PRODUCCIÓN DE ENZIMAS FIBROLÍTICAS DE

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1 PRODUCCIÓN DE ENZIMAS FIBROLÍTICAS DE Phanerochaete chrysosporium y Fomes sp. CULTIVADOS EN RASTROJO DE MAÍZ Carrillo-Díaz M.I. 1, Alonso-Meneses T.L. 2, Miranda-Romero L.A. 3 1* Posgrado en Producción Animal, Universidad Autónoma Chapingo. 2 Ingeniería en Biotecnología, Universidad Tecnológica de Tecamac. 3 Posgrado en Producción Animal, Universidad Autónoma Chapingo. Isabel_2224@live.com.mx Resumen La lignocelulosa (celulosa, hemicelulosa y lignina) es el principal componente de la pared celular de las plantas, representa una fuente de carbono con potencial para solucionar los problemas de energía actuales. Dentro de los diversos métodos que mejoran la hidrólisis de la celulosa se encuentran los hongos ligninolíticos, puesto que degradan el material lignocelulósico a través de la producción de enzimas extracelulares. El objetivo de este trabajo fue evaluar la producción de celulasas y xilanasas de los hongos Phanerochaete chrysosporium y Fomes sp. cultivados por fermentación en estado sólido en rastrojo de maíz con y si mazorca, con 20% de salvado de trigo como aditivo. El extracto crudo enzimático (ECE) se analizó para medir la actividad enzimática de celulasas y xilanasas con el reactivo DNS. Los dos hongos y los dos sustratos se evaluaron en un diseño completamente al azar 2x2 con arreglo factorial con una comparación de medias con la prueba de Tukey con el programa estadístico SAS 9.0. La mayor producción de celulasas y xilanasas se obtuvo con Phanerochaete chrysosporium. En el caso de de celulasas, el mejor sustrato fue el rastrojo de maíz sin mazorca, presentando el mayor pico de producción en el día 12. Phanerochaete chrysosporium es un hongo con un alto potencial para degradación de materiales fibrosos. Los sustratos con alto contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina favorecen la producción de enzimas fúngicas que hidrolizan estos materiales. Palabras Clave: Celulasas, Xilanasas, Hongos ligninolíticos. 30

2 Introducción Los residuos, desperdicios, desechos agrícolas y de la industria de alimentos constituyen una proporción importante, ya que llegan a alcanzar más del 30% del total de la productividad agrícola mundial (Ugwuanyi et al., 2009); estos materiales representan un gran potencial para solucionar los problemas de nutrición animal si se implementan tecnologías adecuadas para el uso apropiado de dichos desechos. En la actualidad existen productos comerciales obtenidos a partir de hongos que son utilizados ampliamente para mejorar la digestibilidad de forrajes o granos (Beauchemin et al., 2004). Entre los aditivos para aumentar la digestibilidad de los alimentos lignocelulósicos, las enzimas exógenas fibrolíticas, al agregarse a estos materiales, pueden mejorar la utilización de los polisacáridos de los forrajes (Pinos-Rodríguez et al., 2002). Los hongos de pudrición blanca han sido ampliamente estudiados, ya que son capaces de producir enzimas hidrolíticas, como las celulasas, xilanasas y lacasas; las cuales han sido probadas para su aplicación en la industria textil, del papel y en la producción de alimentos y biocombustibles (Rodrigues et al., 2008). Se han utilizado diversas cepas de hongos como Trichoderma reesei, Phanerochaete chrysosporium, Aspergillus humicola, Trametes versicolor, Bjerkandera adusta, Pleurotus ostreatus y Fomes fomentarius (Pérez et al., 2002; Rodrigues et al., 2008; Ovando y Waliszewski, 2005) para la obtención de extractos enzimáticos en la degradación de materiales fibrosos. En diversas investigaciones realizadas con tratamientos enzimáticos sobre la degradación de los materiales fibrosos, se ha observado un comportamiento favorable, ya que se incrementa la digestibilidad de manera considerable (Colombatto et al., 2007). El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad enzimática producida por los hongos Phanerochaete chrysosporium y Fomes sp. cultivados en rastrojo de maíz con y sin mazorca. Material y Métodos Para el cultivo del hongo se utilizó caldo papa dextrosa (24 g L -1 ) y agar bacteriológico (15 g L -1 ), en cajas Petri en las cuales se resembró el hongo para su crecimiento. Las cajas Petri con el hongo se dejaron incubando a 35 C por 10 días. Para la medición de la actividad enzimática de celulasas y xilanasas, se obtuvo un cultivo por fermentación en estado sólido utilizando como sustrato rastrojo de maíz con y sin mazorca, con 20% de salvado de trigo. La humedad de estos materiales fue ajustada al 80%. Los cultivos se prepararon en cajas Petri de vidrio conteniendo 14 g de sustrato. Estos materiales se esterilizaron a 121 C por 40 minutos. A cada caja Petri se le añadieron 4 discos (10 mm de diámetro) de micelio de cada hongo crecido en PDA y se incubaron a 35 C hasta su lectura. Las lecturas enzimáticas se realizaron a los 0, 3, 6, 9, 12 y 15 días de incubación. Para obtener el extracto enzimático, se traspasó el cultivo en estado sólido a matraces Erlenmeyer de 250 ml y se añadieron 70 ml de agua 31

