Cytology FISH Accessory Kit Nº de catálogo K 5499

Transcripción

1 Cytology FISH Accessory Kit Nº de catálogo K ª edición Para hibridación in situ fluorescente (FISH, por sus siglas en inglés) con muestras de citología. El kit contiene reactivos suficientes para 20 tests.

2 Contenido Página Indicaciones de uso...3 Introducción...3 Reactivos...3 Material suministrado...3 Materiales necesarios que no se suministran...3 Precauciones...4 Almacenamiento...4 INSTRUCCIONES DE USO A. Preparación de los reactivos...5 A.1 Wash Buffer (tampón de lavado)...5 A.2 Formaldehído al 3,7%...5 A.3 Stringency Buffer (tampón de astringencia)...5 A.4 Serie de etanol...5 B. Procedimiento de tinción...5 B.1 Notas sobre el procedimiento...5 B.2 Protocolo de tinción...6 Control de calidad...7 Interpretación de los resultados...7 Referencias...8 Resolución de problemas...9 Apéndice

3 Indicaciones de uso Para uso diagnóstico in vitro. Cytology FISH Accessory Kit está indicado para su uso en la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) con muestras de citología. Introducción El kit se emplea en un procedimiento que dura dos días. El primer día, se realiza un pretratamiento de las muestras de citología (suministradas por el usuario) utilizando formaldehído al 3,7% durante 2 minutos, antes de la deshidratación con etanol. Después del pretratamiento, se aplican las sondas FISH suministradas por el usuario y las muestras se sellan con Coverslip Sealant (sellador de cubreobjetos) antes de su desnaturalización e hibridación durante toda la noche. El segundo día se realiza un lavado astringente, que garantiza la retirada de la sonda FISH no unida y unida no específicamente, antes de la deshidratación con etanol. Por último, las muestras se montan con Fluorescence Mounting Medium (medio de montaje fluorescente) que contiene un tinte de contratinción fluorescente azul y se cubren con cubreobjetos. Los resultados se interpretan utilizando un microscopio de fluorescencia dotado del filtro apropiado (consulte el Apéndice 1). Reactivos Material suministrado Los materiales enumerados a continuación son suficientes para 20 tests (un test se define como un área diana de 18 mm x 18 mm). Vial 1 Wash Buffer (x 20) 500 ml de tampón Tris/HCl, concentrado 20 x. Vial 2 Stringency Buffer (x 20) 150 ml de tampón SSC (solución salina con citrato sódico), concentrado 20 x, que contiene un detergente. Vial 3 Artículo 4 Fluorescence Mounting Medium 300 µl Medio de montaje para fluorescencia, listo para su uso, que contiene un tinte de contratinción azul. Coverslip Sealant 1 tubo Solución, lista para su uso, para el sellado (retirable) de cubreobjetos. NOTA: todos los reactivos están formulados específicamente para su uso con este kit. Materiales necesarios que no se suministran Reactivos de laboratorio Agua destilada o desionizada Etanol al 96% Formaldehído al 37% Equipo de laboratorio Pipetas ajustables

