REPORTE DE FICHA MÍNIMA
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- Benito García Naranjo
- hace 8 años
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1 REPORTE DE FICHA MÍNIMA CONVOCATORIA Y MODALIDAD PROGRAMA NACIONAL DE SEMILLEROS DE INVESTIGACIÓN, CREACIÓN E INNOVACIÓN DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA Modalidad 1: Proyectos para la introducción en la investigación, creación o innovación ANEXO I INFORMACIÓN GENERAL DEL PROYECTO Código del proyecto Título Resumen Caracterización de la muerte celular inmunogénica (MCI) inducida por quimioradioterapia en células tumorales ANTECEDENTES: El cáncer de mama es una enfermedad de gran impacto a nivel mundial que ha aumentado su prevalencia en los últimos años, sobre todo en mujeres mayores de 50 años. En Colombia el cáncer de mama es la causa de un importante número de muertes y además un alto porcentaje del total de pacientes con cáncer en nuestro país (10.6% al año 2010). La mayoría de los pacientes con cáncer son tratados con quimio-radioterapia en alguna etapa de su enfermedad. Aunque la quimio-radioterapia pueden inducir linfopenia transitoria y otros cambios sistémicos, agentes como la Doxorrubicina (una antraciclina) y la radioterapia inducen muerte celular inmunogénica (MCI) que favorecen la infiltración del tumor por Linfocitos T-CD8+ (LT-CD8+) anti-tumorales. La eficacia de la infiltración por LT-CD8+ anti-tumorales en la erradicación de los tumores inducida por regímenes de quimio-radioterapia frecuentemente utilizados en pacientes con cáncer ha sido evidenciada ampliamente en modelos tumorales murinos y comienza a ser sustentada por datos clínicos en pacientes. La MCI es un tipo de apoptosis que genera inflamación y la eficiente activación del sistema inmune. Gran parte de las bases moleculares de la MCI han sido delineadas por numerosos estudios de los grupos de Zitvogel y Kroemer. Colectivamente, estos estudios indican que la MCI se caracteriza por: (i) la exposición pericelular de calreticulina (CRT, una chaperona intracelular), la cual favorece la fagocitosis de estas células tumorales en MCI por células dendríticas (DCs) - células presentadoras del antígeno profesionales -, (ii) la liberación de ATP y (iii) la liberación de la nucleoproteína HMGB1 por el tumor que inducen la eficiente activación de DC mediante la unión de HMBG-1 al receptor TLR-4 y del ATP al receptor P2RX7. Una vez activadas las DCs migran a ganglios linfáticos llevando restos del tumor que son presentados a LT-CD8+ antitumorales lo que conlleva a un aumento de la infiltración del tumor por estos linfocitos aproximadamente 7 días después de haber sido administrada la terapia. Por todo lo anterior se considera hoy en día que la disminución del 15/09/ :30 Proyecto: Pág. 1 de 8
2 Investigador principal Documento de identificación Correo electrónico Teléfono Dirección de correspondencia número de células tumorales observado con la quimio-radioterapia además de su efecto cito patico directo se debe en buena medida la eficiente activación del sistema inmune por estos tratamientos RACIONAL: El uso de líneas tumorales como fuente de antígeno es una importante alternativa para la inmunoterapia del cancer. Nosotros consideramos que líneas celulares en las que se logre inducir MCI podrían ser útiles como vacuna contra ciertos tipos de cáncer. Por lo anterior en este trabajo utilizaremos una línea tumoral de cáncer de mama que expresa altos niveles del oncogén HER -2/neu (una proteína cuya expresión por tumores de mama es de mal pronóstico), la cual será sometida a distintos tratamientos de quimio-radioterapia in vitro con el fin de lograr MCI. METODLOGIA: La línea tumoral CRL2338 (HER-2/neu+++) será cultivada con