Introducción a la biología molecular

Transcripción

1 Curso: Bioseguridad y Biotecnología Moderna Introducción a la biología molecular Raul Blas Facultad de agronomia Dpto. Fitotecnia rblas@lamolina.edu.pe

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3 La tecnología es un proceso y un conjunto de conocimientos tanto como una colección de artefactos (Carlson, 2010) Biología es tecnología. La biología es la tecnología más antigua. A lo largo de la historia de la vida en la Tierra, los organismos han hecho uso de unos a otros en formas sofisticadas (Carlson, 2010).

4 Interacción entre organismos constituye una economía natural global que mueve los recursos naturales a escalas desde molecular a macroscópica Los seres humanos siempre han dependido explícitamente de esta economía biológica para proveerse de alimentos, oxigeno, y otros servicios. Hasta hace poco, nuestra economía industrial se basó principalmente en tecnologías no biológicas; la revolución industrial fue construida principalmente sobre el fuego, minerales y química. Ahora, nuestra economía parece estar cambiando rápidamente, y basados en la incorporación de nuevos organismos cuyos genomas han sido modificados a través de la aplicación del esfuerzo y el ingenio humano.

5 formas de uso de la biología como tecnología agricultura mejoramiento genético e.g. La biorremediación utilizado para limpiar los contaminantes (generados por otras tecnologías humana) a través de la selección de las plantas y los animales que se alimentan de materiales que se consideran en general como residuos o desperdicios.

6 1828: Friedrich Wohler, produjo cristales de Urea Nacio la quimica organica sintetica : Hermann Kolbe, sintetizó acido acético a partir de sus elementos inorgánicos

7 (MIT) Biología Sintética (BS) es el diseño y construcción de nuevas partes biológicas, dispositivos y sistemas. el rediseño de sistemas biológicos naturales, ya existentes, para aplicaciones útiles. BS se basa en trabajos recientes en la biología de sistemas que consiste en la modelación de sistemas biológicos, pero va más allá de la construcción y la estandarización de partes biológicas, que se unen para formar sistemas más complejos. BS se basa en el desarrollo de las matemáticas, computación, bioquímica, etc.

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9 La genética Molecular La molecularización de la genética en los años 1950 cambió el estudio de las herencias en general. Molecularización se refiere: a la caracterización de los procesos biológicos a la escala de las proteinas, y ácidos nucleicos (ARN, y ADN); en la identificación de las modalidades de bloqueo de los procesos biológicos elementales por las alteraciones de las macromoléculas. El desarrollo de cristalografía de rayos X, y resonancia magnética molecular, en las décadas antes de 1950 abrió la venta al mundo molecular.

10 Experimento de Frederick Griffith, 1928

11 El principio de la transformacion era DNA

12 Que es el DNA? Componentes fundamentales de los acidos nucleicos: Componente acido: Fosfatos Componente neutro: Azucares Componente basico: Bases nitrogenadas Adenina, Guanina, Citosina y Timina

13 Estructura del ADN Nucleotidos unidos por enlaces fosfodiester

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16 Cromosomas núcleo Célula DNA doble hebra Pares de bases Antiparalelismo de las dos hebras

17 Tamano de genomas y numero de genes en vegetales Espèce Taille physique de Génome (Mb) Nombre chromosomes (n) Nombre gènes Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Prunus persica (L.) Batsch Oryza sativa L. Eucalyptus grandis W. Hill ex- Maiden Brassica rapa L. Quercus robur L. Lycopersicon sculentum Mill. Solanum tuberosum L. Zea mays L. Lactuca sativa L. Pisum sativum L Hordeum vulgare L Triticum aestivum L Tulipa fosteriana L Moyenne ~ Source : INRA (2003) ; Borém et al. (2003) ; Delseny, et al. (2004) ; Gibson & Muse (2004), pb = paire de bases, 1Mb = 10 6 pb

18 Tipos de secuencias del genoma nuclear Tipo de secuencias Número de copias por genoma Que son? Secuencias únicas 1 copia o unos pocos Famila multigenica Genes que codifican proteinas Secuencias medianamen te repetidas 1000 a copias Genes que codifican para ARNr, ARNt, eventualmente de genes de protéinas Secuencias altamente repetidas a No son genes, Rol poco conocido

19 Genomas en los organismos genoma es el conjunto de todas las secuencias de DNA de un individuo o de una especie.

20 Que es un gen? Un gen es el conjunto de secuencias de DNA que incluye: Secuencias estructurales (intrones, exones) y Secuencias reguladoras, necesarias para codificar un producto genico, sea este un RNA maduro de cualquier tipo o una proteina funcional.

21 RNA Gen Proteina

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23 Transmisión de la información genética

24 Región reguladora Región estructural Secuencias reguladoras Exon1 Intron1 Exon2 Intron2 Exon3 Intron3 Exon4 Donde? Cuando? Que cantidad? Exon1 Intron1 Exon2 Intron2 Exon3 Transcripción Intron3 Pre-mRNA Exon4 Maduración de mrna Exon1 Exon2 Exon3 Exon4 AAAAA Traducción Proteína

25 Corte y empalme de exones

26 30% de genes

27 Código genético El codigo genetico es el conjunto de pautas que rigen la transferencia de la informacion contenida en el mrna (transcrito del DNA) para la sintesis de las proteinas Es la correlacion entre dos lenguajes informativos: la secuencia de nucleotidos en el mrna (el lenguaje con 4 letras de los acidos nucleicos) La secuencia de aminoacidos en el polipeptido (lenguaje con 20 letras de las proteinas) Concretamente, el codigo genetico establece la correspondencia entre los 64 posibles tripletes de bases del mrna y los 20 aa de las proteinas.

