INFORME TÉCNICO DEL PROYECTO CGPI PEPTIDOS BIOACTIVOS OBTENIDOS MEDIANTE TECNOLOGÍA ENZIMÁTICA. Director: M.C. ROBERTO BRIONES MARTÍNEZ

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1 RESUMEN INFORME TÉCNICO DEL PROYECTO CGPI PEPTIDOS BIOACTIVOS OBTENIDOS MEDIANTE TECNOLOGÍA ENZIMÁTICA Director: M.C. ROBERTO BRIONES MARTÍNEZ El suero lacteo es un subproducto que se obtiene de la producción del queso, y del cual no se aprovechan sus propiedades nutricionales y funcionales (Pruneda, 2003). Por otra parte, se conoce que la hidrólisis enzimática de las proteinas del suero lacteo es una buena alternativa tecnológica para mejorar la funcionalidad de proteínas (Gauthier y Pouliot, 2003). En este contexto, una nueva preparación enzimática que ha mostrado propiedades fisicoquimicas de interes cientifico y práctico es la hemisfericina una peptidasa cisteínica polimórfica obtenida de los frutos de la planta mexicana Bromelia hemisphaerica (timbirichi). Su modo de accion en la hidrólisis y en la modificacion de propiedades funcionales de proteinas, permite inferir su utilidad como enzima industrial en usos alimentarios (Briones, 1994). Por lo anterior el objetivo de la presente etapa de la investigación fue estudiar las propiedades de la hemisfericina comparativamente con la enzima comercial Alcalasa, en la modificacion enzimática de las proteinas del suero lácteo, así como caracterizar la funcionalidad resultante de los hidrolizados y de las fracciones peptídicas separadas por ultrafiltración. Experimentalmente el enfoque incluye la producción de fracciones péptidicas a partir de proteínas de suero lácteo mediante proteólisis limitada en condiciones ph-stat y aislarlas mediante ultrafiltración. Interesa estudiar la influencia de la especificidad enzimática, el grado de hidrólisis y la separación por membrana, en las propiedades biológicas de péptidos y polipéptidos generados en la modificación estructural controlada de las proteínas de suero lácteo. Especialmente, se busca desarrollar conocimiento acerca del potencial de aplicación de la nueva preparación proteolítica hemisfericina, para mejorar la funcionalidad de las proteínas del suero lácteo, una fuente subutilizada de proteínas de alta calidad. GENERALIDADES En México la producción de leche y sus derivados es de gran importancia económica. Anualmente se producen 25,000 toneladas de diversos tipos de quesos, proceso en el que 1

2 se generan 225,000 toneladas de suero lácteo; subproducto que en su mayoría de los casos es desechado (Murillo et al., 2005). El suero lácteo desechado resulta ser una pérdida económica y un grave problema ambiental, ya que por cada 1000 L de suero lácteo se generan aproximadamente 35 Kg. de DBO (Demanda Biológica de Oxigeno) y cerca de 68 Kg. de DQO (Demanda Química de Oxigeno), lo cual es equivalente a la fuerza contaminante de las aguas negras producidas por 450 personas en un día (Jelen, 1979). Las proteínas que se encuentran en el suero lácteo pueden ser utilizadas para mejorar el sabor, la textura, la apariencia y en algunos casos el valor nutricional de productos procesados (Guemes, 2005). Por lo anterior es necesario buscar posible solución tecnológica para aprovechar las propiedades nutritivas y funcionales de los componentes del suero lácteo. El suero lácteo se puede obtener mediante tres procesos principales (Zinsly y col., 2001; Maubois y col., 2001): por el proceso de coagulación enzimática (utilizando quimosina), dando por resultado el coágulo de caseínas, materia prima para la producción de quesos, y el suero dulce; por precipitación ácida en el punto isoeléctrico (pi), dando por resultado la precipitación isoeléctrica de la caseína, que se transforma en caseinatos y suero ácido; y mediante la separación física de micelas de caseína por microfiltración, consiguiendo un concentrado de micelas y de proteínas del suero, en forma de concentrado o aislado proteínico. El suero lácteo contiene una mezcla de proteínas (α-lactoalbúmina, β- lactoglobulina, globulinas y proteosas peptona) con una amplio gama de propiedades químicas, físicas y funcionales. Estas proteínas no sólo juegan un importante papel nutricional sino que además, pueden mostrar diversas actividades biológicas. Por lo tanto, ante la creciente demanda de proteínas alimentarias, farmacéuticas e industriales, que requieren proteínas con propiedades funcionales especificas, el aprovechamiento de las proteínas del suero lácteo se presenta como una buena alternativa. La hidrólisis enzimática de las proteínas del suero puede ser una mejorar algunas de sus propiedades y ofrece oportunidades interesantes para su uso (Gauthier y Pouliot, 2003). Es decir, es factible modificar las estructuras proteínicas y obtener preparaciones con buenas propiedades funcionales empleando proteasas y combinando con la proteólisis limitada. Existe una diversidad de proteasas industriales potencialmente útiles para esos fines. Entre las proteinasas serínicas, es el caso de la subtilisina, de origen 2