diferentes dosis de agentes quimio-terapéuticos (Antraciclinas y Taxanos) y de radiación ionizante (gama, UV) por diferentes tiempos, luego de lo cual la MCI será determinada midiendo mediante citometría de flujo la exposición de fosfatidil serina (Anexina V+ = apoptosis); permeabilidad de membrana Ioduro de Propidio+ = necrosis); CRT en la membrana y translocación al citoplasma de HMGB1 y por ELISA la liberación de ATP. CARLOS ALBERTO PARRA LOPEZ caparral@unal.edu.co INVESTIGADORES Nombres y apellidos Dedicación (horas semana) Tipo PARRA LOPEZ CARLOS ALBERTO CASTRO RIAÑO PABLO ANDRES PEREZ FONSECA SILVIA VIVIANA BERNAL ESTEVEZ DAVID ANDRES PRIETO TORRES ANDRES EDUARDO caparral@unal.edu. co pacastror 5 Estudiante de Pregrado svperezf 5 Estudiante de Pregrado Unidad 2 Director Departamento de Microbiologia Medicina Bogota Facultad de Medicina Bogotá Facultad de Medicina Bogotá dabernale 5 Facultad de Medicina Bogotá aeprietot 5 Estudiante de Pregrado Facultad de Medicina Bogotá 15/09/ :30 Proyecto: Pág. 2 de 8
3 Objetivo general OBJETIVOS Y RESULTADOS Evaluar el grado de inducción de la muerte celular inmunogénica en respuesta a la quimio-radioterapia en una línea celular de cáncer de mama. Objetivos específicos 1. Caracterizar el tipo de muerte celular (apoptosis vs Necrosis) en células tumorales luego de la exposición a agentes de quimio-radioterapia. 2. Comparar el grado de liberación de ATP y traslación de HMGB1 del núcleo al citoplasma en células tratadas con los diferentes agentes. Resultados esperados Incentivar entre los estudiantes vinculados la difusión de los resultados en eventos científicos. Establecer protocolo de inducción y detección de MCI en células tumorales tratadas con agentes de quimioradioterapia frecuentemente utilizados en quimio-radioterapia del cáncer de mama. Capacitar estudiantes de pre-grado en análisis de literatura científica en el tema y el trabajo en el laboratorio de investigaciones Formación de estudiantes de pre-grado en el estudio de muerte celular inmunogénica (MCI) Seleccionar entre los agentes utilizados el inductor óptimo de MCI en la línea tumoral CRL2338 (HER-2/neu+++) Introducción a los estudiantes participantes en conceptos de medicina traslacional: vacunas terapéuticas contra el cáncer PRODUCTOS ESPERADOS NÚMERO PRODUCTO CANTIDAD 1 Artículos sometidos a revisión en revista indexada. 1 CLASIFICACIÓN Y DURACIÓN DEL PROYECTO Área de la ciencia principal Ciencias Médicas Área de la ciencia secundaria Ciencias Médicas Objetivo socioeconómico Salud Meses 6 15/09/ :30 Proyecto: Pág. 3 de 8
4 PALABRAS CLAVE Palabras clave APOPTOSIS CÁNCER DE MAMA MUERTE CELULAR INMUNOGÉNICA QUIMIO-REDIOTERAPIA HMGB1, ATP, CALRETICULINA VACUNAS TERAPÉUTICAS EN CÁNCER INFORMACIÓN ESPECÍFICA DEL PROYECTO Planteamiento del problema - Marco teórico / Estado del arte El cáncer de mama a pesar de ser una patología predominantemente femenina, es la tercera causa de muerte por cáncer en nuestro país. A nivel mundial se perfila como la primera causa de incidencia de cáncer en mujeres, estimada en más de un millón de casos/año con incremento reciente en mujeres jóvenes y sin factores de riesgo. A pesar de los esfuerzos y adelantos en detección temprana y de contar con una amplia gama de opciones terapéuticas, este tumor continúa diagnosticándose tardíamente lo que empeora su pronóstico. El 30% de los casos son considerados de mal pronóstico por sobre expresar HER2/neu y ser receptores hormonales negativos; aunque en ellos Trastuzumab ofrece una alternativa terapéutica, un alto porcentaje de pacientes tratadas recaen y algunas veces su uso está limitado por cardiotoxicidad y alto costo. Las vacunas terapéuticas contra el cáncer de mama basadas en antígenos asociados