3 destilada a cada matraz, posteriormente se colocaron en un baño de hielo sobre una agitadora orbital y se agitaron a 120 rpm por 30 minutos. El líquido fue centrifugado a 7,000 rpm en tubos cónicos de 15 ml. Posteriormente se tomaron 2 ml para colocarlos en una centrífuga refrigerada a 4 C a 10,000 rpm por 15 minutos. El sobrenadante obtenido se utilizó para la medición de actividad enzimática, denominado extracto crudo enzimático (ECE). Para la medición de celulasas y xilanasas se utilizó el método descrito por Miller et al., (1960). Para celulasas se utilizó como sustrato una solución de carboximetilcelulosa (Sigma-Aldrich) al 1%, disuelta en amortiguador de citrato de sodio (50 mm, ph 5.0). Para xilanasas, se utilizó como sustrato una solución de xilano de madera (Sigma-Aldrich) al 0.5%, el cual fue disuelto en amortiguador de citrato de sodio (50 mm, ph 5.3). Para ambas enzimas, se midió la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm en un espectrofotómetro LAMBDA 35 PerkinElmer a 595 nm. El diseño experimental fue un completamente al azar con arreglo factorial 2x2x6 Se realizó un análisis de varianza para comparar la actividad enzimática de los sustratos, utilizando la prueba de Tukey con el procedimiento GLM para realizar la comparación de medias, con el paquete estadístico SAS 9. Resultados y Discusión Para la producción de celulasas, hubo diferencias significativas respecto al hongo utilizado (p<0.01) ya que Phanerochaete chrysosporium obtuvo los valores más altos. Además se observó que el sustrato sin mazorca de maíz tuvo la mejor respuesta para la producción de esta enzima (p<0.01). El mejor día para producción de enzima fue el día 12 (p<0.01) como se observa en la figura 1. Respecto a xilanasas, también hubo diferencia para los hongos estudiados (p<0.05), ya que Phanerochaete chrysosporium obtuvo los valores más altos. Para esta enzima no se presentaron diferencias entre los sustratos utilizados. 32

4 Figura 1. Producción de celulasas de Phanerochaete chrysosporium y Fomes sp. Cultivados en rastrojo de maíz.. Figura 2. Producción de xilanasas de Phanerochaete chrysosporium y Fomes sp. Cultivados en rastrojo de maíz. 33

5 Los resultados de producción de celulasas y xilanasas concuerdan con otros autores, ya que P. chrysosporium es uno de los más eficientes en degradar lignina de la madera, además de liberar varios tipos de celulasas (Pérez et al., 2002), lo cual puede permitir que haya una mayor hidrólisis del complejo lignocelulósico de los materiales fibrosos. Estudios similares realizados con este hongo cultivado en rastrojo de maíz por fermentación en estado sólido, indican que la mayor hidrólisis de este material fibroso se obtuvo en el día 9 (Zhang et al., 2012). Probablemente esta diferencia se deba a una mayor cantidad de sustrato utilizada en el presente estudio. Conclusiones El hongo Phanerochaete chrysosporium puede ser utilizado para la producción de enzimas que favorecen la degradación de los materiales lignocelulósicos. El rastrojo de maíz sin mazorca promueve una producción de celulasas por los hongos ligninolíticos. Literatura citada Beauchemin, K.A., D. Colombatto and D.P. Morgavi., A rationale for the development of feed enzyme products for ruminants. Canadian Journal of Animal Science 84(1): Colombatto, D., F. L Mould., M. K. Bhat and E. Owen Influence of exogenous fibrolytic enzyme level and incubation ph on the in vitro ruminal fermentation of alfalfa stems. Anim. Feed Sci. and Tech. (137): Pérez J., J. Muñoz-Dorado, T. de la Rubia y J. Martínez Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview. Int. Microbiol. (5): Pinos-Rodríguez, J. M., S. S. González, G. D. Mendoza, R. Bárcena, M. A. Cobos, A. Hernández y M. E. Ortega Effect of exogenous fibrolytic enzyme on ruminal fermentation and digestibility of alfalfa and rye-grass hay fed to lambs. Journal of Animal Science. (80): Miller, G. L., R. Blum, Glennon, W. E., Burton, A. L Measurement of carboxymethylcellulase activity. Analytical Biochemistry. (2): Ovando C.S.L. y K.N. Waliszewski preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos. Universidad y ciencia, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. (21):42; Pinos-Rodríguez J. M., S. González., G. Mendoza., J. C. García., L. Miranda., G. A. De La Cruz., y V. De Lerma Efecto de enzimas fibrolíticas exógenas en la degradación in vitro de ingredientes alimenticios, y en la producción de leche de vacas holstein. Interciencia (30):12. 34

6 Rodrigues M.A.M., P. Pinto, R.M.F. Bezerra, A.A. Dias, C.V.M. Guedes, V.M.G. Cardoso, J.W. Cone, L.M.M. Ferreira, J. Colaco y C.A. Sequeira Effect of enzyme extracts isolated from whiterot fungi on chemical composition and in vitro digestibility of wheat straw. Animal Feed Science and Technology (141): Ugwuanyi, J. O., B. McNeil,. and L. M. Harvey Chapter 5 Production of Protein-Enriched Feed Using Agro-Industrial Residues as Substrates Biotechnology for Agro-Industrial Residues Utilization, Part II, Zhang J., X. Ren, W. Chen y J. Bao Biological pretreatment of corn stover by solid state fermentation of Phanerochaete chysosporium. Front. Chem. Sci. Eng. 6(2):