4 Termómetro calibrado, de inmersión parcial (intervalo C) Termómetro de superficie calibrado (intervalo C) Cubreobjetos (18 mm x 18 mm) Pinzas Campana de humos Bloque de calentamiento u horno de hibridación para desnaturalización (82 (±2) C) Cámara húmeda de hibridación Horno de hibridación o incubador para hibridación nocturna (45 (±2) C) Portaobjetos Dako Silanized Slides, número de catálogo S 3003, portaobjetos recubiertos de poli-l-lisina, o portaobjetos superfrost Jarras o baños de tinción Cronómetro (capaz de cronometrar intervalos de 2-15 minutos) Baño de agua con tapa (capaz de mantener una temperatura de 65 (±2) C a 99 C) Equipo y accesorios de microscopía Filtros para microscopio de fluorescencia: filtro para DAPI y filtros adecuados para el fluorocromo utilizado, por ejemplo, doble filtro para FITC/Texas Red, o monofiltros para FITC y Texas Red de uso con sondas Dako FISH - consulte el Apéndice 1 para obtener detalles al respecto. Para las sondas Dako FISH se recomienda un microscopio de fluorescencia con una lámpara de mercurio de 100 vatios. Bandeja plegable para portaobjetos de microscopía (bandeja de cartón para 20 portaobjetos con cubierta de bisagra o similar) Precauciones 1. Para uso por profesionales. 2. Vial 1, Wash Buffer (20x), contiene 10-<25% sodium chloride y 10-<20% trometamol. Vial 1 se etiqueta: H319 H315 P280 Peligro P264 P302 + P352 + P P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Provoca irritación ocular grave. Provoca irritación cutánea. Usar guantes de protección. Usar protección para los ojos o la cara. Lavarse las manos concienzudamente tras la manipulación EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y jabón abundantes. Quitar la ropa contaminada. Lavar la ropa contaminada antes de volverla a usar. En caso de irritación cutánea: consultar a un médico. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando.. Si la irritación ocular persiste, consultar a un médico. 3. Vial 2, Wash Buffer (20x), contiene 10-<25% sodium chloride y 10-<20% trometamol. Vial 2 se etiqueta: H319 H315 Peligro Provoca irritación ocular grave. Provoca irritación cutánea.

5 P280 P264 P302 + P352 + P P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Usar guantes de protección. Usar protección para los ojos o la cara. Lavarse las manos concienzudamente tras la manipulación EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y jabón abundantes. Quitar la ropa contaminada. Lavar la ropa contaminada antes de volverla a usar. En caso de irritación cutánea: consultar a un médico. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando.. Si la irritación ocular persiste, consultar a un médico. 4. Accesorio 4, Coverslip Sealant, contiene 100% nafta (petróleo), ligeramente hidrotratada, y se etiqueta Peligro H225 H304 H411 P280 P210 P241 P242 P243 P233 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P405 P403 P235 P501 Líquido y vapores muy inflamables. Puede ser mortal en caso de ingestión y de penetración en las vías respiratorias. Tóxico para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos. Usar guantes de protección. Usar protección para los ojos o la cara. Mantener alejado del calor, superficies calientes, chispas llamas al descubierto y otras fuentes de ignición. No fumar. Utilizar un material eléctrico, de ventilación o de iluminación/antideflagrante. No utilizar herramientas que produzcan chispas. Tomar medidas de precaución contra las descargas electrostáticas. Mantener el recipiente herméticamente cerrado. No dispersar en el medio ambiente. EN CASO DE INGESTIÓN: Llamar inmediatamente a un CENTRO DE TOXICOLOGÍA/médico. NO provocar el vómito. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL Quitar inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuagar la piel con agua o ducharse.. Guardar bajo llave. Almacenar en un lugar bien ventilado. Mantener fresco. Eliminar el contenido y el recipiente de acuerdo con las normativas locales, regionales, nacionales e internacionales. 5. La aplicación de tiempos y temperaturas de incubación o de métodos distintos a los especificados, puede producir resultados erróneos. 6. Los reactivos se suministran a la dilución óptima. Una mayor dilución puede provocar pérdida de eficacia. Almacenamiento Vial 1, Wash Buffer: almacénelo a 2-8 C. Vial 2, Stringency Buffer: almacénelo a 2-8 C. Vial 3, Fluorescence Mounting Medium: almacénelo en la oscuridad a 2-8 C. Artículo 4, Coverslip Sealant: almacénelo a 2-8 C. El Fluorescence Mounting Medium (Vial 3) puede verse afectado negativamente si se expone a niveles de luz excesivos. No almacene este componente ni lleve a cabo análisis bajo una luz intensa, por ejemplo, la luz solar directa.