a tumor (TAAs) se perfilan como una nueva oportunidad de tratamiento para pacientes con cáncer de mama de mal pronóstico, sin embargo su implementación demanda conocer la expresión de TAAs en los tumores de pacientes en nuestro medio. Una alternativa que está siendo explorada recientemente a nivel mundial es la posibilidad de emplear líneas tumorales como fuente de antígenos para ser usados como vacunas terapéuticas en estos pacientes. Las células tumorales totales pueden servir como excelentes vacunas multivalentes con su fuente rica de antígenos tumorales que activan simultáneamente LT-CD8+ y LT-CD4+. El método de preparación de las células tumorales para la vacunación es crítico, ya que métodos específicos podrían aumentar la inmunogenicidad de las células tumorales. Actualmente con el uso de lisado total de las células se han obtenido repuestas leves en pacientes con melanoma. Una posibilidad para incrementar la respuesta clínica de pacientes tratados con estas vacunas es generar una MCI en las células tumorales las cuales promueven la generación de inflamación para utilizarlas como vacunas. La eficacia de células que mueren por MCI para generar inmunidad contra los tumores parte del principio de la teoría de peligro inmunológico la cual señala la necesidad de un estímulo pro-inflamatorio para la generación de inmunidad. No obstante se ha considerado que la apoptosis no genera inflamación existen múltiples evidencias que muestran como ciertos regímenes de quimio-radioterapia inducen en células tumorales una apoptosis pro-inflamatoria conocida como MCI lo cual abre la posibilidad de emplear estos regímenes en las células tumorales para generar inmunogenicidad al momento de emplearlas como vacunas terapéuticas. Es posible inducir una MCI in vitro en líneas tumorales con el fin de convertirlas en candidatas a vacuna para la inmunoterapia del cáncer? Si bien hoy en día hay descritos una serie de parámetros celulares y moleculares identificados en modelos de cáncer en animales como útiles para evidenciar una MCI, su utilidad para el diseño de vacunas para uso en humanos aún no ha sido demostrada. Basados en que agentes utilizados en algunos regímenes de quimio-radioterapia ampliamente 15/09/ :30 Proyecto: Pág. 4 de 8
5 Planteamiento del problema - Marco teórico / Estado del arte empleados para el tratamiento de pacientes con cáncer inducen MCI, en este trabajo haciendo uso de una línea tumoral de cáncer de mama que expresa altos niveles de HER2/neu evaluaremos la capacidad de algunos de estos agentes para generar MCI in vitro. Resultados favorables de esta investigación posibilitarían estudios futuros con el fin de establecer la utilidad de esta línea celular a la cual se le induce in vitro MCI como inmunógeno para la inmunoterapia de pacientes con cáncer de mama. Aportes para el proceso de la investigación En el grupo de Investigación en Inmunología y Medicina Traslacional de la Facultad de Medicina, el Dr. Carlos Parra López (Líder del grupo) ha venido trabajando en el concepto de medicina traslacional en cáncer y en enfermedades infecciosas. Dentro de las actividades del grupo está la de fomentar en estudiantes de pre y posgrado conceptos fundamentales de inmunología bajo la participación en programas de investigación y dirección de tesis de maestría y doctorado. El líder del grupo considera que con la vinculación de estudiantes de pregrado al presente proyecto, los estudiantes se beneficiarán con la metodología que se maneja al interior del grupo para el apoyo de estudiantes de pre - y posgrado la cual se basa en los siguientes principios: 1. Contribuir dentro de la Universidad Nacional a la formación de nuevos investigadores y patrocinar el desarrollo de proyectos de Tesis de estudiantes de pre- y pos-grado. 