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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 k Número de publicación: k Número de solicitud: k Int. Cl. 7 : A01H 4/00 A01H /00 k 12 SOLICITUD DE PATENTE A1 22 kfecha de presentación: k Solicitante/s: UNIVERSIDAD POLITECNICA DE MADRID c/ Ramiro de Maeztu, 7 - Vicerrectorado de Investigación k 43 Fecha de publicación de la solicitud: k 280 Madrid, ES 72 Inventor/es: Manzanera de la Vega, José Antonio k 43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud: k 74 Agente: No consta k 4 Título: Método de micropropagación del Alcornoque (Quercus Suber L.) mediante yemas. ES A1 k 7 Resumen: Método de micropropagación del alcornoque (Quercus suber L.) mediante yemas. El objeto de la invención es multiplicar clonalmente alcornoques a partir de yemas. El método consiste en el cultivo de yemas en condiciones asépticas, en medio suplementado con citoquinina y auxina. Los brotes multiplicados se pasan a tratamiento inductor del enraizamiento en medio suplementado con auxina. Una alternativa de método de inducción del enraizamiento consiste en la aplicación directa de una solución de auxina a la base del brote. Tanto en la primera alternativa como en la segunda, después se pasan a medio basal, que se puede rebajar de concentración. Dicho método se puede aplicar tanto a yemas procedentes de plantas juveniles como adultas, con el fin de obtener la producción de plantas. Este procedimiento resuelve los problemas de propagación clonal que tenía el alcornoque, recalcitrante a la propagación por estaquillado y otros métodos convencionales de propagación vegetativa. Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES A1 2 DESCRIPCION Método de micropropagación del Alcornoque (Quercus Suber L. mediante yemas. Sector de la técnica La presente invención se basa en una aplicación de la Biotecnología vegetal a la multiplicación del alcornoque (Quercus suber L.), para facilitar la producción de un gran número de plantas, utilizables en la repoblación forestal con esta especie. Estado de la técnica: Antecedentes El alcornoque es una especie vegetal que presenta enormes dificultades para la propagación clonal por procedimientos convencionales. En efecto, el estaquillado fracasa cuando se pretende realizar a partir de plantas de más de un año de edad, y los demás métodos (injerto, acodo) son demasiados laboriosos y limitantes para poder realizar una producción de plantas a gran escala, con rentabilidad económica. Por ello se ha buscado una alternativa en cultivo el in vitro, también llamado cultivo de tejidos o micropropagación. El cultivo in vitro del alcornoque se intenta por vez primera en los trabajos de Jaquiot (Jaquiot, C., 192. Sur les phénomènes d histogenése observés dans des cultures in vitro de tissu cambial de chênes (Quercus sessiflora Sm., Q. pdeunculata Ehrh., Q. suber L.). Comptes Rendus Acad. Sci. 234: ). El investigador francés cultivó tejido cambial. El resultado era la formación de un callo parenquimatoso, indiferenciado, después de un período inicial de formación de liber. No tuvo más transcendencia, y esta especie no volvería a ser estudiada hasta la década de los 80. Bellarosa (Bellarosa R., In vitro culture of Quercus suber L. embryos. Proc. Coll Int sur la Culture in vitro des Essences Forestières. IUFRO (AFOCEL, Ed.) Fontainebleau, France. Pp 119-1) empleó como material inicial embriones desprovistos de sus cotiledones, que estableció enme- dio de Durzan (Durzan D.J., Chafe S.C., Lopushanski, S.M Effects of environment changes on sugars, tannins, and organized growth in cell suspension cultures of White Spruce. Planta 113: ) modificado por ella misma. La dilución mineral y, sobre todo, el balance hormonal entre: 6-bencil adenina (BA) y ácido naftil-1- acético (ANA), influyeron en el alargamiento de la raíz, del meristemo apical, o de ambos. Otros intentos de repique de la parte caulinar en subcultivos no parecen haber dado buenos resultados generalizados. Realizadas las pertinentes búsquedas de patentes relacionadas con la presente, no se ha encontrado ninguna, ni en España ni en otros países. La presente invención expone una alternativa práctica de micropropagación a partir de yemas. Explicación o descripción de la invención y modo de realización El presente método consiste