3 microbiano, cuyo presentación comercial más conocida es la Alcalasa (Subtilopeptidasa A de Novozymes). En el presente informe se analizan los resultados de la etapa de la investigación que comprende el estudio comparativo entre la proteinasa comercial Alcalasa y la proteinasa cisteínica de origen vegetal, obtenida de la bromeliacea mexicana Bromelia hemisphaerica: la hemisfericina, en la proteólisis limitada de proteínas de suero lácteo. MÉTODOS Y MATERIALES. Hidrólisis enzimática de las proteínas de suero lácteo. La modificación de las proteínas vía enzimática se realizó mediante experimentos de hidrólisis por lote en un vaso de reacción, con doble pared para control de la temperatura, acoplado a un titulador automático ph-stat con registro del consumo de NaOH. Las proteínas del suero se hidrolizaron enzimáticamente a ph 8.0 y temperatura de 45 C. Se realizó un seguimiento de las reacciones enzimáticas por medio de titulación automática y continua de los protones liberados a ph constante. Fraccionamiento de los hidrolizados obtenidos mediante ultrafiltración. El proceso de ultrafiltración se realizó utilizando el ultrafiltro Lab-Scale de Millipore. Determinación de la actividad proteolítica. La actividad proteolítica de las preparaciones enzimáticas se determió mediante el método de Ortega y del Castillo (1966), empleando como sustrato caseína al 1%. La cual se prepara disolviendo 2 g de caseína en regulador de fosfatos 0.05 M ph 7.6 y sometiéndola a ebullición en baño maría durante 20 min para lograr su desnaturalización; se deja enfriar y se lleva a un volumen de 190 él. con regulador. Al preparar la mezcla enzima sustrato la concentración final de caseína será de 1%. Para realizar la medición de la actividad proteolítica de una enzima se realizó lo siguiente; en un baño a temperatura de 35 ºC, se colocaron los tubos de ensayo conteniendo 1.9 ml de caseína para su incubación durante 10 min, y posteriormente se agregaron 0.1 ml de la preparación enzimática y se dejó actuar durante 10 min. La reacción fue detenida adicionando 3 ml de ácido tricloroácetico (ATC) al 5%. Simultáneamente se corrió un testigo al que se le adiciona primero el ATC y al final la 3

4 preparación enzimática. Al término de la reacción se centrifugaron los tubos a 2,800 x g. Finalmente, los productos de la hidrólisis enzimática que se encuentran en el sobrenadante, aminoácidos libres y péptidos pequeños, se leyeron en un espectrofotómetro a 280 nm, ajustando el aparato con una mezcla de 2 ml de regulador de fosfatos 0.05 M ph 7.6 y 3 ml de ATC al 5%. Método de Bradford. El método consiste en la reacción de las proteínas y el reactivo de Bradford (1976) preparado de la siguiente manera. Primero, se obtiene una solución concentrada que incluye 100 mg de azul de Coomasie G-250 (sigma) con 50 ml de etanol al 95% y 100 ml de ácido fosfórico al 65% pureza al 85%, se homogeniza y se afora posteriormente a 1 L con agua desionizada. El procedimiento de método consiste en hacer reaccionar 100 µl del sobrenadante de las dispersiones de las enzimas con 2 ml del reactivo de Bradford, agitar brevemente en un vortex, dejar reposar durante 5 min y leer a 595 nm, en un espectrofotómetro. La curva tipo utilizada para calcular el contenido de proteína se preparó utilizando albúmina de suero de bovino (2.5 mg/10 ml de agua). Propiedades Funcionales Determinación de proteína soluble. Se empleó el método de Kabirullah y Wills (1982), que consiste en preparar 10 ml de una dispersión al 1% de proteína en agua destilada y ajustar el ph seleccionado, en este caso se manejaran muestras a ph 3, 5, 7, 9 y 11, agitar durante 30 min, centrifugar a 10,000 x g por 25 min y analizar el contenido de proteína soluble en el sobrenadante mediante el método de Bradford (1976). Determinación del índice de actividad emulsionante. Las propiedades emulsionantes de las dispersiones se determinaron mediante el método de Pearce y Kinsella (1978). Las dispersiones se prepararon al 0.1% (p/v) de proteína en regulador de fosfatos 0.1 M ph 7.4. La proteína fue dispersada en una batidora de cocina philips a velocidad 4 durante 1 min. Para obtener las emulsiones propiamente dichas se prepararon mezclas de aceite de maíz y dispersión proteínica en una proporción de 1:3 y se sometieron a agitación durante 1 min en la batidora. Inmediatamente después de la homogeneización se tomaron 4