2. Identificación de problemas y definición de preguntas de investigación de interés para las líneas de investigación del grupo. 3. Promoción entre los miembros del grupo de la articulación de propuestas de investigación con el fin de la consolidar un Banco de Proyectos. 4. Participación de manera permanente en convocatorias nacionales e internacionales con proyectos de investigación altamente competitivos. 5. Búsqueda permanente de Incentivos que permitan la vinculación de jóvenes investigadores, estudiantes de maestría y Doctorado a los proyectos de investigación del grupo. 6. Creación de redes de información y programas de intercambio en la modalidad de cursos y congresos con el fin de promover la interacción de investigadores del grupo con pares nacionales e internacionales. 7. Promover alianzas estratégicas del grupo con el sector productivo del país con el fin de desarrollar estudios clínicos encaminados a implementar el desarrollo de proyectos de Medicina Traslacional en Colombia. 8. Promover la evaluación y divulgación de los resultados de la productividad científica de los miembros del grupo con publicación de los resultados en artículos originales en revistas internacionales de alto impacto. Como resultado de estos procesos actualmente el grupo ha participado en diversos congresos nacionales e internacionales (ver archivos de posters publicados) con presentación de posters y ponencias orales como por ejemplo en ENID 2012 (Ver artículo publicado), al igual se han culminado varias tesis de maestría en Bioquímica y Microbiología. Actualmente el grupo de investigación cuenta con dos tesistas del programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Carolina Valderrama (quien está de intercambio en la Universidad de Washington USA) y David Bernal quien está realizando su tesis en convenio con el Instituto Nacional de Cancerología, el Hospital de Kennedy y 15/09/ :30 Proyecto: Pág. 5 de 8
6 Aportes para el proceso de la investigación la Clínica del Seno. El tema de esta tesis es altamente afín con el presente proyecto se anexa copia del documento del proyecto de tesis. A nivel de pregrado han participado varios estudiantes de medicina en su rotación de internado como parte del programa Apoyo a estudiantes de pre y posgrado interesados en medicina traslacional (ver copia del programa). Finalmente existe un convenio marco de cooperación con la Fundación Salud de los Andes, quien patrocina actualmente al estudiante de doctorado David Bernal (Ver documentos adjuntos). Metodología propuesta La metodología para el desarrollo de la presente propuesta en donde los estudiantes de pregrado serán capacitados en técnicas de laboratorio se centra en los siguientes puntos: 1. Se realizarán cultivos celulares con la línea tumoral CRL2338 de ATCC, con el fin de expandir el número de células para los múltiples ensayos in vitro. Para lo anterior las células CRL2338 se cultivarán en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB), en cajas de cultivo de 75mL. Cada tercer día se realizará cambio de la mitad del medio de cultivo. Cuando haya una confluencia de un 75% de las células se realizara un pase de células a nuevas cajas de 75mL para su consiguiente expansión. Parte de las células expandidas serán criopreservadas en nitrógeno líquido para ensayos futuros en medio de congelación (RPMI 50%, SFB40% y DMSO 10%). 