Edition Academic Press. USA. 5. Pappu, H.R,, Karasev, A.V., Anderson, E.J., Pappu, S.S., Hilf, M.E., Febres, V.J., Eckloff, R.M.G., McCaffery, M., Boyko, V., Gowda, S., Dolja, V.V., Koonin, E.V., Gumpf, D.J., Cline, K.C., Garnsey, S.M., Dawson, W.O., Lee, R.F., Niblett, C.L

5 Nucleotide sequence and organization of eight 3 open reading frames of the citrus tristeza closterovirus genome. Virology 199: Sentandreu V., Castro J.A., Ayllón M.A., Rubio L., Guerri J., González-Candelas F., Moreno P. y Moya, A Evolutionary analysis of genetic variation observed in Citrus tristeza virus (CTV) after host passage. Archives of Virology. 151:

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