en la obtención de gran número de plantas de alcornoque, sin necesidad de recurrir a la reproducción sexual, sino a partir de la propagación clonal de yemas. Las ventajas que presenta este nuevo método permiten una producción de plantas con regularidad, a partir de árboles selectos, y que se puedan clonar genotipos de interés. Método por el cual se toman yemas de alcornoque, y se cultivan en condiciones asépticas, realizando una esterilización mediante un bailo de NaClO más una gotas de mojante, durante minutos en agitación, seguida de tres lavados con agua estéril, o bien con una solución de HgCl 2 más unas gotas de mojante, con agitación durante 2 minutos, seguida de dos lavados, el primero con una solución de CaCl 2 y el segundo de ácido ascórbico, ambos durante minutos. Una vez esterilizados los explantos, con ayuda de pinzas se coloca en un tubo de ensayo con a 1 ml de medio de cultivo, con sales minerales macronutrientes (SO 4 (NH 4 ) 2, NO 3 KoNO 3 Na, Cl 2 Ca.2H 2 O, SO 4 Mg.7H 2 O, KCl, y PO 4 H 2 Na.H 2 O opo 4 HNa 2 ). Como solución de micronutrientes se emplea la de Murashige y Skoog (Murashige T, Skoog, F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum 1: ), además se añade hierro quelado en forma de Fe-EDTA, adicionando SO 4 Fe.7H 2 O y Na 2 EDTA (etilendiamino tetraacetato de sodio). Los cofactores empleados son los siguientes: Acido ascórbico, Acido nicotínico, Pantotenato cálcico, Piridoxina, Tiamina y Glutamina. Como fuente de carbono se utiliza sacarosa y el ph del medio de cultivo se ajusta entre, y,7. La esterilización se realiza en autoclave entre 0, y 1 atmósferas (11 C a 1 C) durante minutos. Después del establecimiento, los cultivos se mantienen en una cámara bajo condiciones ambientales definidas de luz. La multiplicación de yemas se efectúa en medio suplementado con BA y ANA. Las yemas en cultivo se desarrollan, dando lugar a nuevos brotes, que a su vez se pueden volver a colocar en medio de cultivo fresco, para producir más yemas. De este modo, el proceso de multiplicación de yemas y brotes es cíclico. Para el enraizamiento de explantos regenerados in vitro se emplean los brotes, cuando alcanzan un tamaño de 2 a cm de longitud, a los que se aplica ácido 3-indolbutírico (AIB) en la base. Las plantas obtenidas se aclimatan a condiciones ambientales adecuadas en invernadero. Modo de realización Como material vegetal se utilizan plantas o cepas, a las que se les aplica BA 0 ppm en pulverización. Los brotes obtenidos se recolectan para su establecimiento en cultivo. Como otra fuente de material, se emplean estaquillas de alcornoques. Las estaquillas, de unos cm de longitud, se sumergen en una solución fungicida durante 24 horas. Para forzar la brotación de las estaquillas, se aplica una pulverización de BA 0 ppm. Preparación del material De los brotes se eliminan las hojas y se esterilizan mediante un baño de NaClO de 0,1 a 0, % más una gotas de mojante, durante minutos en agitación, seguida de tres lavados con agua estéril, o bien con una solución de HgCl 2 al 0,2 % más unas gotas de mojante, con agitación durante 2 minutos, seguida de dos lavados, el primero, con una solución de CaCl 2 (2,4 g/l), y el segundo de

3 3 ES A1 4 ácido ascórbico (1 g/l), ambos durante minutos. Una vez esterilizados los explantos, con ayuda de pinzas se coloca en un tubo de ensayo con a 1 ml de medio de cultivo, en condiciones asépticas. Medios de cultivo Los medios de cultivo son soluciones acuosas que contienen sales minerales de macroelementos y microelementos, y sustancias orgánicas necesarias para las plantas: sacarosa, como fuente de carbono, vitaminas, factores de crecimiento y agar como sustancia gelificante, para servir de soporte. Se emplea un medio de cultivo con la siguiente fórmula de sales minerales macronutrientes: SO 4 (NH 4 ) 2 NO 3 KoNO 3 Na Cl 2 Ca.2H 2 O SO 4 Mg.7H 2 O KCl PO 4 H 2 Na.H 2 O PO 4 HNa 2 (opcional) 0,13 a 0, g/l 0,7 a 1,00 g/l 0,12 a 0,1 g/l 0, a 0,31 g/l 0, a 0,9 g/l 0,09 a 0,1 g/l 0,03 g/l Como solución de micronutrientes se emplea la de Murashige y Skoog (1962): BO 3 H 3 SO 4 Mn.H 2 O SO 4 Zn.7H 2 O IK MoO 4 Na 2.2H 2 O SO 4 Cu.H 2 O Cl 2 Co.6H 2 O 6,0 mg/l 16,900 mg/l,90 mg/l 0,8 mg/l 0,0 mg/l 0,0 mg/l 0,0 mg/l Además se añade hierro quelado en forma de Fe-EDTA, adicionando 27,8 mg/l de SO 4 Fe.7H 2 O y 37,3 mg/l de Na 2 EDTA (etilendiamino tetraacetato de sodio). Las vitaminas empleadas son las siguientes: Acido ascórbico Acido nicotínico m-inositol Pantotenato cálcico Piridoxina Tiamina 2 mg/l 0 mg/l Como fuente de carbono se utiliza sacarosa ( g/l), y el medio se solidifica con agar (6 a g/l). Las fitohormonas empleadas son: 6-bencil ade nina (BA), ácido naftil-1-acético (ANA) y ácido 3-indolbutírico (AIB). El ph del medio de cultivo se ajusta entre, y,7. El medio de cultivo, una vez preparado, se dispensa en tubos de ensayo, en cantidades de a1ml,obienenfrascos,encantidadesde80a 0 ml. La esterilización se realiza en autoclave a 0, a1atmósferas (11 C a 1 C) durante minutos. Después del establecimiento, los cultivos se mantienen en una cámara bajo condiciones ambientales definidas de luz, a un fotoperíodo de 14 a 16 horas, y temperatura a C durante las horas iluminación, y a C durante las de oscuridad. La multiplicación de yemas se efectúa en medio suplementado con BA de 0,1 a y con ANA 0,01 a 0, mg/l. Las yemas en cultivo se desarrollan, dando lugar a nuevos brotes, que a su vez se pueden volver a colocar en medio de cultivo fresco, para producir más yemas. De este modo, el proceso de multiplicación de yemas y brotes es cíclico. Enraizamiento de explantos regenerados in vitro Se emplean brotes de 2 a cm de longitud, tanto de material originariamente juvenil como adulto, utilizados en la fase anterior, que se cultivan en medio suplementado con a 80 g/l sacarosayaibde1amg/l,durante7a14días. Una alternativa de método de inducción del enraizamiento consiste en la aplicación de una solución de 1 g/l de AIB estéril a la base del brote por inmersión durante segundos. Tantoenlaprimeraalternativacomoenla segunda, después se pasan a medio basal (sin reguladores de crecimiento), que se pude rebajar a concentraciones de hasta un 1/. Las plantas enraizadas se pueden transplantar a envases normales, y se aclimatan en invernadero. Aplicación industrial La técnica descrita se puede aplicar industrialmente mediante la organización de un laboratorio, donde se puedan efectuar las operaciones anteriormente descritas. Para ello requiere cámaras de flujo laminar, autoclaves, estufas de esterilización, y el instrumental de manipulación y envases de cultivo, etc. Dicho laboratorio debe tener anexo un invernadero con suficiente capacidad, para la aclimatación y acondicionamiento de las plantas producidas. Dicho invernadero debe tener un ambiente de control de humedad ambiental, y otro de endurecimiento. En ambos se debe disponer de un sistema de regulación de la temperatura, instalaciones de riego, etc. 6 3

4 ES A1 6 REIVINDICACIONES 1. Método de micropropagación del alcornoque caracterizado por el cultivo de yemas de alcornoque aplicando técnicas biotecnológicas de propagación clonal en condiciones asépticas en medio de cultivo suplementado con citoquinina. 2. Método según reivindicación 1 caracteri- zado porque los brotes multiplicados se pasan a tratamiento inductor del enraizamiento en medio de cultivo suplementado con sacarosa y auxina. 3. Método según reivindicación 1 caracterizado porque la inducción del enraizamiento consiste en la aplicación de una solución de auxina a la base del brote por inmersión

5 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA k 11 ES k 21 N. solicitud: k 22 Fecha de presentación de la solicitud: k 32 Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA k 1 Int. Cl. 7 : A01H 4/00, /00 DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría Documentos citados Reivindicaciones afectadas X MANZANERA, J.A. et al.: Micropropagation of juvenile and adult 1,3 Quercus suber L., 1990, Plant Cell Tissue and Organ Culture, Vol. 21, n 1, páginas 1-8, ISSN , todo el documento. X MANZANERA, J.A. Propagación vegetativa de plántulas de 1,3 alcornoque (Quercus suber L.) por cultivo in vitro, 1990, Investigación Agraria Producción y Protección Vegetales, Vol., n 3, páginas , ISSN , todo el documento. X ROMANO, A. et al.: Influence of growth regulators on shoot 1 proliferation in Quercus suber L., 1992, Annals of Botany (London), Vol. 70, n 6, páginas 31-36, ISSN , todo el documento. Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones n : Fecha de realización del informe Examinador Página A. Maquedano Herrero 1/1