QBIIA - Organización y Función Celular 2017 MODULO I: Arquitectura celular Motores moleculares. Christiaan Huygens, siglo XVII

Transcripción

1 QBIIA - Organización y Función Celular 2017 MODULO I: Arquitectura celular Motores moleculares Christiaan Huygens, siglo XVII

2 Transporte intracelular -las redes de MT, MF y FI representan un impedimento para libre difusión -microinjección de dextranos indica difusión muy baja para partículas mayores de 500 kd -transporte subceular es mediado por MOTORES MOLECULARES

3 La organización y dinámica intracelular REQUIERE la actividad constante de motores moleculares

4 Los motores moleculares son enzimas mecanoquímicas: consumen ATP generando trabajo mecánico -transporte de partículas y organelas (cromosomas, RNPs, organelas de membrana) -tensión para cambios morfológicos, fagocitosis, migración celular. -contracción muscular -depolimerización de microtúbulos

5 Kinesinas Dineínas Miosinas ATPasa: liberación de Pi provoca cambio conformacional, que es amplificado por el brazo del motor molecular

6 Kinesinas: se dirigen al extremo + de MT (excepciones: KIFC entre otras). Dineínas: se dirigen al extremo de MT. Miosinas: se desplazan sobre microfilamentos (extremo + en gral.) Transporte intracelular de corta distancia: dispersión local. Existen centenares de KIFs, miosinas y subunidades de dineínas. No se conocen motores moleculares capaces de desplazarse sobre filamentos intermedios. Tal vez debido a la falta de polaridad de estas fibras.

7 Experimentos pioneros de transporte axonal: Transporte axonal rápido y lento

8 Velocidad promedio Rápido (vesículas): FAT (Fast Axonal Transport) 1-10 cm/día (~1-10 um/min) Lento (tubulina y filamentos intermedios): cm/día (~ um/min) Intermedio (mitocondrias)

9 Videos de transporte vesicular in vitro: (axoplasma de calamar y otros) - en tiempo real se observan pausas en el movimiento Velocidad instantánea >>> Velocidad macroscópica: ~ 5-50 um/min transporte axonal rápido (vesículas) (~1-10 um/min) - a lo largo de microtúbulos y sobre vías invisibles (posteriormente se confirmó que el movimiento continuaba sobre microfilamentos). - Frecuentemente bidireccional: una misma vesícula /carga-no-vesicular puede experimentar movimiento anterógrado y retrógrado intermitentemente.

10 FAT anterógrado y FAT retrógrado en axoplasma de calamar

11 Transporte de mitocondrias en axones de Drosophila

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13 -Procesividad: distancia máxima sin detenerse -Velocidad instantánea Kinesinas vs dineínas um / seg max:14 um / seg

14 Transporte de mrnas en dendritas Muy frecuentemente bidireccional

15 Cómo identificar/aislar proteínas motoras que funcionan sobre MT?

16 Cómo identificar/aislar proteínas motoras que funcionan sobre MT? LA PRIMER KINESINA (KINESINA CONVENCIONAL/ KINESINA 1/KIF5) Fue aislada como una MAP con actividad ATPásica (queda retenida en MT en presencia de AMPPNP)

17 Cabezas globulares con actividad ATPasa, se unen a los microtúbulos mientras que las colas se unen a componentes celulares. Kinesina I o kinesina convencional o KIF5 Este es el diseño básico para todos los motores moleculares: kinesinas, dineínas y miosinas.

18 Motores moleculares a escala humana

19 microscopía electrónica

20 ATP

21 ADP

22 ATP

23 KIF (N, C y M) Clasificación de Hirokawa, según el ordenamiento de distintos dominios. Caja Rosa: domino motor. Hay otras zonas conservadas

24 KIF 5: tetramérica Monoméricas?? Tetraméricas Triméricas??? Diméricas Genomas de 19 eucariotas: 486 KIFs Cada organismo/célula tiene distintos grupos de familias: Ej: familias 16 y 17 están presentes en org/células con cilias o flagelos Bill Wickstead and Keith Gull Mol. Biol. Cell 2006

25 Dineína: se desplaza al extremo. Complejo 1000kD, diversidad de DHC, DIC y DLC Citosol: Homodimeros (DHC1, DHC2, varias DLCs y DICs) Cilios y flagelos: Heterotrímeros y heterodímeros Dominio motor: 6(7) dominios AAA (ATPase Asociada a diversas Actividades celulares) en anillo. Unen ATP y ADP, no todos los AAA tinen actividad enzimática acoplada al movimiento

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27 El aparato de Golgi y el ER dependen de Dineina (DHC1) y kinesina 1/ KIF5, respectivamente

28 KIF motors Distintos cargos son transportados por distintas kinesinas, las cuales tienen velocidades microscópicas similares pero distinta procesividad y distintos tiempos de reposo, dando lugar a transportes macroscópicos de distinta velocidad (axonal lento vs. axonal rápido (FAT)). Hay mas de una molécula motora por cargo vesicular.