6 No utilice el kit después de la fecha de caducidad impresa en la caja del kit. Si los reactivos se almacenan bajo condiciones distintas de las especificadas en este documento, el usuario debe validar la eficacia de los reactivos (1). No existen signos obvios que indiquen que este producto sea inestable. Por lo tanto, es importante evaluar células normales presentes en la muestra analizada. Si observa un patrón de fluorescencia inesperado que no pueda atribuirse a las variaciones en los procedimientos de laboratorio y sospecha que existe un problema con Cytology FISH Accessory Kit, contacte con nuestro servicio de asistencia técnica. INSTRUCCIONES DE USO A. Preparación de los reactivos Es conveniente preparar los siguientes reactivos antes de realizar la tinción: A.1 Wash Buffer (tampón de lavado) Diluya una cantidad suficiente del Vial 1 (Wash Buffer x 20) diluyendo el concentrado al 1:20 en agua destilada o desionizada. El tampón diluido sin usar puede almacenarse a 2-8 C durante un mes. Si el tampón diluido presenta un aspecto turbio, deséchelo. A.2 Formaldehído al 3,7% Prepare una cantidad suficiente de formaldehído al 3,7% diluyendo formaldehído al 37% a razón de 1:10 en Wash Buffer diluido (consulte las INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.1). Almacene las jarras, cubiertas, a temperatura ambiente, y utilícelas para un máximo de 100 portaobjetos. Si la solución diluida presenta un aspecto turbio, deséchela. A.3 Serie de etanol A partir de una solución de etanol al 96%, prepare 3 jarras con etanol al 70%, 85% y 96%, respectivamente. Almacene las jarras, cubiertas, a temperatura ambiente o a 2-8 C, y utilícelas para un máximo de 200 portaobjetos. Si las soluciones presentan un aspecto turbio, deséchelas. A.4 Stringency Buffer (tampón de astringencia) Diluya una cantidad suficiente del Vial 2 (Stringency Buffer x 20) diluyendo el concentrado al 1:20 en agua destilada o desionizada. El tampón diluido sin usar puede almacenarse a 2-8 C durante un mes. Si el tampón diluido presenta un aspecto turbio, deséchelo. B. Procedimiento de tinción B.1 Notas sobre el procedimiento El usuario debe leer detenidamente estas instrucciones y familiarizarse con todos los componentes antes de su uso (consulte la sección Precauciones). Todos los reactivos deben equilibrarse con la temperatura correspondiente antes de su uso. Vial 1: el Wash Buffer (tampón de lavado) diluido debe equilibrarse a temperatura ambiente (20-25 C). Vial 2: Stringency Buffer (tampón de astringencia) diluido: una de las jarras debe equilibrarse a temperatura ambiente, y la otra jarra a 65 (±2) C antes de su uso. Vial 3: Fluorescence Mounting Medium (medio de montaje fluorescente) puede aplicarse a cualquier temperatura de 2 a 25 C. Artículo 4: el Coverslip Sealant (sellador de cubreobjetos) puede aplicarse a temperatura ambiente. Todos los pasos deben llevarse a cabo a las temperaturas indicadas. El procedimiento incluye una serie de deshidrataciones, seguidas del secado de las muestras. Asegúrese de que las muestras estén completamente secas antes de continuar con el paso siguiente. No permita que las muestras se sequen durante los demás pasos del procedimiento.