5 cuidadosamente del fondo del recipiente, alícuotas de 0.1 ml y se diluyeron con 5 ml de una solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 2% en regulador de fosfatos ph M. Finalmente se midió la absorbancia de las emulsiones diluidas contra un blanco de regulador a 500 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu UV-160). Las lecturas de absorbancia fueron utilizadas para calcular el índice de Actividad Emulsionante utilizando la fórmula definida por Pearce y Kinsella (1978). Los análisis fueron realizados por triplicado. Determinación de la estabilidad emulsionante. La estabilidad relativa de las emulsiones preparadas en este estudio se siguió en emulsiones preparada mediante el método de Pearce y Kinsella (1978), de las cuales se tomaron alícuotas de 0.1 ml a tiempos de 0, 1, 2 y 3 min después de la homogeneización, se diluyeron en dodecil sulfato de sodio (SDS) 2% y se leyeron las absorbancias a 500 nm Los análisis fueron realizados por triplicado Determinación de la capacidad y estabilidad de formación de espuma Se empleó el método de Venktesh y Prakash (1993) que consiste en adicionar 3 g de preparación proteínica desgrasada en 100 ml de agua destilada, ajustar a ph 7, homogenizar a 3000 g durante 5 min en un homogeneizador virtis a 35 C y transferir a una probeta graduada. Se calculó el volumen de espuma después de 30 seg y el incremento de volumen se expreso como la capacidad de formación de espuma en porcentaje. La estabilidad de la espuma se determinó midiendo la disminución de volumen de espuma en función del tiempo en un periodo de hasta 30 min la densidad de espuma se calcula dividiendo el volumen de espuma entre el peso correspondiente. Actividad antioxidante. La evaluación de la actividad antioxidante de las muestras se realizó a través del método DPPH con algunas modificaciones al método descrito por Von Gadow et al (1997) con el fin de ajustarlo a este trabajo experimental. Se preparó una solución 1 mm de DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidracilo) en metanol al 100% y una dispersión proteínica al 2 %. La reacción se efectúa agregando 1 ml de DPPH y 3 ml de la dispersión proteínica, la mezcla es agitada vigorosamente y posteriormente se mantiene en reposo durante 30 min en la oscuridad; al finalizar el tiempo de reposo, se lleva a 5

6 centrifugación a 10, 000 g durante 30 min y se lee el sobrenadante a 517 nm. Se utiliza metanol como blanco y la solución de DPPH como testigo RESULTADOS Curvas de hidrólisis. En la Figura 1 se muestran comparativamente los cursos de la reacción de hidrólisis, durante 180 min, de las proteínas de suero lácteo obtenidas con la Alcalasa y con la hemisfericina. El mayor grado de hidrólisis (mayor consumo de base) se obtuvo con la proteasa serínica comercial microbiana Alcalasa (subtilisina grado alimentario de Novozymes). Con la cisteínica hemisfericina el grado de hidrólisis fue menor; es decir, aparentemente, hubo una proteólisis más limitada con dicha enzima. Evolución del contenido de proteína hidrolizada. En la Figura 2 se presentan los valores del contenido de proteína soluble, determinados mediante el método de Bradford, de los hidrolizados de proteínas de suero lácteo obtenidos a dieferentes grados de hidrólisis: 30, 60 y 180 min. En ambos casos enzimáticos se observó una disminución del contenido de proteína soluble, como indicativo de la acción enzimática. En particular, la Alcalasa presenta una mayor actividad enzimática sobre las proteínas solubles, con aumento en función del grado de hidrólisis o tiempo de reacción. Con hemisfericina, en cambio, la hidrólisis de las proteínas solubles fue más moderado, mostrando también un incremento conforme avanza el tiempo de reacción. Propiedades funcionales Los hidrolizados se prepararon analizando comparativamente dos tipos de preparaciones proteínicas: una comercial de Sigma y otra preparada en el laboratorio a partir de suero fresco obtenido de una planta que elabora quesos. Los hidrolizados obtenidos con las 6

