BIOTECNOLOGIA EN PRODUCCION ANIMAL

Biotecnología 1 BIOTECNOLOGIA EN PRODUCCION ANIMAL A. Clement-Sengewald, G. Palma & G. Brem Introducción La mayor intervención del hombre en el pool genético de los actuales animales domésticos fue a través de la domesticación. Ninguna otra medida productiva puede o podrá afectar el componente genético poblacional en una forma tan completa. En los comienzos de la domesticación el hombre no produjo cambios en la reproducción de los animales. De esta forma se mantuvo la selección natural. Posteriormente se observó que la reproducción programada de los animales conducía a un aceleramiento de la selección. A través del aprovechamiento de la variabilidad genética podían criarse animales, que respondían mejor al fenotipo establecido, o sea aquellos que poseían las características externas deseadas. Con el tiempo se establecieron programas de mejoramiento que no respondían solamente al deseo de una persona sino de varias y más tarde al objetivo de agrupaciones de criadores. El empleo de la genética poblacional como también de los métodos genético-estadísticos permitió, junto con la aplicación de la inseminación artificial, el desarrollo de exigentes programas de selección y evaluación de la descendencia. Con el desarrollo de la biotecnología se alcanzó un nivel, en el cual es posible la manipulación dirigida del genoma o determinados genes con mayor rapidez. Es posible además alcanzar la manifestación de algunas particularidades productivas, las cuales con la selección natural o programas de mejoramiento serían difíciles de alcanzar. Las técnicas reproductivas, mediante las cuales es posible afectar el genoma de los animales (cuadro 2), se diferencian de las técnicas génicas, las cuales se ocupan de los genes en forma individual (cuadro 3). Técnicas reproductivas Las técnicas reproductivas abarcan la inseminación, la congelación de semen, la micromanipulación, la producción in vitro, el clonado y la congelación de los embriones. Los tratamientos hormonales de inducción y sincronización del celo de las hembras receptoras de semen y embriones como así también de las donantes de embriones, garantizan en muchos casos que las mencionadas técnicas se cumplan con éxito. La técnica reproductiva de mayor aplicación es la inseminación artificial (IA) y con ella la congelación de semen. A pesar de la resistencia presentada originalmente por razones éticas se reconoció rápidamente una de las ventajas de la IA con la disminución de las enfermedades infecciosas transmitidas a través de la cópula. Con la misma celeridad se observó que era posible obtener una mayor descendencia de un solo macho dividiendo el semen de un eyaculado en porciones e inseminando con las mismas varias hembras simultáneamente. De esta forma es posible aprovechar el potencial de los machos en forma intensiva y mejorar así la estimación del valor genético de los reproductores, dado que las particularidades heredables son mejor evaluadas con un gran número de hijos. La conservación de semen congelado en nitrógeno líquido posibilitó su almacenamiento durante décadas, sin que ello afecte la fertilidad del mismo. La IA juega, junto con la congelación de semen, un rol de importancia en la producción bovina. La inseminación artificial en las especies ovina, porcina y equina no alcanzó un significado equivalente al existente en la especie bovina. En las dos últimas es necesario modificar aún los métodos empleados para mejorar los resultados. La técnica de inseminación artificial por medio de laparoscopía en la especie ovina permite actualmente obtener resultados satisfactorios, lo que abrió las posibilidades del comercio internacional de semen. La transferencia de embriones es una técnica reproductiva en constante desarrollo. Su evolución es observable particularmente en la especie bovina. La TE asociada a la superovulación de las donantes (capítulos, II al VIII) puede aumentar considerablemente el número de la descendencia por donante y de esta forma multiplicar el componente genético materno (capítulo XVII). En la tabla 1 se resume el significado que tiene la transferencia de embriones actualmente en Europa. Lamentablemente se Biotecnología de la Reproducción