29 ENCUESTA: La kinesina se desplaza al extremo + de los MTs. Como regresa? A- desplazándose por MT de polaridad invertida B- es transportada retrógradamente por dineína C- no regresa: se degrada

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31 Melanosomas agregados dispersos

32 Adrenalina 5 min (bajo AMPc) Los melanosomas experimentan transporte anterógrado (kinesin) y retrógrado (dineína), según el estímulo. Los motores se encienden/ apagan en forma regulada. Cafeína 15 min (vía PKA) PKA induce dispersión.

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34 Functional Coordination of Microtubule and Actin Based Motility in Melanophores. V. I. Rodionov, A. J. Hope, T. M. Svitkina and G.G. Borisy Curr. Biol., 8(3): , 1998

35 DISPERSIÓN AGREGACIÓN MT MF Los melanosomas se desplazan por microtúbulos para recorrer grandes distancias y por microfilamentos para cortas distancias. Esto es válido para otros tipos de carga, en donde los MT fincionan como autopistas y los MF como calles laterales. Ej: transporte de vesículas sinápticas a lo largo MT axonales y de MF corticales en la sinapsis propiamente dicha (KIFs y miosina V, respectivamente)

36 MIOSINAS: Cabezas globulares de estructura similar al dominio motor de kinesinas - ATPasa - liberación de Pi provoca cambio conformacional amplificado Kinesinas vs dineínas vs miosinas um / seg max:14 um / seg um/seg

37 Miosina I

38 Miosinas: distintas funciones, procesividad y longitud del paso Myosin madness Mermall V, Post PL, Mooseker MS. Science (1998)

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40 Contracción Muscular MOTOR: miosina II Miosina II (no muscular)

41 Funciones de la miosina II no muscular: generar tensión entre microfilamentos antiparalelos o entre microfilamentos y membranas Movilidad celular (migración, cambios morfológicos) fibras de estrés (contractiles, antiparalelos)

42 Funciones de la miosina II no muscular Cambios morfológicos a nivel tejido

43 Miosina II durante mitosis Citokinesis: Anillos Contráctiles de F-actina Contraste de fase fluorescencia (myosin II)

44 -Cómo saben cuando arrancar y hacia donde dirigirse? -Cómo se coordinan los distintos motores (complejo kinesina-dineína-miosina) en una misma carga? -Cómo saben que carga transportar? (Cómo sabe el pasajero a qué transporte subirse?) En todos los casos, KIFs, Dyn y Myo, distintos dominios proteicos pueden unir distintas adaptadores o directamente las cargas. -Regulación de la unión al cargo? Frecuente control por fosforilación. Hay varios sitios de fosforilación en las distintas subunidades de KIFs, dineínas y miosinas.

45 Sirajuddin M, Rice LM, Vale RD. Regulation of microtubule motors by tubulin isotypes and posttranslational modifications. Nat Cell Biol. 2014

46 Modificacion post-traduccionales controlan transporte por Kin y Dyn

47 Dineina (1000 kd) Adaptador dinactina: une bicaudal y diversos proteínas de membrana adaptadoras p150/ Glued p50/ dinamitina

48 Bicaudal D: transporte de vesículas, de mitocondrias y de RNPs BICD1 Bicaudal D une dineína, dinactina y en forma mutuamente excluyente RAB6 (transporte vesicular) o Egalitarian (proteína adaptadora de RNPs). Bicaudal D también participa en el transporte mediado por kinesina kinesina mrna RBP (RNA Binding Protein) Bicaudal D dineína

49 DINEINA: Vía adaptadores (dinactina) directamente vía DLC

50 KINESINA 1. Adaptadores: Kinectinas (muchas varias). 2. Repeticiones Tetratricopeptide (34 aa) en KLC (JIP además de funcionar como adaptador kinesina-cargo, lleva moléculas implicadas en transducción de señales).

51 Miro y Milton en transporte de mitocondrias en axones

52 Herramientas experimentales : -Drogas: existen pocas anti-motores (son ATPasas), diversas anti-csk -Anticuerpos (algunos inhibitorios contra kinesinas específicas) -Dominantes negativas (motores o dominios de unión a cargo aislados), -Sobrexpresión de moléculas adaptadoras: ej p150/glue; p50/dinamitina) -RNAi Dineína p50 Cargo Sobreexpresión de p50/dinamitina p50 p50 p50 Dineína p50 p50 p50 p50 Cargo

53 La unión al cargo, la uniòn a MT y la actividad ATPasa son reguladas por fosforilación, involucrando diversas vías de señalización

54 MIOSINAS: distintos receptores

55 Se investiga actualmente: -función de distintas kinesinas, miosinas y dineínas (Redundantes? Muy específicas?) -reconocimiento cargo/motor -estructura, cambios conformacionales -coordinación entre motores (en algunos casos, KHC es requerida para el mov retrógrado mediado por dineína. DIC y KLC; MyoV y KHC interactúan) -regulación de la actividad motora por patógenos y en neurodegeneración