7 enzimas en estudio, fueron separados por ultrafiltración con membrana de 5 kda. Los hidrolizados y las fracciones separadas por ultrafiltración fueron posteriormente sometidos a análisis del índice de actividad emulsionante (IAE) y de la actividad antioxidante (AOX) del radical DPPH. Los resultados se muestran a continuación. Índice de actividad emulsionante. En las Figuras 3 y 4 se presentan los valores de IAE determinados a los hidrolizados totales de las proteínas de suero lácteo comercial, con Alcalasa y hemisfericina, a 1 h y 3 h de reacción, respectivamente. La hemisfericina en ambos tiempos de reacción generó hidrolizados que presentaron una mejora importante del IAE y de la estabilidad de la emulsión, que originalmente tienen las proteínas no tratadas enzimáticamente. Con Alcalasa, en cambio, hubo una disminución del IAE y de la estabilidad de la emulsión conforme aumentó el grado de hidrólisis. Este efecto es consistente con la mayor actividad o proteólisis más extensiva, que muestra la Alcalasa en las curvas de hidrólisis y en la digestión de las proteínas solubles. Aparentemente, la hemisfericina, por efecto de su modo de acción más moderado, causa una proteólisis limitada que induce cambios estructurales más favorables para características más hidrofóbicas que resultan en una mejoría importante de la actividad emulsionante. En las Figuras 5, 6 y 7 se muestran los valores de IAE obtenidos con los hidrolizados a dieferentes tiempos de reacción, utilizando como sustrato las proteínas de suero lácteo preparadas en el laboratorio. Es importante observar que dicha preparación de laboratorio sin tratamiento enzimático mostró muy buena actividad emulsionante y estabilidad de emulsión, significativamente mejor que la mostrada por la preparación comercial. Con estas proteínas el efecto de la hemisfericina solo mostró mantener la funcionalidad, no la mejoró pero tampoco la destruyó. Se infiere que el método de laboratorio permitió un mejor control de las condiciones desnaturalizantes de la estructura proteínica. La Alcalasa, por el contrario, mostró una destrucción de las propiedades estructurales que favorecen la actividad emulsionante. 7

8 Actividad antioxidante del DPPH. En las Figuras 8, 9 y 10 se muestran los resultados de actividad antioxidante obtenidos con: el hidrolizado total de proteínas de suero lácteo comercial, y de los permeados y retenidos de ultrafiltración (5 kda) separados de los hidrolizados de 1 y 3 horas de reacción, respectivamente. Las preparaciones modificadas con hemisfericina feron las que mostraron las mejoras más importantes en la actividad antioxidante: tanto el hidrolizado total (Figura 8), el retenido de las proteínas digeridas por 60 min (Figura 9), como el permeado de las proteínas hidrolizadas por 180 min (Figura 10, no mostrada en este documento por razones de espacio límite del archivo electrónico a enviar), fueron las especies proteínicas y peptídicas que mostraron los valores más altos de actividad antioxidante. En las figuras 11, 12 y 13 (no mostradas en este documento por razones de espacio límite del archivo electrónico a enviar) representan los valores de AOX de los hidrolizados, retenidos y permeados de ultrafiltración obtenidos con las proteínas de suero preparadas en el laboratorio a tres diferentes tiempos de reacción: 30, 60 y 180 min, respectivamente. La acción de las proteasas en estudio sobre las proteínas de la preparación de laboratorio no modifico la actividad antioxidante. La modificación enzimática, aparentemente, no generó especies con las características químicas que tienen efecto para atrapar radicales libres. 8