7 B.2 Protocolo de tinción DÍA 1 Paso 1: Prepare los portaobjetos Equilibre con la temperatura ambiente el portaobjetos que porta la muestra de citología. Incube con formaldehído al 3,7% (consulte las INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.2) durante 2 minutos a temperatura ambiente. Saque los portaobjetos del formaldehído al 3,7% y empápelos en el Wash Buffer diluido (consulte las INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.1) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Sustituya el Wash Buffer diluido y empape los portaobjetos durante 5 minutos más. Deshidrate el portaobjeto con la muestra de citología mediante una serie graduada de etanol: 2 minutos en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 85%, y 2 minutos en etanol al 96% (consulte las INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.3). Deje que el portaobjeto se seque al aire, por completo. Paso 2: FISH Probe (sonda FISH, suministrada por el usuario) Este paso debe realizarse en una campana de humos. Aplique una cantidad apropiada de la sonda marcada con fluorocromo, por ejemplo, 10 µl de una sonda Dako FISH, en el centro de la muestra. Coloque inmediatamente un cubreobjeto de vidrio de 18 mm x 18 mm sobre la sonda y deje que ésta se distribuya uniformemente debajo del cubreobjeto. Evite las burbujas de aire. Si las observa, golpee suavemente con una pinzas para retirarlas. Selle el cubreobjeto con el Coverslip Sealant (sellador de cubreobjetos) extendiendo el sellador alrededor de la periferia del cubreobjeto. Deje que el sellador de cubreobjetos se superponga al cubreobjeto y al portaobjeto; así se formará un sello alrededor del cubreobjeto. Asegúrese de que el sellador de cubreobjetos cubra todo el borde del cubreobjeto. Coloque el portaobjeto sobre una superficie plana metálica o de piedra (bloque de calentamiento o bloque en un horno de hibridación) precalentada a 82 (±2) C. Desnaturalice durante 5 minutos asegurándose de que la temperatura del bloque no caiga en ningún momento por debajo de 80 C. Introduzca los portaobjetos en una cámara de hibridación humidificada precalentada. Cubra la cámara con una tapa e incube durante toda la noche (14-20 horas) a 45 (±2) C (si utiliza sondas Dako FISH). Para la desnaturalización e hibridación puede utilizar instrumental, por ejemplo, Dako Hybridizer (números de catálogo S 2450 y S 2451) que permita condiciones similares a las arriba descritas. DÍA 2 Paso 3: Lavado astringente Llene dos jarras de tinción, por ejemplo, jarras de Coplin, con el Stringency Buffer diluido (consulte las INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.4). Para 1-6 portaobjetos en una jarra, es necesario utilizar un volumen mínimo de 100 ml de Stringency Buffer diluido. Para más de 6 portaobjetos, utilice al menos 15 ml de Stringency Buffer por portaobjetos. Introduzca una de las jarras de tinción que contiene Stringency Buffer diluido a temperatura ambiente en una campana de humos, y la otra jarra en un baño de agua. Caliente el baño de agua y el Stringency Buffer diluido a 65 (±2) C. Asegúrese de que la temperatura se ha estabilizado. Cubra la jarra con una tapa a fin de estabilizar la temperatura y evitar la evaporación. Mida la temperatura del interior de la jarra que está en el baño de agua con un termómetro calibrado a fin de mantener la temperatura correcta. Utilizando pinzas o guantes, saque los portaobjetos de la cámara de hibridación y, con cuidado, retire el sellador de cubreobjetos, así como los cubreobjetos, e introduzca los portaobjetos en la jarra de prelavado a temperatura ambiente, uno por uno.