2 Clement-Sengewald, Palma y Brem dispone de poca información de la TE en países sudamericanos aunque las actividades y comercialización con embriones frescos y congelados son actualmente relevantes en Argentina (cuadro 1), Brasil y Paraguay. Tabla 1: Transferencias de embriones en Europa durante el año 1991 (8th Scientific Meeting, A.E.T.E., Lyon, 11-12 sept. 1992) Embriones por donante Pais Lavajes de Útiles Transferidos Congelados Σ donantes (n) (n) frescos % % Alemania 4170 9 5 62 38 Bélgica 2169 8 5 54 46 Francia 7896 8 4 59 41 Holanda * 2521 s.i. 6 32 68 Inglaterra * 2141 s.i. 3 43 57 Checoslovaquia 1507 7 4 71 29 Union Soviética * 4800 10 6 49 51 Irlanda 979 7 5 50 50 España 306 7 3 50 50 Italia 1060 9 6 63 37 s.i.: Sin información; * : registros de la misma fuente del año 1990 Cuadro 1: Producción de terneros por medio de transferencia de embriones durante un año (7.91-7.92) en la República Argentina (Memorias de la Sociedad Rural Argentina, 1992) Raza Descendencia (n) Aberdeen Angus 804 Holando Argentino 704 Hereford 556 Limousin 129 Fleckvieh 83 Otras 121 Total 2897 A través de la TE es posible aumentar el progreso genético, porque a través del aumento del número de embriones y terneros el potencial genético de la hembra puede reproducirse y emplearse con más eficacia. Razas y animales exóticos pueden, según las necesidades, reproducirse rápidamente. La eficiencia de los programas de selección y cruzamiento aumentan considerablemente con la aplicación de la transferencia de embriones. Junto con la TE es preciso también mencionar la congelación de embriones por medio del método estándar y vitrificación (capítulo IX). El almacenamiento de los embriones congelados se lleva a cabo en nitrógeno líquido (-196 o C). De la misma forma que el semen los embriones pueden almacenarse durante décadas. Las ventajas que ofrece esta técnica es una mayor eficacia y ahorro en el uso de las receptoras en un programa de TE, facilidad en el transporte de los embriones y en consecuencia la posibilidad del comercio de material genético. De esta forma los animales nacen en el lugar de destino y se adaptan al macro- y microclima Biotecnologia de la Reproduccion

Biotecnología 3 de la región. La congelación de los embriones permite la formación de reservas genómicas en forma de bancos de embriones. Ello tiene particular importancia en la conservación de razas en peligro de extinción, cuya producción y mantenimiento en establecimientos ganaderos son sumamente costosos. Cuadro 2: Objetivos de las técnicas reproductivas en el bovino - IA y Congelación de semen Combate y disminuye enfermedades sexuales Empleo intensivo del potencial genético del macho y mejoramiento de la estimación del valor genético (prueba de la descendencia) - Sincronización del celo inducción de la ovulación y el parto Facilidad en el manejo reproductivo y productivo Disminución de la mortalidad neonatal - Superovulación, TE, congelación de embriones Optimización del potencial de la hembra Rápida reproducción de individuos exóticos o razas en peligro de extinción Formación de bancos de reservas genómicas Facilidad en la importación y exportación del material genético - Manipulación y microcirugía de embriones para la producción de mellizos monocigotas y quimeras Aumento del número de animales nacidos por embrión recolectado Optimización de la estimación del valor genético Creación de modelos de investigación - Determinación del sexo Selección del sexo de acuerdo a los objetivos establecidos - Producción in vitro de embriones Ahorro de donantes Producción de embriones de vacas donantes que no responden a los tratamientos superovulatorios - Clonado de embriones por medio de transferencia nuclear Variabilidad libre de recombinaciones de genotipos individuales Aumento del número de terneros por embrión La TE posibilitó la microcirugía de los embriones, con la producción de mellizos monocigotas (capítulo X) y quimeras a través de la combinación de mitades de embriones diferentes. Por medio de la división de los embriones es posible aumentar el número de embriones producidos en un programa convencional de TE de 0,6-0,7 a 0,9-1,2 terneros por embrión dividido. Los mellizos producidos de esta forma constituyen modelos adecuados en producción animal e investigación. Las pruebas llevadas a cabo con mellizos idénticos permite una mayor exactitud de la estimación del valor genético de los padres, dado que la varianza de los mellizos es menor que las de los hermanos enteros y medio hermanos (capítulo XX). Posibilita también la evaluación de la influencia ambiental sobre los reproductores; si los animales idénticos se crían en medios diferentes su condición genética idéntica facilitará la determinación de cada diferencia ambiental (foto 1). Biotecnología de la Reproducción

4 Clement-Sengewald, Palma y Brem Foto 1: Mellizos monocigotas de la raza Fleckvieh producidos por medio de Micromanipulación (BREM, capítulo X) La producción microquirúrgica de quimeras puede llevarse a cabo de dos formas. En primer lugar a través de la inyección de células en el blastocele de embriones, en este caso se espera que las células inyectadas tomen parte en el desarrollo del embrión. Otro método es la producción de quimeras a través del agregado de embriones o hemi-embriones diferentes en una misma zona pelúcida (figura 1). Las dos o más mitades o embriones enteros a agregar son liberados de la membrana pelúcida y posteriormente las combinaciones deseadas nuevamente transportadas a una zona pelúcida común. El nuevo embrión, producto del agregado, se organiza rápidamente y se transfiere de acuerdo con el programa convencional. Embrión I Embrión II Embrión I Embrión II Fig. 1: Modelo de producción de quimeras a partir de varios embriones Biotecnologia de la Reproduccion

Biotecnología 5 Si se emplea como marcador el color de piel, la presencia de la quimera se determinará por los diferentes colores del pelaje (foto 2). Foto 2: Quimera producida con las razas Fleckvieh y Murnau Werdenfelser (BREM, 1986) Las quimeras se emplean en la investigación genética básica de mutaciones y fallas genéticas dado que es posible establecer como se comportan dos líneas diferentes en un individuo y su efecto sobre el desarrollo corporal. Intensos trabajos de investigación en los últimos 10 años hicieron posible la producción in vitro (PIV) de embriones (capítulo XI) y de la misma forma su cultivo hasta estadios transferibles en condiciones convencionales. Las ventajas de la PIV de embriones son numerosas: disminución del costo de los embriones, disponibilidad de embriones en estadios tempranos de desarrollo a bajos costos, dado que con la producción in vivo la recolección de los embriones del oviducto se lleva a cabo por medio de cirugía. El número de donantes pude reducirse. La PIV de embriones puede ser utilizada además en aquellos casos en los cuales una vaca no puede ser sometida a los lavajes convencionales o debe ser sacrificada. Esto es particularmente importante cuando se trata de animales de alto valor genético como así también razas en peligro de extinción (foto 3). Foto 3: Ejemplar de la raza Murnau Werdenfelser en peligro de extinción, obtenido por medio de la producción in vitro de embriones (BERG, capítulo XI) Biotecnología de la Reproducción

6 Clement-Sengewald, Palma y Brem Hace pocos años se emplea la técnica de transferencia nuclear en la producción de clones, esto es, la posibilidad de producir varios embriones genéticamente idénticos (capítulo XII). Con ayuda del clonado es posible transferir algunos embriones para probar los animales nacidos mientras otros tantos permanecen congelados. Si el resultado de las pruebas es positivo los embriones pueden descongelarse emplearse como donantes de blastómeros en un reclonaje. En teoría se dispone de un número ilimitado de núcleos para nuevos reclonados. Las aplicaciones de esta técnica son interesantes como numerosas: las pruebas de evaluación con estos animales es más exacta por la menor variabilidad genética de los clones, posibilitando una evaluación más precisa de las influencias ambientales. Ahorra animales de experimentación y de prueba (por ejemplo, descendencia) frente a aquellos con un menor vínculo familiar. Con la multiplicación de animales de alto valor genético puede acelerarse el progreso genético. Además es posible destinar un embrión para diagnosticar el sexo del clon, lo que permite seleccionar los animales producidos también por su sexo. Técnicas génicas Las técnicas génicas conocidas también como de ingeniería genética incluyen el clonado de genes, el análisis de los mismos para el diagnóstico de determinadas variantes génicas, que llevan consigo particularidades positivas o negativas y la transferencia génica (Cuadro 3). Cuadro 3: Objetivos de las técnicas génicas en producción animal - Producción génica de productos a través de la transformación de células de levaduras, de bacterias o de animales mamíferos con un ADN recombinante in vitro - Formación de un banco de genes para la conservación de material genético - Modificación génica de los microorganismos del rumen con el objeto de alcanzar una digestión más eficiente y la disposición endógena de producir componentes metabólicos esenciales - Métodos analíticos (Análisis génico) Ayuda en la orientación de análisis génicos posteriores Estudio de la relación entre marcadores ADN e importantes características productivas - Diagnóstico Estudio genético y diagnóstico de fallas genéticas Determinación de variantes génicas definidas para características deseadas Determinación de la identidad de la ascendencia de animales reproductores ("impresión digital ADN") - Transferencia de genes Mejoramiento de la calidad de productos animales Producción de animales resistentes a enfermedades Mejora de la eficiencia productiva Producción de proteínas (Gene Farming) En la técnica de producción génica de sustancias por medio de la transformación de células de levaduras, de bacterias o de mamíferos se introduce un ADN recombinante en las células a fin de capacitarlas en la producción de proteínas. De esta forma pueden producirse hormonas, vacunas y otras sustancias en forma idéntica a la natural, pura y a bajos costos. Biotecnologia de la Reproduccion

Biotecnología 7 El empleo de microorganismos ruminales modificados génicamente permitió reducir el nivel de hidrólisis de nitrógeno, la proteólisis y la producción de lactato regulando la relación de acetato, propionato y butirato. A través de los organismos ruminales modificados genéticamente se espera una digestión más eficiente y una mejora de la disponibilidad de aminoácidos y vitaminas. Este método de técnica génica se encuentra aún en la fase de prueba y sometido a discusión sobre su libertad de aplicación, dado que los microorganismos del rumen son liberados también en el ambiente. El análisis genómico tiene el objetivo de describir una especie animal en forma progresiva y completa con ayuda de métodos celulares y génicos. El mismo pretende identificar los genes y analizar sus secuencias de nucleótidos para aclarar finalmente el modo de efecto de genes o complejos de ellos (capítulo XV). Contrariamente a la especie humana, sobre la cual se discute el conflicto ético de analizar la totalidad del genoma, ese aspecto no juega rol alguno en producción animal. Un análisis completo significa, sin embargo, costos y esfuerzos muy grandes, razón por la cual sólo se llevan a cabo análisis parciales. Los conocimientos obtenidos en la especie humana, más avanzados que en otras especies, convierten a la primera en una modelo adecuado para el análisis del genoma de los animales de interés zootécnico. Una vez identificado el gen deseado pueden buscarse las variantes naturales del mismo y emplear los animales portadores en programas de mejoramiento. El número de genes identificados en animales de interés productivo no supera en la actualidad los 100. En el hombre se identificaron hasta ahora más de 3000 genes. El análisis genómico comprende 3 áreas: - Mapa génico - Análisis de acoplamiento - Caracterización individual de genes El mapeo génico pretende determinar la localización de características heredables en los cromosomas y establecer una relación lineal entre ellos. Entre los métodos de mapeo se incluyen el empleo de híbridos celulares, la hibridación in situ, la microdisección cromosómica y la subordinación de una característica al efecto conjunto de varios genes. Los mapas génicos sirven de orientación en el genoma. Cuanto más exacto es el conocimiento de la estructura y localización individual de los genes, más exacto es el reconocimiento de la totalidad del genoma. El análisis de acoplamiento genético pretende determinar la distancia entre dos localizaciones génicas. En producción animal se intenta establecer una relación entre marcadores ADN y características de importancia productiva. De esta forma el marcador ADN se convierte en el punto de partida del segmento que contiene el gen de interés. Actualmente se dispone de dos métodos de análisis de acoplamiento genético: polimorfismo del largo del fragmento de restricción (restrictions-fragment-large-polimorphisms) PLFR y el VNTRs. El PLFR basa su actividad en la capacidad de las enzimas de restricción de cortar una cadena de ADN sólo en aquellas posiciones donde se encuentran las secuencias de bases que responden a la enzima de restricción. Si se modifican sólo los pares de bases, se originan fragmentos de restricción de diverso largo, que pueden separase con ayuda de electroforesis en gel. Si la característica en cuestión aparece en una familia, se aisla el ADN de cada uno de los miembros y con ayuda de enzimas de restricción y una sonda de ADN se producen muestras fragmentadas. Cuando el marcador genético se encuentra ubicado lo suficientemente cercano al segmento de ADN que codifica la característica a estudiar, se heredará siempre junto con él. Esto es, están acoplados. El segundo método de acoplamiento es el conocido como "variable numberd tandem repeats" (VNTR). Estas son pares de bases muy cortas ordenadas en tandem con diferente número de copias y que pueden estar distribuidas en gran número sobre todo el genoma. La diferencia de largo se establece por medio de PLFR. La diferencia se basa en que dada la frecuencia de su presencia con este método se aumenta la posibilidad de establecer un acoplamiento. El tercer campo de análisis genómico es el de la caracterización individual. Genes individuales de Biotecnología de la Reproducción

8 Clement-Sengewald, Palma y Brem importancia para la producción animal son caracterizados en su estructura de secuencia ADN a fin de establecer un cuadro exacto de los fenómenos hereditarios a nivel molecular. Un ejemplo de ello es la aracnomegalia en la raza Braunvieh europea, gen letal con un índice endémico de 5%. Etiológicamente se supone un defecto en los genes responsables de la producción del colágeno. Si ese gen fuera identificado a nivel molecular podría ser evaluada su presencia en cada reproductor de forma tal de eliminar a los portadores. Con el diagnóstico génico se pretende en producción animal reconocer variantes génicas, que influencian en forma positiva ciertas características de interés productivo. En la actualidad existen dos métodos diagnósticos disponibles para determinar segura y rápidamente la presencia de esas variantes génicas: hibridación y sonda de ADN o PCR (Polymerase-Chain-Reaction). La hibridación consiste en el corte de la hélice de ADN en fragmentos por medio de enzimas de restricción, los fragmentos son separados electroforéticamente. Genes individuales pueden ser identificados con ayuda de una sonda génica, dado que ésta se deposita en el fragmento de ADN. PCR permite obtener de un sólo fragmento de ADN varios millones de copias en un lapso de pocas horas. Estas se hacen visibles con ayuda de una minielectroforesis, ahorrando el trabajoso método de hibridación. Con ambos métodos de diagnóstico génico pueden identificarse variantes génicas aún cuando se presentan en estado heterocigota. Un ejemplo de ello es la determinación del sexo de embriones, que se lleva a cabo con PCR antes de la transferencia (capítulo XV). El principio del fenómeno conocido como impresión digital ADN se basa en que si el genoma total de los animales fuera cortado y evaluado con diferentes pruebas se observaría que ningún animal es idéntico a otro, respondiendo al mismo principio de la impresión digital. A ello se lo denomina polimorfismo del lugar de corte. El mismo está determinado por fenómenos de mutación natural y tiene como consecuencia diferentes largos de fragmentos de restricción, lo que establece un modelo individual para cada animal. En teoría puede identificarse cada animal sin riesgo de confusión. Dado que el ADN se transmite a la descendencia y las mutaciones ocurren raras veces se emplea este método para la determinación de la ascendencia, ya que los hijos portan sólo fragmentos de ADN que están presentes en los padres. La transferencia de genes (capítulo XIII) se estableció como técnica a partir de la década de 1980 transfiriendo, en primeras experiencias, secuencias recombinadas a ratones. A partir de 1985 se informó sobre los primeros animales domésticos transgénicos. Para la transferencia génica es importante que cada gen sea aislado, caracterizado y recombinado con elementos reguladores adecuados. Ello ocurre gracias a la ayuda de métodos biológico-moleculares. La transferencia génica debe llevarse a cabo en lo posible en estadios embrionarios tempranos, a fin de que la estructura génica se integre en todas las células corporales. Por esa razón el mejor momento del desarrollo del individuo es el estadio unicelular. Para llevar a cabo la transferencia de genes existen 3 técnicas disponibles: la microinyección de ADN en el pronúcleo de los cigotos, la transferencia a través de vectores retrovirales y a través de células totipotentes transformadas genéticamente. El espectro de aplicaciones de la transferencia génica en producción bovina es grande. En primer lugar pueden mejorarse la calidad o la composición de sus productos. Ejemplos de ello son: la producción de leche libre de lactosa para aquellas personas que sufren de insuficiencia de lactasa, la mejora en la composición cárnea de la res, la producción de animales resistentes a enfermedades, la producción de proteínas importantes para el hombre en animales. En ese "gene farming" se acoplan promotores a interesantes estructuras génicas (factores de la coagulación, por ejemplo) y transfieren a animales que producirán la proteína deseada. Además se pretende modificar el equilibrio dinámico entre la biosíntesis y degradación de determinados productos a través de enzimas claves para favorecer la producción de ciertos productos de regulación compleja. La investigación y desarrollo de estas técnicas significan un esfuerzo económico de magnitud y una inversión de tiempo muy grande. Es de esperar, sin embargo, que los resultados brindarán importantes aportes a la producción animal. Biotecnologia de la Reproduccion