2. Con el fin de evaluar el grado de muerte celular inducido por agentes de quimio-radioterapia se emplearán 10^5 células CRL2338 en pozos fondo plano en platos de 96 con 200uL de medio RPMI+SFB. Las condiciones de cultivo serán las siguientes: a. Doxorrubicina: se emplearán concentraciones desde 0.5uM hasta 50uM en periodos de tiempo de 6 horas hasta 48 horas de estímulo. b. Paclitaxel: se emplearán concentraciones desde 2ug hasta 100ug en periodos de tiempo de 6 horas hasta 48 horas de estímulo. c. Irradiación UV: se empleará la luz UV de las cabinas de flujo en diferentes tiempos de inducción desde 5 minutos hasta 1 hora. d. Irradiación Gamma: Células CRL2338 serán llevadas a la bomba de cobalto del hemocentro distrital para ser irradiadas a dosis de 5Gy hasta de 50Gy. e. Control: todos los ensayos tendrán cultivos control o sin estímulos para determinar el nivel basal de todas las pruebas. 3. Luego de los diferentes estímulos se analizará inicialmente el grado de viabilidad celular mediante recuento en cámara de neubauer con el colorante de exclusión azul de tripán. Posteriormente mediante citometría de flujo se determinará el grado de muerte celular mediante colorantes de viabilidad celular como Aqua, determinación de los niveles de Anexina V y Yoduro de propidio (IP) para evaluar el porcentaje de apoptosis (Anexina V+/IP-) o de necrosis (Anexina V-/IP+). 4. Para la determinación de la traslocación de HMGB1 y de CRT, en las mismas condiciones de cultivo celular se realizará una marcación con anticrt-fitc y una marcación intracelular (citoplasmática) con antihmgb1-pe. Lo anterior para determinar los porcentajes de células a las que se les haya inducido una MCI. 5. Finalmente en los sobrenadantes de los mismos cultivos empleados en el numeral anterior se cuantificará mediante ELISA la liberación de ATP al medio como una tercera señal de MCI. Todos los datos serán tabulados y analizados para determinar las mejores condiciones de cultivo para la inducción de 15/09/ :30 Proyecto: Pág. 6 de 8
7 Metodología propuesta MCI en la línea tumoral CRL2338. Los datos serán procesados mediante el uso del software STATA 10. ACTIVIDADES Y CRONOGRAMA Descripción actividad Mes inicial Duración Importación de reactivos 1 2 Cultivo y expansión de células CRL Determinación de viabilidad 3 1 Evaluación de porcentaje de apoptosis/necrosis 3 2 Escritura de informe de avance 3 1 Evaluación de marcadores de MCI 4 2 Escritura de manuscrito e informe final 5 1 INFORMACIÓN FINANCIERA Fuente de financiación Valor UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA $ GASTOS DEL PROYECTO RUBRO VALOR VIGENCIA (Años) DESCRIPCIÓN Materiales y Suministros ,00 1,00 Compra de anticuerpos de citometría de flujo (anexina V, HMGB1 CRT), FACSflow, Kit de detección de ATP, material plástico 15/09/ :30 Proyecto: Pág. 7 de 8
8 RUBRO VALOR VIGENCIA (Años) DESCRIPCIÓN desechable y Medios de cultivo celular Valor Total del Proyecto ,00 Archivos adjuntos NOMBRE DEL ARCHIVO ADJUNTO Programa apoyo est pre y posgrado HERMES.pdf Proyecto Semilleros Prof. Carlos Parra.pdf Poster DCs Diana Tovar UN_2009.pdf 12_PROYECTO_TESIS_DAVID_BERNAL.pdf 11_TESIS MAESTRIA_FAST DCS.pdf Parra-lopez ENID 2012 rev final.pdf 1_TEBICA_RESUMEN EJECUTIVO.pdf 4. PROYECTO INC UN 2013 JULIO 3.pdf 3d. Convenio Cooperacion FSA.pdf Yo, CARLOS ALBERTO PARRA LOPEZ, investigador principal del proyecto Caracterización de la muerte celular inmunogénica (MCI) inducida por quimio-radioterapia en células tumorales declaro: Conozco los términos de referencia de la Convocatoria PROGRAMA NACIONAL DE SEMILLEROS DE INVESTIGACIÓN, CREACIÓN E INNOVACIÓN DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA Que junto con todos los participantes de este proyecto aceptamos y cumplimos todos los requisitos estipulados en los términos de referencia y renunciamos a cualquier reclamación por ignorancia o errónea interpretación de estos documentos CARLOS ALBERTO PARRA LOPEZ RESPONSABLE DEL PROYECTO 15/09/ :30 Proyecto: Pág. 8 de 8
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