8 Tan pronto como haya retirado todos los cubreobjetos, transfiera los portaobjetos de la jarra de prelavado a temperatura ambiente a la jarra que está a 65 (±2) C en el baño de agua. Lleve a cabo un lavado astringente durante 10 minutos exactos a 65 (±2) C. Saque los portaobjetos del Stringency Buffer diluido y empape las secciones en Wash Buffer diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Cambie el Wash Buffer diluido y empape las secciones durante 3 minutos más. Deshidrate los portaobjetos mediante una serie graduada de etanol: 2 minutos en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 85%, y 2 minutos en etanol al 96% (consulte las INSTRUCCIONES DE USO, Sección A.3). Deje que los portaobjetos se sequen al aire, por completo. Paso 3: Montaje Aplique 15 µl del Fluorescence Mounting Medium que contiene el tinte de contratinción fluorescente azul (Vial 3) al área diana del portaobjeto y cubra con un cubreobjeto de vidrio. NOTA: puede leer los portaobjetos transcurridos 15 minutos desde el montaje, o dentro de un período de 7 días. No obstante, tenga en cuenta que si expone los portaobjetos a la luz o a altas temperaturas, se produce desvanecimiento. A fin de minimizar el desvanecimiento, almacene los portaobjetos en la oscuridad a 2-8 C. Control de calidad 1. Las señales deben ser brillantes, bien diferenciadas y fáciles de evaluar. 2. Las células de tejido normal son un control interno de la ejecución del ensayo. 3. Las células normales deberían presentar señales fluorescentes claramente visibles que indican que las sondas FISH se han hibridado satisfactoriamente con las regiones diana. 4. Si no se detectan señales en las células normales, el ensayo ha fracasado y los resultados deben considerarse no válidos. 5. La morfología del núcleo debe estar intacta al evaluarla utilizando un filtro para DAPI. Si aparecen numerosas células fantasma y una morfología nuclear general pobre, se ha realizado una desnaturalización excesiva de la muestra, que provoca pérdida o fragmentación de las señales. Tales muestras deben considerarse no válidas. Interpretación de los resultados Examine varias áreas de células a fin de tener en cuenta una posible heterogeneidad. Seleccione un área que presente una buena distribución de los núcleos. Comience el análisis en el cuadrante superior izquierdo del área seleccionada y, examinando de izquierda a derecha, cuente el número de señales comprendidas dentro del borde nuclear de cada núcleo evaluado, con arreglo a las pautas siguientes. Enfoque arriba y abajo para encontrar todas las señales de cada núcleo. Cuando dos señales sean del mismo tamaño y estén separadas por una distancia igual o inferior a dos veces el diámetro de una señal, cuente éstas como una sola señal. No puntúe los núcleos que no presenten señales. El número de núcleos que se deben contar para cada sonda debe ser determinado por el usuario. Referencias 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR 7163, February 28, 1992.

9 Resolución de problemas Problema Causa probable Acción sugerida 1. No hay señales o son débiles 1a. El microscopio no funciona correctamente - Juego de filtros inapropiado - Lámpara incorrecta - Lámpara de mercurio demasiado vieja - Objetivos colectores sucios y/o con fisuras - Aceite de inmersión inadecuado 1b. Señales desvanecidas 1c. Evaporación de la sonda durante la hibridación 1d. Condiciones de desnaturalización incorrectas 1e. Condiciones de lavado astringente incorrectas 1a. Compruebe el microscopio y asegúrese de que los filtros que se están utilizando son adecuados para su uso con los fluorocromos; asegúrese también de que la lámpara de mercurio es la correcta y que no se haya utilizado más allá de su vida útil esperada (consulte el Apéndice 1). En caso de duda, contacte con el vendedor del microscopio. 1b. Evite los exámenes prolongados con el microscopio y minimice la exposición de las muestras a fuentes de luz intensa. 1c. Asegúrese de que hay suficiente humedad en la cámara de hibridación. 1d. Asegúrese de que la temperatura de desnaturalización es de 82 (±2) C. 1e. Asegúrese de utilizar la temperatura y el tiempo recomendados para el lavado astringente, y de retirar los cubreobjetos antes de llevar a cabo el lavado astringente. 2. Áreas sin señal 2a. Volumen de sonda insuficiente 3. Excesiva tinción de fondo 2b. Burbujas de aire atrapadas durante la aplicación o el montaje 3a. La temperatura del lavado astringente es demasiado baja 3b. Exposición prolongada de la sección hibridada a una luz intensa 2a. Asegúrese de que el volumen de sonda sea lo suficientemente grande para cubrir el área que hay debajo del cubreobjeto. 2b. Evite las burbujas de aire. Si las observa, golpee suavemente con unas pinzas para retirarlas. 3a. Asegúrese de que la temperatura del lavado astringente es de 65 (±2) C. 3b. Evite los exámenes prolongados con el microscopio y minimice la exposición a fuentes de luz intensa.

10 Problema Causa probable Acción sugerida 4. Morfología nuclear pobre o tinción nuclear débil 4a. La temperatura de desnaturalización es demasiado elevada 4a. Asegúrese de que la temperatura de desnaturalización es de 82 (±2) C NOTA: si el problema no puede atribuirse a ninguna de las causas anteriores, o si la acción correctora sugerida no consigue resolver el problema, llame al servicio de asistencia técnica de Dako para obtener ayuda adicional.

11 Apéndice 1 Cytology FISH Accessory Kit, Nº de catálogo K 5499 Especificaciones del microscopio de fluorescencia Dako le recomienda que utilice el siguiente equipo con el Cytology FISH Accessory Kit (si utiliza sondas Dako FISH): 1. Tipo de microscopio Microscopio de epifluorescencia. 2. Lámpara Lámpara de mercurio de 100 vatios (mantenga un registro del tiempo de combustión). 3. Objetivos Para el cribaje del tejido, puede aplicar objetivos de fluorescencia a seco 10X u objetivos de fluorescencia para aceite de inmersión 16X. Para un aumento de alta potencia y para la puntuación de las señales, le recomendamos que utilice exclusivamente objetivos de fluorescencia para aceite de inmersión, por ejemplo, 100X. 4. Filtros Los filtros están diseñados individualmente para cada fluorocromo concreto, y debe elegirlos en consonancia. Si se utilizan sondas Dako FISH DNA, Dako recomienda el uso de un filtro específico para DAPI en combinación con un doble filtro de alta calidad específico para Texas Red/FITC. Filtro para DAPI, por ejemplo, filtro Chroma Nº Doble filtro para Texas Red/FITC, por ejemplo, filtro Chroma Nº Puede utilizar un filtro sencillo para Texas Red y otro filtro sencillo para FITC con fines de confirmación. Fluorocromo Longitud de onda de excitación Longitud de onda de emisión FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Los filtros son específicos de cada tipo de microscopio y el uso de los filtros adecuados es crucial para la interpretación. Si desea obtener información detallada al respecto, contacte con el proveedor de su microscopio o con el representante de Dako. 5. Aceite Aceite no fluorescente. Precauciones Cada fluorocromo requiere un equipo diferente, que debe elegirse en consonancia. Para sondas Dako FISH no se recomienda utilizar una lámpara de mercurio de 50 vatios, no se pueden utilizar filtros de rodamina, y no se recomienda utilizar triples filtros. Un microscopio no optimizado puede causar problemas al leer las señales fluorescentes. Es importante que la fuente de luz no haya caducado y que esté correctamente alineada y enfocada. Los clientes deben supervisar la lámpara de mercurio y seguir las recomendaciones del fabricante. Antes de interpretar los resultados, debe haberse realizado el mantenimiento del microscopio, y la lámpara de mercurio debe estar alineada.

12 Debe esforzarse por exponer la muestra a la menor cantidad de luz de excitación posible a fin de minimizar el desvanecimiento de la fluorescencia. Le recomendamos que estudie la configuración de su microscopio concreto con el fabricante de éste antes de empezar la hibridación in situ fluorescente, o que consulte la literatura. Fabricante: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel Fax Explicación de los símbolos Número de código Límite de temperatura Código de lote Producto sanitario para diagnóstico in vitro Consulte las instrucciones de uso Mantener alejado de la luz solar (consulte la sección Almacenamiento) Contenido suficiente para <n> ensayos Fecha de caducidad Fabricante Pictograma GHS (consulte el apartado de precauciones) Pictograma GHS (consulte el apartado de precauciones) Pictograma GHS (consulte el apartado de precauciones) Pictograma GHS (consulte el apartado de precauciones)