Factores del medio de reacción que modifican las reacciones enzimáticas in vitro E + S ES E + P

Transcripción

1 Factores del medio de reacción que modifican las reacciones enzimáticas in vitro Reacción enzimática mono-substrato E + S ES E + P Para que se lleve a cabo la reacción enzimática debe existir una cierta interacción entre la enzima y el substrato para formar lo que se conoce como complejo Enzima-Substrato (ES). En este contexto, cualquier condición del medio de reacción que interfiera en la formación de dicho complejo afectará la reacción enzimática. La interacción del substrato con la enzima no se da con la totalidad de la molécula enzimática, sino con un reducido número de aminoácidos que conforman lo que se conoce como el sitio activo de la enzima. El sitio activo de una enzima puede estar conformado por restos de aminoácidos que ocupan posiciones muy distantes en la estructura primaria de la molécula y que se encuentran en un espacio pequeño debido a los plegamientos que adopta las cadenas proteicas.

2 Los factores del medio de reacción que modifiquen la estructura terciaria de la enzima provocarán una modificación del sitio activo y, por lo tanto afectará la reacción enzimática. En algunas condiciones no se modificará la forma tridimensional del sitio activo, pero se producirán cambios químicos en los aminoácidos del sitio activo o en el substrato que impedirán la formación del complejo ES.

3 Pka de grupos R de aminoácidos que más frecuentemente forman parte del sitio activo de las enzimas Histidina Pka= 6.0 Glutamato Pka=4.3 Aspartato Pka=3.9 Arginina Pka=12.5 Lisina Pka=10.5 Tirosina Pka=10.1 Cisteína Pka=8.3 α-nh 3 + Pka=7.5 a 8.0 α- COO - Pka=3.0 a 3.2

4 Efecto del ph sobre las reacciones enzimáticas El ph del medio de reacción puede actuar ionizando la enzima o ionizando el substrato. La siguiente figura ilustra el caso de una enzima monoprotica la cual puede tener tres estados de ionización (E +, E 0, E - ) pero que solamente puede formar el producto a través de su estado no ionizado E 0. En este caso cualquier ph que disminuya la concentración de la forma no ionizada de la enzima (E 0 ), afectará la reacción enzimática. EFECTO CUANDO LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA DEPENDE DEL ph E + + S αk s E + S K e1 H + H + K es1 H + H + E 0 + S K e2 H + H + H + K s K p E 0 S E 0 + P K es2 H + E - + S βk s E - S

5 EFECTO DEL ph CUANDO EL SUSTRATO ES ÁCIDO-BÁSICO La siguiente figura ilustra el caso de un substrato monoprótico el cual puede tener tres estados de ionización (S +, S 0, S - ) pero que solamente puede formar el producto a través de su estado aniónico S -. E + S + αk s E S + K s1 K es1 H + H + H + E + S 0 K s E S 0 K s2 H + H + H + H + K es2 E + S - βk s ES - K p E + P

6 EFECTO DEL ph CUANDO LOS HIDROGENIONES O LOS HIDROXILOS FORMAN PARTE DE LA REACCIÓN: Cuando los hidrogeniones forman parte de la reacción, como en el siguiente caso, las altas concentraciones de hidrogeniones desplazan la reacción hacia la izquierda. AH 2 + B A + BH + H + AH 2 + NAD + A + NADH + H +

7 EFECTO SOBRE LA ESTABILIDAD DE LA ENZIMA C O O H 3 N - O C NH 3 + O ph La línea negra representa los datos obtenidos cuando la enzima se incuba a un determinado valor de ph y a ese mismo valor de ph se evalúa su actividad enzimática. La línea roja representa la actividad enzimática cuando la enzima se incuba a un determinado valor de ph y enseguida se lleva a su ph óptimo y se evalúa su actividad.

8 Ejemplos del efecto del ph sobre la actividad de las enzimas Tripsina Colinesterasa ph ph Pepsina Papaína ph ph

9 A C T I V I D Pepsina Ureasa Arginasa Papaina A D p H

10 EFECTO DE LA ACTIVIDAD ACUOSA Enzimas hidrolíticas A valores altos de a w, las reacciones hidrolíticas se ven favorecidas hacia la derecha. H R O H H O ǀ ǀ ǁ ǀ ǀ ǁ... N C C N C C... ǀ ǀ H R H 2 O H R O ǀ ǀ ǁ... N C C OH + ǀ H H H O ǀ ǀ ǁ... H N C C... ǀ R Varias hidrolasas de interés alimentario (lipasas, proteasas, amilasas) han mostrado su capacidad para catalizar las reacciones inversas en condiciones de baja actividad acuosa. El cambio en la actividad enzimática con la actividad acuosa se ve acompañada por cambios en la energía de activación, por ejemplo, se han obtenido los siguientes datos experimentales: a w (0.58) E a (15.7 kcal/mol) a w (0.90) E a (4.8 kcal/mol)