9 Figura 1. Curvas de hidrólisis ph-stat. Comparativo de la hidrólisis de proteínas de suero lácteo con Alcalasa y hemisfericina. Tiempo máximo de reacción: 180 min. Figura 2. Contenido de proteína soluble (Bradford) de los hidrolizados de proteínas de suero con Alcalasa y hemisfericina a 30, 60 y 180 min de reacción. 9

10 Figura 3. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero comercial con Alcalasa y hemisfericina; 1 h de reacción. Figura 4. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero comercial; 3 h de reacción. 10

11 Figura 5. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero laboratorio; 30 min de reacción. Figura 6. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero laboratorio; 60 min de reacción. 11

12 Figura 7. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero laboratorio; 80 min de reacción. Figura 8. Actividad antioxidante del radical DPPH de los hidrolizados de proteínas de suero comercial con Hemisfericina a dos grados de hidrólisis. 12

13 Figura 9. Actividad antioxidante del radical DPPH. Comparativo de los permeados y retenidos de ultrafiltración, separados de los hidrolizados de proteínas de suero comercial con Alcalasa y hemisfericina; 60 min de reacción. IMPACTO Los resultados muestran la importancia del tipo de tratamiento que sufren las proteínas lácteas en su preparación industrial. Asimismo, se pudo demostrar en la presente etapa de la investigación, que la hemisfericina, por su modo de acción más limitado y selectivo en la hidrólisis de proteínas, es una buena alternativa para la modificación y/o mejora de las propiedades funcionales de proteínas alimentarias subutilizadas (como son las que genera la producción de quesos) y/o materiales proteínicos de alta calidad que por razones de ser un subproducto que fue sometido a un procesamiento desnaturalizante han perdido su funcionalidad y por lo tanto su aplicabilidad en formulas alimentarias. En suma, la investigación en curso aporta información que demuestra la factibilidad de aplicación de una preparación industrial de hemisfericina, obtenida de un recurso florístico mexicano con potencial agroindustrial. 13

14 BIBLIOGRAFÍA. Bradford, M.M A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of dye binding. Anal. Biochem. 72: Briones M. R, Cortes V. M. I., Oliver S. M. C Preparaciones enzimáticas de interés industrial con proteinasas de plantas mexicanas. Rev Latinoam. Inf. Tec., 5(1) Cruz, M. T., Oliver, M. C., Vázquez, J. L. y del Castillo, L. M Proteinasas vegetales I. Una nueva enzima de Bromelia hemispaherica. XII Congreso Nal. de Ciencias Fisiológicas y I Reunión Regional de la Asoc. Latinoamer. de Ciencias Fisiológicas. Querétaro, Qro. México. Chen, S. X., Swaisgood H. E., Foegeding E. A Gelation of β-lactoglobulin treated with limited proteolysis by immobilized trypsin. J. Agric. Food Chem. 42: Garduño, R., Soriano, M., Chávez, E., Cruz, V. M. T., Del Castillo, L.M. y Castañeda Agulló, M Proteinasas de plantas mexicanas II. Puntos isoeléctricos y caracterización de formas moleculares múltiples en enzimas de bromeliáceas. Rev. Latinoamer. Quím., Gauthier S. F. y Pouliot Y Functional and Biological Properties of Peptides Obtained by Enzymatic Hydrolysis of Whey Proteins J. Dairy Sci. 86, E78 E87. Kabirullah, M y Wills, R. B. H Functional properties of acetylated and succinylated sunflower protein isolate. J. Food Technol., 17, Murillo G. F Aprovechamiento del lactosuero en la elaboración de una bebida fermentada Congreso Internacional De Inocuidad Alimentaria, Universidad Autónoma de Nuevo León, México. Pearce, K.N. y Kinsella, J.E Emulsifying properties of proteins: evaluation of a turbidimetric technique. J. Agric. Food Che., 26, Venktesh, A y Prakash, V Functional properties of the total proteins of sunflower (Helianthus annuus L.) Seed-effect of physical and chemical treatments.j. Agric. Food Chem., 41, von Gadow A., Joubert E., and C.F. Hansmann Comparison of the antioxidant activity of aspalathin with that of other plant phenols of Rooibos Tea (Aspalathus lineari), alpha-tocopherol, BHT, and BHA. J. Agric. Food Chem. 45: