NOA. Salta. Corrientes NEA. Tucumán. Entre Ríos. Buenos Aires

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Pascual Aranda Araya
hace 7 años
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1 Monitoreo de la población de Diaphorina citri citri yprevención del Huanglongbing en Argentina Lic. María Inés Plata Tamayo INTA-EEA Concordia Septiembre de 2011

2 Zonas citrícolas Jujuy NOA Misiones Salta Tucumán NEA Corrientes Entre Ríos Buenos Aires ARGENTINA

3 Regiones citrícolas Noroeste Argentino (NOA): Limones Noreste Argentino Pomelos (NEA): Naranjas Mandarinas

4 Producción Argentina en 2010 Total: 2.6 millones de toneladas Mandarina 17% Pomelo 43% Limón 43% Naranja 33% Fuente: Federcitrus, 2011

5 Argentina

6 El Programa Nacional de Prevención de HLB fue creado el 13 de agosto del 2009 por la Resolución SAGPyA 517/09: Participantes del programa: Sector privado (CECNEA, AFINOA) Institutos de Investigación (EEAOC, INTA) Organismos de Fiscalización (SENASA, INASE) Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca

7 Componentes del Programa Nacional de Prevención de HLB: Fiscalización Vigilancia Fitosanitaria Investigación y desarrollo Capacitación y difusión Coordinación y seguimiento

8 Fiscalización: Fortalecimiento de fronteras y puntos de ingreso. Control de materiales de propagación (200 variedades libres de enfermedades), registro de viveros, inspección de la producción y comercialización de plantas cítricas. Eliminación de hospederos alternativos y control de arbolado urbano. Plan de contingencia y atención de emergencias.

9 Vigilancia Fitosanitaria: Monitoreo, seguimiento, registro de ocurrencia y toma de muestras de Diaphorina citri (detectado en 1984). Monitoreo de plantaciones comerciales y urbanas, con toma de muestras de material vegetal con sintomatología sospechosa. Colocación de una Red de trampeo en las zonas de ausencia de Diaphorina citri para la detección del insecto.

Ubicación de lotes de cultivo y otras áreas de riesgo Paraguay Brasil

10 Asignación de los Sitios de Monitoreo: Se determinaron las áreas de producción de cítricos a monitorear en todo el país. Ubicación de lotes de cultivo y otras áreas de riesgo Paraguay Brasil Cuadrícula: 1000 has Subcuadrículas: 111 has Uruguay Generación de una grilla regular y asignación de sitios de monitoreo

11 BOLIVIA Provincia de Entre Ríos PARAGUAY URUGUAY CHILE

12 30 31 S 54 Km de Ancho Presencia de Dc Ausencia de Dc Argentina itud Km Long O O R. O. del Uruguay S

15 Captura de Diaphorina citri con el aspirador

16 Se toman las coordenadas con GPS Acondicionamiento de la muestra

17 Usuario: Clave: Ingresar Carga de información al sistema informático del SENASA

Investigación y Desarrollo: Diagnóstico: Con la técnica de PCR en Tiempo Real: (1) Laboratorio Vegetal del SENASA - Capital Federal, Buenos Aires (2) INTA-EEA

18 Investigación y Desarrollo: Diagnóstico: Con la técnica de PCR en Tiempo Real: (1) Laboratorio Vegetal del SENASA - Capital Federal, Buenos Aires (2) INTA-EEA Concordia, Entre Ríos (3) INTA-EEA Bella Vista, Corrientes (5) INTA-EECT Yuto, Jujuy (6) Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres, San Miguel de Tucumán, Tucumán

19 Técnica de PCR en Tiempo Real: (1) Laboratorio Vegetal del SENASA, Bs. As. (2) INTA-EEA Concordia, Entre Ríos (3) INTA-EEA Bella Vista, Corrientes (5) INTA-EECT Yuto, Jujuy (6) EEAOC, San Miguel de Tucumán, Tucumán

20 Técnica de PCR Convencional: (1) Laboratorio del INASE, Bs. As. (4) INTA-EEA Montecarlo, Misiones Secuenciación de ADN: (7) Laboratorio INTA-IFFIVE (7) Laboratorio INTA-IFFIVE, Córdoba, Córdoba

Es posible detectar la bacteria en los psílidos 1 a 2 años antes que la planta muestre síntomas.

21 En países sin HLB pero con la presencia del vector (D. citri) ) se recomienda el análisis por PCR en tiempo real (qpcr o cuantitativa). Es posible detectar la bacteria en los psílidos 1 a 2 años antes que la planta muestre síntomas. La alta sensibilidad de la qpcr permite detectar la presencia de Ca. Liberibacter asiaticus ( (Las Las) )yca Ca. Liberibacter americanus (Lam) en un solo insecto adulto o en cinco ninfas. JPRB-2007 EEA CONCORDIA

22 PCR en Tiempo Real o cuantitativa (qpcr) Los productos son analizados a medida que se obtienen. No hay manipulación post-pcr (reduce problemas de contaminación). Alta sensibilidad.

23 1. Recepción y registro de muestras Se asigna un número interno del laboratorio

24 Cada muestra es registrada en una planilla.

25 Laboratorio de Protección Vegetal y Biotecnología - INTA-EEA Concordia

26 2. Extracción del ADN a. Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papel de filtro. b. Pasar psílidos a tubos con tapa a rosca c. Molerlos en homogenizador + proteinasa K. d. Dejar actuar durante 2-3 hs en baño de María (50ºC) e. Extracción con fenol/cloroformo/alcohol - recuperar la fase acuosa (superior). f. Extracción con cloroformo/alcohol - recuperar la fase acuosa (superior). g. Precipitar ADN con etanol helado. h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir.

28 2. Extracción del ADN a. Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papel de filtro. b. Pasar psílidos a tubos con tapa a rosca c. Molerlos en homogenizador + proteinasa K. d. Dejar actuar durante 2-3 hs en baño de María (50ºC) e. Extracción con fenol/cloroformo/alcohol - recuperar la fase acuosa (superior). f. Extracción con cloroformo/alcohol - recuperar la fase acuosa (superior). g. Precipitar ADN con etanol helado. h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir.

30 2. Extracción del ADN a. Colocar 5 psílidos (adultos o ninfas) sobre papel de filtro. b. Pasar psílidos a tubos con tapa a rosca c. Molerlos en homogenizador + proteinasa K. d. Dejar actuar durante 2-3 hs en baño de María (50ºC) e. Extracción con fenol/cloroformo/alcohol - recuperar la fase acuosa (superior). f. Extracción con cloroformo/alcohol - recuperar la fase acuosa (superior). g. Precipitar ADN con etanol helado. h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir.

32 2. Extracción del ADN g. Precipitar ADN con etanol helado. h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir. i. Resuspender ADN en tampón correspondiente. i. Calentar a 65ºC en baño de María para desnaturalizar DNAsas. j. Almacenar a -20ºC.

34 2. Extracción del ADN g. Precipitar ADN con etanol helado. h. Centrifugar y descartar el alcohol. Repetir. i. Resuspender ADN en tampón correspondiente. j. Colocar a 65ºC en baño de María para desnaturalizar DNAsas. k. Almacenar a -20ºC.

35 Muestras de ADN para analizar por qpcr

36 qpcr: 1. Preparar cóctel. 2. Agregar cóctel y molde (muestra de ADN) a cada tubito de la placa. Incluir testigos (+) y (-). 3. Colocar placa en Termociclador y programar. 4. Al cabo de 1h y 30 min se obtienen los resultados. 5. Analizar resultados. 6. Informar resultados.

37 qpcr: FAM HEX Gráficos de amplificación. Sonda FAM: detección de ADN de Ca. Liberibacter asiaticus/americanus. Sonda HEX: detección del ADN del psílido (control interno).

38 Los resultados obtenidos se cargan online

39 Cantidad de muestras y sitios monitoreados por provincia al 30 de Julio de Provincia Nº de Sitios Monitoreados Nº de Monitoreos sin toma de muestra Nº de Muestras de D. citri analizadas Nº de Muestras de Material Vegetal analizadas Las/Lam (+) Buenos Aires Catamarca Chaco Corrientes Entre Ríos Formosa Jujuy Misiones Salta Santiago del Estero Tucumán Totales

Resumen de avance del Monitoreo al 30 de Julio del 2011 Actualmente, se han

En el 56% de los sitios monitoreados no se detectó la presencia de D. citri.

el 43% de los sitios monitoreados se detectó la presencia de D.

40 Resumen de avance del Monitoreo al 30 de Julio del 2011 Actualmente, se han realizado más de monitoreos en todo el país. En el 56% de los sitios monitoreados no se detectó la presencia de D. citri. i Distribución del monitoreo de Diaphorina citri en plantaciones citrícolas En el 43% de los sitios monitoreados se detectó la presencia de D. citri y se llevó a cabo la toma de muestras. A la fecha, no se han registrado resultados positivos en las muestras analizadas.

41 Investigación y Desarrollo: Dinámica Poblacional de Diaphorina citri Control Químico de Diaphorina citri y sus consecuencias de residuos. Control Biológico de Diaphorina citri Tamarixia radiata (Waterston)

Capacitación y difusión: Para difundir la problemática y prevenir

capacitación a personal de frontera y control de rutas.

mitigación de HLB con representantes de Argentina, Brasil, Chile,

42 Capacitación y difusión: Para difundir la problemática y prevenir el ingreso de la enfermedad se han realizado talleres de capacitación a personal de frontera y control de rutas. 1º (2009) y 2º (2011) Taller Sudamericano sobre prevención y mitigación de HLB con representantes de Argentina, Brasil, Chile, Paraguay, Perú, Uruguay y EEUU. Capacitación al personal del programa en las distintas áreas.

43 Herramientas de Difusión y Capacitación: Material Gráfico: Folletería para el público en general Folletos técnicos Cartelería

44 Herramientas de Difusión y Capacitación: Material Audiovisual: Video institucional Micros radiales y entrevistas con expertos

45 Agradecimientos: Ing. Agr. Yanina Outi (SENASA) - youti@senasa.gov.ar Ing. Agr. R. Pablo Flores (SENASA) - rflores@senasa.gov.ar Ing. Agr. Federico Aguirre (SENASA) - faguirre@senasa.gov.ar

46 Muchas gracias Lic. María Inés Plata Tamayo

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