11 EFECTO DE LA TEMPERATURA Teoría de las colisiones A 2 + B 2 2AB Se desarrolló con base en la teoría cinético molecular de los gases. Establece que para que las substancias reaccionen deben chocar o colisionar. La velocidad de la reacción depende de la frecuencia de las colisiones (Z, número de colisiones por segundo) entre A 2 y B 2 Es fácil deducir que V Z y que el número de colisiones depende de las concentraciones de A 2 y B 2 ᴕ Z [A 2 ] [B 2 ] ᴕ Si establecemos una constante de proporcionalidad Zo como la frecuencia de colisiones cuando [A 2 ] = [B 2 ] = 1, entonces: Z = Zo [A 2 ] [B 2 ] Como V ᴕ Z V = Zo [A 2 ] [B 2 ]

12 Para que se rompan los enlaces A A y B B y se formen los enlaces A B, las moléculas en colisión deben tener una cantidad mínima de energía llamada ENERGÍA DE ACTIVACIÓN (Ea). A B A B A B A B Maxwell y Boltzman encontraron que la cantidad de moléculas que tienen un nivel energético por lo menos igual a la Ea es igual a: e -(Ea/RT) Esto nos lleva a la ecuación de Arrhenius: V e -(Ea/RT) ᴕ V = A e-(ea/rt) Donde: A: Cte. de Arrhenius R: Cte. universal de los gases Ea: Energía de activación T: Temperatura absoluta

13 ln V V = A e -(Ea/RT) Sacando el ln a la ecuación de Arrhenius obtenemos: lnv = lna - (Ea/R) (1/T) La ecuación anterior representa la ecuación de la línea recta, siendo Y = ln V y X = (1/T) a) b) V 1/T T La figura a representa la gráfica de la ecuación de Arrhenius, mientras que la figura b representa la graficación directa de T vs V

14 La temperatura óptima de acción de una enzima es el resultado de: El efecto de la temperatura sobre la cinética molecular. El efecto de la temperatura sobre la desnaturalización de las enzimas. T Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática T Línea roja: Efecto de la temperatura sobre la desnaturalización de la enzima. Línea amarilla: Comportamiento de la reacción según la ley de Arrhenius La suma de ambas refleja lo observado experimentalmente

15 Coeficiente Q 10 Una forma más sencilla de estudiar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas es el coeficiente Q 10, el cual representa el cociente de dos velocidades de reacción a dos diferentes temperaturas, con una diferencia de 10 C Q 10 = V de reacción a (T + 10 C) V de reacción a T Un valor de Q 10 = 2 indica que la velocidad de la reacción enzimática se duplica cada vez que se incrementa la temperatura en 10 C, dentro de valores de temperatura inferiores a la temperatura de desnaturalización de la enzima. Los valores de Q 10 de la mayoría de las enzimas se encuentra entre 2 y 4

16 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA Substrato Enzima Producto Complejo Enzima-Substrato En la figura anterior se muestra que la cantidad de producto formado sigue una relación directa con la cantidad de enzima presente en el medio de reacción, cuando el medio se encuentra saturado de substrato.

17 Si se grafica la concentración de enzima Vs la velocidad de la reacción enzimática se obtiene una gráfica como la siguiente: V [E] La modificación de otros factores como ph, temperatura y conc. del substrato modificarán la relación entre la conc. de la enzima y la velocidad de la reacción.

18 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUBSTRATO V Vmáx. ½ Vmáx. [S] La velocidad de una reacción enzimática se incrementa conforme se incrementa la concentración del substrato, hasta llegar a un punto en el cual la velocidad ya no aumenta aun cuando se incremente la conc. del substrato, debido a que se ha llegado al punto de saturación de la enzima. A dicha velocidad de le conoce como Velocidad Máxima, Vmáx

19 EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA La fuerza iónica de un sistema alimentario se puede incrementar mediante la adición de electrolitos o como resultado de la congelación o la deshidratación. Los iones pueden tener efecto específico o no específico sobre las enzimas La fuerza iónica modifica la solubilidad de las enzimas y de los substratos a través de los fenómenos de salting-in o de salting-out, modificando la interacción enzimasubstrato. La fuerza iónica de una solución se puede calcular con la siguiente ecuación: I = ½ [C i Z i ] donde C i : Concentración del componente i Z i : Carga del componente i Los iones liótrofos, principalmente cationes, preservan las interacciones agua-soluto y la polaridad del agua, aumentando la estabilidad de las proteínas hidrosolubles Los iones caótrofos, principalmente aniones, interrumpen las interacciones agua-soluto y reducen la polaridad del agua, afectando la estabilidad de las proteínas hidrosolubles.

20 Los iones se ordenan por su poder liótrofo o caótrofo de acuerdo con la llamada serie de Hofmeister SCN - >I - >ClO 4 - >NO3 - >Br - >Cl - >CH3 COO - >F - >SO 4 2- >NH4 + >K + >Na + >Li + >Mg 2+ >Ca 2+ Los metales pesados como Pb 2+, Hg 2 2+ y Cd 2+ pueden inactivar a las enzimas debido a su capacidad de reaccionar con los grupos sulfhidrilo de los residuos de cisteína. Otros iones metálicos como Mg 2+, Ca 2+ y Zn 2+, entre otros, tienen efectos específicos al actuar como cofactores o co-substratos de algunas reacciones enzimáticas.