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29 Modelos de representacion Se han elaborado diversos modelos (tablas, esquemas, etc) para representar de forma clara y sencilla la correlacion existente entre codones del mrna y aa del polipeptido traducido En todos los modelos, la secuencia del triplete se refiere al codon del mrna Formato en tabla

30 Video mrna-aa

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32 Interaccion de los factores de transcripcion con la polimerasa La flexibilidad del DNA permite la aproximacion fisica de los tres tipos de secuencias promotoras a pesar de su lejania en la secuencia lineal de DNA. De esta forma los factores de transcripcion unidos a las regiones basal, proximales, y distales pueden contactar entre si y con la RNA polimerasa II, por lo que participan en forma conjunta en el control del inicio de la transcripcion.

33 Genes constitutivos; aquellos que se expresan de una forma constante, a la misma velocidad en todo momento de la vida celular (~ genes domesticos o caseros(housekeeping genes) Genes inducibles; estan reguladas en tiempo y espacio (~genes regulables o de expresion diferencial), los TFs que regulan estos genes no estan presentes en la celula de forma continua, sino que se sintetizan o se activan en momentos especificos o en tejidos particulares.

34 Herramientas básicas de biología Molecular Enzimas de restricción Ligación PCR Electroforesis Hibridación Southern Blot

35 Enzimes de restriccion Secuencias Palindromicas Sequence is symmetrical about the center point Point of cleavage 5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 Point of cleavage

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37 Restriction enzymes Corte de DNA con EcoRI

38 Mecanismos de Ligación ATP

39 Mecanismo de ligacion

40 Electroforesis

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45 Sonda (probe) es un fragmento de DNA de longitud variable (~ bases longitud) Es usado para detectar muestras de DNA o RNA (la presencia de secuencia de nucleotidos que son complementarios a la secuencia de la sonda) La sonda de hibridizacion es marcado radiactivamente (communmente con 32 P) o con marcdores inmunologicos como digoxigenin. La sonda marcada es denaturada (por calentamiento) en simples hebras de DNA y hibridizada al DNA objetivo (target DNA) (Southern blotting) or RNA (northern blotting) Se immobiliza sobre la membrana. Secuencias de DNA complementrias a la sonda son detectadas por la visualizacion de la sonda a traves de la autoradiografia.

46 Hibridación Sonda DNA CGCAGATCTAATATAT Sonda Marcada CGCAGATCTAATATAT Hibridacion CGCAGATCTAATATAT CCTTCCGGAATTAGCGTCTAGATTATATACCAGAATAGGCTA DNA Blanco

47 Gel despues de electroforesis Detectado con sondas hibridadas

48 Southern Blot Es el procedimiento por el cual se transfiere el DNA que ha sido digerido y corrido en un gel de agarosa (0,8%), hacia una matriz sólida tal como es una membrana de nylon. El total de DNA que se digerió se corre en un gel de agarosa (0,8%). El ADN se encuentra en forma de fragmentos de doble cadena que son muy cortos (100 pb) y otros muy grandes (15000 pb), por lo que el gel es sometido a determinadas soluciones para que los fragmentos puedan ser transferidos hacia la matriz sólida en forma de cadenas simples. (NaOH)

49 NaOH 0.4M

50 ans de processus de domestication et Genomica d agriculture Proteomica 4. Era omica Metabolomica Capacidad de analisis de genoma completo Sintesis de genes?

51 RNAi, snrna, mirna trna Transferencia Regulación/expresión génica DNA rrna Ribosomas Fenotipo mrna Proteína metabolitos Genoma Transcriptoma Proteoma Metaboloma

52 Informacion Biologica Genome mrnas 1 Proteome 1 Genome Genome mrnas 3 mrnas 2 Proteome 3 Proteome 2

53 Perspectivas-conclusiones

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55 Animales y plantas se convierten en objetivo (blanco) como biorreactores naturales para producir nuevos productos, los que nunca fueron creados por mutagenesis, cruzamientos o seleccion Esta nueva tecnologia facilita(rá) el desarrollo radical de nuevas terapias medicas,y sistemas de diagnostico.

56 Contribucion de la biotecnologia molecular: Proporciona la posibilidad de diagnostico mas fino de las enfermedades y prevencion o cura de un amplio rango de enfermedades infecciosas y geneticas. Incremento del rendimiento de los cultivos (resistencia a stres biotico y abiotico) Desarrollo de micro-organismos que producen quimicos, antibioticos, polimeros, aminoacidos, enzimas y varios aditivos de los alimentos. Desarrolla ganado y otros animales con determinada atributos geneticamente superiores. Facilita la remocion de los contaminantes y material basura del ambiente (bioremediacion)

57 Reacciones (-) de la sociedad sobre biotecnologia Dos aspectos de la biotecnologia pueden haber contribuido a la incertidumbre : La velocidad con que fueron adoptadas en algunos sectores economicos y llegada asombrosa en el mercado Inicio de la produccion Tiempo transcurrido para comercializacion (anos) Tecnologia Invencion Lapicero Television Transgenicos El periodo corto de tiempo probablemente no es suficiente para aprender y acostumbrarse a productos transgenicos

58 Evolucion en la Produccion de alimentos años de procesos de domesticacion y de agricultura 1 Tomate silvestre Tomate cultivada Capacidad de analisis de genomas 2 Hibridacion y seleccion 4. Genómica Sintesis de genes Ingenieria Genetica 3 OGM

59 Conclusiones Para la ingeniería de sistemas biológicos, necesitaremos aprender considerablemente mas sobre la forma como las piezas biológicas trabajan juntas. Desafíos surgirán que no son obvias de la observación de todos los sistemas funcionales, pre-existentes. Con el tiempo, vamos a comprender y abordar los desafíos, el uso de la biología va a cambiar drásticamente en el proceso.