Guía Práctica 6 Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Contenido Manejo del hongo en el laboratorio Guillermo Castellanos, Experto en Investigación 2 Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigación Gloria Mosquera, Fitopatóloga, Ph.D., Líder de Proyecto Fitopatología de Frijol Generalidades 6-2 Procedimientos 6-3 A. Recolección y transporte de las muestras 6-3 B. Preparación del medio de cultivo V8 6-6 C. Aislamientos del hongo P. griseola 6-7 1. Monospórico con trozos de PDA o de agar-agua 6-7 D. Incremento de P. griseola 6-10 E. Inoculación de las plantas 6-11 1. Inóculo para el invernadero 6-11 2. Inóculo para el campo 6-14 F. Conservación de P. griseola para almacenamiento 6-16 1. Liofilización 6-16 2. Conservación en papel filtro a 20 C 6-24 3. Conservación como suspensión en solución de peptona-sucrosa, en papel filtro a 20 C 6-26 G. Prueba de almacenamiento 6-28 H. Recuperación del hongo almacenado 6-29 1. Conservado en suspensión liofilizada en ampolletas 6-29 2. Conservado en papel filtro a 20 C 6-31 3. Conservado a 20 C en papel filtro de suspensión en peptona-sucrosa 6-32
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Generalidades La mancha angular del frijol, causada por el hongo Phaeoisariopsis griseola, es una de las enfermedades más frecuentes de los cultivos de frijol común (Phaseolus vulgaris) en regiones tropicales y subtropicales. Cuando la variedad de frijol es muy susceptible al patógeno, los síntomas iniciales de la enfermedad aparecen, generalmente, en las hojas primarias como manchas circulares. En los folíolos de las hojas más desarrolladas, los lados de las lesiones, definidos generalmente por las nervaduras, forman ángulos y de ahí se deriva el nombre de la enfermedad (Foto 1). Foto 1 6-2
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Procedimientos A. Recolección y transporte de las muestras Para aislar el hongo Phaeoisariopsis griseola, se colecta, de preferencia, el tejido foliar enfermo, aunque se puede tomar también tejido del tallo o de las vainas; estos tejidos deben presentar lesiones de la enfermedad bien desarrolladas. Nunca se deben recolectar tejidos de plantas viejas o senescente porque en éstos se encuentran algunos agentes saprofitos que dificultan el aislamiento de P. griseola. Se debe descartar también el tejido vegetal enfermo que tenga señales de daño de insectos o síntomas de otras enfermedades. Nota: El aislamiento de este patógeno se facilita cuando se recolecta tejido foliar infectado, porque en las hojas aparecen muchas lesiones y de cada lesión pueden obtenerse uno o varios aislamientos. Cuando se recolecten vainas con síntomas, deben preferirse las que estén verdes. Materiales Toallas de papel Bolsas de papel Rótulos para identificar las muestras Marcador de punta fina o lápiz 6-3
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Toallas de papel. La muestra de tejido de frijol infectado (de hojas, vainas o tallos), una vez separada de la planta, se envuelve en una toalla de papel que sirve, además, para absorber su humedad. Si no hay toallas, pueden usarse materiales similares como servilletas, papel higiénico, pañuelos faciales y, en último caso, papel periódico. Bolsas de papel. Las muestras de tejido infectado envueltas en algún papel absorbente se colocan en bolsas o sobres de papel. No se deben usar bolsas plásticas porque no son porosas y contribuyen, por ello, a la acumulación de humedad en su interior; esta humedad favorece el crecimiento de microorganismos saprofitos, los cuales dificultarán el aislamiento del patógeno en los tejidos de frijol colectados. Rótulos para marcar las muestras. Es muy importante identificar claramente la muestra con la siguiente información: variedad (o genotipo) de frijol, tamaño y color de sus granos, lugar donde se toma la muestra (localidad, provincia, departamento, país), fecha de recolección de la muestra, nombre del recolector y, en lo posible, latitud y longitud (aproximadas) del lugar en que se hizo la recolección. El rótulo debe quedar bien adherido en cada muestra. 6-4
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Recomendaciones Indicar en el rótulo si la recolección se hizo en el campo de un agricultor o en una estación experimental. Cuando no haya suficientes rótulos para todas las muestras, marcar las bolsas con un código y registrar la información respectiva en una libreta de campo. No recolectar material vegetal húmedo; si está en esas condiciones, secarlo con toallas de papel antes de ser transportado. Una vez en el laboratorio, y si no se procesa inmediatamente, dejarlo sobre toallas de papel al aire libre para que termine de secarse. Pasos del proceso Foto 2 Paso 1 Tomar una muestra (o varias) de la parte de la planta enferma (hojas, vainas o tallos) que presente (Foto 2) los síntomas causados por el patógeno (ver A. Recolección y ). Paso 2 Envolver la muestra en una toalla de papel (Foto 3), colocarla en una bolsa o sobre de papel y adherir a ésta el rótulo que corresponda (ver A. Recolección y ). Foto 3 6-5
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 3 Enviar la muestra, tan pronto como sea posible, al sitio o laboratorio donde se hará el aislamiento del hongo. Nunca envíe las muestras dentro de bolsas plásticas o envueltas en papel aluminio (ver antes). B. Preparación del medio de cultivo V8 El jugo V8 es el medio ideal para aislar e incrementar el hongo P. griseola. Está compuesto por extractos de ocho vegetales: tomate, zanahoria, apio, remolacha, perejil, lechuga, puerro y espinaca. Contiene, además, sal, vitamina C (ácido ascórbico) y ácido cítrico. El jugo V8 se consigue en supermercados de cadena. El medio se prepara con los siguientes ingredientes: Materiales Foto 4 Agua destilada 1200 ml Agar 23 g Carbonato de calcio (CaCO 3 ) 3 g Jugo V8 (una lata) 340 ml Cajas petri 60 Frascos erlenmeyer de 1000 ml 3 Preparación Se pesan los ingredientes, se colocan en un vaso y se agregan los 1200 ml de agua. Se mezclan y envasan 500 ml en cada erlenmeyer de 1000 ml (Foto 4) y se llevan enseguida al autoclave para esterilizarlos. 6-6
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular El medio esterilizado se deja enfriar hasta que se pueda manipular, y se vierte luego en 60 cajas petri, a razón de 20 ml por caja (Fotos 5 y 6). C. Aislamientos del hongo P. griseola 1. Monospórico con trozos de PDA o de agar-agua Se obtienen aislamientos monospóricos del hongo P. griseola mediante un método directo que consiste en colocar la muestra (hoja o vaina con lesiones) en una cámara húmeda; el propósito es activar el desarrollo de los sinemas y la producción de conidias. Foto 5 Materiales (para la cámara húmeda) Plato petri grande Agua destilada estéril Papel filtro Varilla de vidrio en forma de V Muestra de hoja o de vaina infectada Alfileres Pipeta pasteur Agar o medio de cultivo PDA Rastrillo de vidrio Medio de cultivo V8 Foto 6 6-7
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Pasos del proceso Foto 7 Paso 1 Colocar papel filtro en una caja petri y sobre él unas varillas de vidrio en forma de V. Humedecer después el papel con agua destilada estéril (Foto 7). Paso 2 Colocar sobre las varillas de vidrio las hojas enfermas, con el envés hacia arriba evitando que el tejido enfermo entre en contacto con el papel humedecido. Las vainas se colocan con las lesiones hacia arriba (Fotos 8 y 9). Foto 8 Foto 9 Paso 3 Tapar y guardar la caja petri durante 2 o 3 días en un lugar oscuro a temperatura ambiente. Pasado ese tiempo, observar el estado de los sinemas (Foto 10) con la ayuda de un estereoscopio. Paso 4 Cuando los sinemas hayan esporulado, tomar un pequeño trozo de agar o de medio de cultivo PDA con la punta de un alfiler previamente flameado, y tocar con él suavemente uno o varios sinemas esporulados; de este modo las conidias se adhieren al trozo de agar. Foto 10 6-8
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Paso 5 Lavar el trocito de agar con agua destilada estéril empleando una pipeta estéril, para liberar las conidias adheridas a él; el agar se desintegra en el lavado (Foto 11). Foto 11 Paso 6 Esparcir luego con el rastrillo de vidrio, sobre el medio de cultivo (PDA o agar-agua) contenido en la caja petri, toda la suspensión obtenida en el paso anterior (Foto 12). Paso 7 Incubar el aislamiento a 24 C durante 24 horas. Después de este tiempo, las conidias habrán germinado y estarán listas para ser transferidas a una caja petri que contenga el medio de cultivo V8. Paso 8 Enfocar las conidias germinadas con un estereoscopio (Foto 13). Elegir una y sacarla con un alfiler previamente flameado para transferirla a una caja petri que contenga el medio de cultivo V8; incubar la caja a 24 o C. Foto 12 Foto 13 A los 5 días se observa en el medio de cultivo un punto gris (Foto 14) en el sitio en que fue transferida la conidia: esto indica que el aislamiento fue exitoso y que el hongo está en pleno desarrollo. 6-9 Foto 14
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol El hongo sigue creciendo y 25 días más tarde la colonia del hongo se habrá expandido (Foto 15). Conviene notar que este hongo crece en forma columnar y por ello su diámetro no pasará de 1 cm en estos cultivos monospóricos. El aislamiento monospórico es el punto de partida de los diversos procesos (inoculación, extracción de ADN del micelio, conservación) en que se requiere un aislamiento específico del patógeno. Foto 15 D. Incremento de P. griseola El incremento se debe hacer a partir de un aislamiento monospórico (Foto 15). Pasos del proceso Paso 1 Seleccionar el aislamiento monospórico que se incrementará. Paso 2 Preparar una suspensión de conidias vertiendo sobre la colonia, con una pipeta, unas 10 gotas de agua destilada estéril y raspando luego la superficie de la colonia con la punta de la pipeta (o con una espátula estéril). El raspado hace que las conidias se desprendan de los conidióforos (Foto 16). Foto 16 6-10
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Paso 3 Transferir, con la misma pipeta estéril, la suspensión de conidias a una caja petri que contenga el medio de cultivo V8. Esparcirla, con un rastrillo de vidrio previamente flameado, por toda la superficie del medio. Se preparan de este modo varias cajas petri. Paso 4 Incubar las cajas del paso anterior a 24 C durante 12 días. E. Inoculación de las plantas 1. Inóculo para el invernadero Terminada la incubación (12 días), se seleccionan las cajas incrementadas que tengan mejor crecimiento y con ellas se prepara una suspensión de conidias para obtener la suspensión del inóculo de invernadero. Foto 17 Pasos del proceso Paso 1 Agregar agua destilada estéril a los incrementos del hongo en las cajas petri del paso anterior, y raspar luego la superficie del medio con una espátula estéril para desprender las conidias (Foto 17). Obtenida así esta suspensión de conidias, filtrarla con una gasa estéril para separar restos del medio de cultivo V8, recogiendo en un vaso mediano el filtrado con las conidias de las cajas elegidas (Foto 18). Foto 18 6-11
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol La separación de estas partículas sólidas tiene dos objetivos: facilitar el conteo de las conidias y evitar que se tapone la boquilla del aspersor DeVilbiss (designado aquí por su marca), el cual se emplea, junto con un compresor, para aplicar el inóculo sobre las plantas. En lugar del aspersor DeVilbiss se puede usar un aerógrafo o un atomizador de líquidos. Foto 19 Paso 2 Contar las conidias observadas en la cuadrícula central del hemacitómetro (Foto 19) empleando el microscopio (Foto 20). El número de conidias contadas se multiplica por 10.000. La concentración que debe tener (en este caso) el inóculo del patógeno es de 2 x 10 4 conidias/ml. Entonces, dado un volumen final del inóculo que se asperjará y dada la concentración de conidias del inóculo original, utilizar la siguiente fórmula para hallar el volumen de este inóculo original que se necesita para preparar el de la aspersión: V 1 x C 1 = V 2 x C 2 Ejemplo Se contaron 8 conidias en el hemacitómetro. Foto 20 Por tanto, 8 x 10.000 = 80.000 = 8 x 10 4 (conidias en 1 ml) 6-12
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Ésta es la concentración del inóculo original (el filtrado del Paso 1). Ahora bien, si se necesitan 250 ml de un inóculo que tenga una concentración de 2 x 10 4 (conidias/ml), sustituir esos datos en la fórmula anterior y hallar el valor del volumen (V 1 ) del inóculo original o inicial que se toma para preparar el que ahora se necesita: V 1 x 8 x 10 4 = 500 ml x 2 x 10 4 Por tanto, V 1 = 500 ml x 2 x 104 = 125 ml 8 x 10 4 Tomar entonces 125 ml del inóculo inicial y completarlos hasta 500 ml con agua destilada estéril para obtener la concentración final deseada. Paso 3 Obtenida la concentración requerida (conidias por mililitro de agua) para la inoculación, verter un volumen (250 ml) de esta suspensión de inóculo en un frasco erlenmeyer de 250 ml, que se conecta luego a un DeVilbiss (o un aerógrafo) y éste a un compresor para hacer la inoculación por aspersión. Inocular plantas de 17 días de edad en la primera hoja trifoliada (Foto 21). El volumen de inóculo aplicado a la hoja se calcula de tal manera que la superficie foliar quede totalmente humedecida sin que drene o escurra la suspensión del inóculo. Foto 21 6-13
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 4 Llevar las plantas inoculadas a una cámara húmeda, donde permanecerán durante 96 horas con una humedad relativa superior al 90% y una temperatura promedio entre 22 y 24 C. Pasado ese tiempo, retirar las plantas de la cámara y colocarlas sobre las mesas del invernadero hasta que sean evaluadas. Los síntomas de la mancha angular se evalúan 10 días después de su salida de la cámara (Foto 22). Para hacer la evaluación se aplica la escala estándar del CIAT, cuyas categorías van del 1 al 9 y se distribuyen así: de 1 a 3: planta resistente de 4 a 6: planta de reacción intermedia de 7 a 9: planta susceptible 2. Inóculo para el campo Foto 22 Materiales Cajas petri Incrementos de P. griseola en medio de cultivo V8 Licuadora industrial Recipiente grande Agua corriente Embudo Hemacitómetro 6-14
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Pasos del proceso Paso 1 En el vaso de la licuadora industrial verter agua corriente y depositar en él (con ayuda de una espátula) varias cajas que contengan el hongo incrementado en el medio de cultivo V8, incluyendo el medio (Foto 23). Paso 2 Licuar el contenido del recipiente (medio de cultivo V8 con estructuras del hongo) hasta obtener un producto homogéneo. El contenido de 70 cajas hace, aproximadamente, un homogenizado de 20 litros. Paso 3 Cuantificar la concentración de conidias en el homogenizado de 20 litros mediante un hemacitómetro. Calcular luego el volumen de solución final del inóculo (Paso 2 anterior) según el área de cultivo que se quiere inocular, y ajustar la concentración en el inóculo final. Para hacer una inoculación artificial en 1 hectárea de un cultivo de frijol en el campo se requieren, como mínimo, 70 cajas petri de incrementos de P. griseola bien esporulados, diluidos en 140 litros de agua. Se obtiene así una suspensión de conidias con la concentración requerida (2 x 10 4 conidias/ml) para inocular 1 hectárea. Foto 23 6-15
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 4 Verter, utilizando un embudo, el inóculo en un recipiente fácil de manejar (Foto 24). Cerrar muy bien la boca de entrada del recipiente y revisar éste con frecuencia para detectar fisuras o fugas. Las inoculaciones con este patógeno deben hacerse siempre al caer la tarde, cuando la temperatura va en descenso y la humedad relativa aumenta utilizando para ello una bomba de espalda con motor. F. Conservación de P. griseola para almacenamiento Para conservar el hongo P. griseola se emplean tres métodos: la liofilización, el papel filtro en trozos guardados en sobres, y el papel filtro impregnado con una suspensión del hongo en solución de peptonasucrosa. Foto 24 1. Liofilización Es el método más confiable para conservar microorganismos en almacenamiento. Materiales Liofilizador Ampolletas para liofilizar de cristal neutro ( neutral glass ) de 0.5 ml Pipetas pasteur largas 6-16
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Tijeras y algodón Incremento del hongo, en medio de cultivo V8 Peptona al 10% Sucrosa al 20% Nota: Los aislamientos deben prepararse 12 días antes de empezar el proceso de liofilización (ver D. Incremento de ). Al iniciar esta etapa de almacenamiento, los aislamientos deben haber esporulado y estar libres de contaminantes. Pasos del proceso Paso 1 Escribir o marcar en papel filtro la identificación de los aislamientos que se van a liofilizar. La identificación incluye el nombre del hongo (género y especie), el nombre del aislamiento (código empleado por cada laboratorio) y la fecha en que se almacena el aislamiento. Esta información se escribe con letra pequeña en áreas reducidas del papel (1 a 2 cm 2 ). 6-17
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 2 Cortar, con una tijera estéril, los trozos de papel filtro con la identificación del hongo e introducir uno en cada ampolleta hasta el fondo de ésta. Foto 25 Foto 26 Preparar luego el tapón de algodón con que se tapa la ampolleta, de modo que cubra, más o menos, los dos tercios superiores de la ampolleta. Extender un trozo de algodón hasta que tenga unos 5 x 3 cm y enrollarlo sobre una pinza (o la parte delgada de un asa), presionando con los dedos hasta formar el tapón sobre ese extremo del asa (Fotos 25, 26 y 27). Dejar un poco de algodón sin enrollar en el lado opuesto del tapón. Introducir el tapón en la ampolleta y retirar la pinza (o el asa) suavemente con una mano, mientras se sostiene el tapón dentro de la ampolleta con la otra. Preparar ampolletas adicionales con sus respectivos tapones para tener más tapones en caso de que se necesiten. Si un tapón se desintegra al ser manipulado, es necesario remplazarlo con uno que esté esterilizado en las ampolletas adicionales. Paso 3 Llevar este material (ampolletas con sus tapones) al autoclave para esterilizarlo durante 40 minutos. Foto 27 6-18
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Paso 4 Preparación de las soluciones de peptona y de sucrosa Se toman 10 g de peptona y se disuelven en 100 ml de agua destilada. Se prepara de igual modo una solución de sucrosa al 20%, disolviendo 20 g de este producto en 100 ml de agua destilada. Las dos soluciones, que se preparan por separado, se llevan al autoclave. Una vez esterilizadas, se mezclan partes iguales de cada una en un recipiente estéril para hacer una solución de peptona-sucrosa. Paso 5 Con una pipeta pasteur larga, succionar de 2 a 3 ml de la mezcla peptona-sucrosa (ver Paso 4) y depositarlos sobre el cultivo del hongo (Foto 28). Hacer luego un homogenizado del hongo (micelio y conidias) y de la solución de peptona-sucrosa, mediante el raspado del cultivo, realizar succión del homogenizado varias veces con la pipeta pasteur y su expulsión sobre el medio; emplear la misma pipeta en toda la operación. Foto 28 6-19
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 6 Tomar, con la misma pipeta pasteur, unas gotas (2-3 ml) de esa suspensión del hongo (Foto 29) y depositarla en el interior de la ampolleta siguiendo estos pasos: Foto 29 Foto 30 Tomar con una mano la pipeta pasteur y con la otra la ampolleta con su respectivo tapón (obtenida del Paso 3). Sujetar la pipeta pasteur con los dedos índice y pulgar, y con el meñique de la misma mano sujetar por su extremo libre el tapón de algodón de la ampolleta, retirarlo cuidadosamente y sujetarlo firmemente contra el borde interior de la mano mientras vierte (con la pipeta) la suspensión del hongo en el fondo de la ampolleta, la cual contiene el papel filtro con la identificación del aislamiento. Tapar luego la ampolleta introduciendo suavemente en ella (Foto 30) el tapón, tal como está sostenido entre el meñique y la palma de la mano. Si el algodón del tapón entra en contacto con otra superficie o con alguna sustancia, se contamina, por lo que se debe desechar y remplazar con uno de los que se habían preparado (ver Paso 2) para estos casos. 6-20
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Paso 7 Cortar, con una tijera flameada, la parte del tapón que quedó por fuera de la ampolleta (Foto 31). Introducir finalmente el resto del tapón de algodón con la punta de la tijera hasta dejar 1 cm entre el tapón y el borde de la ampolleta (Foto 32). Paso 8 Colocar las ampolletas en una gradilla. Empujar luego el algodón hacia el fondo de cada una hasta que toque el trocito de papel filtro que lleva la identificación del hongo; utilizar para ello un objeto alargado (como la parte superior de un asa), el cual se flamea constantemente para evitar que se contaminen los tapones (Foto 33). La parte superior de la ampolleta, que no tiene algodón, se sellará después del proceso de liofilización (Paso 13). Paso 9 Una vez organizadas las ampolletas, llevarlas a un congelador a 0 C durante 15 minutos. Cuando las muestras se hayan congelado, se inicia el proceso de liofilización. Foto 31 Foto 32 Foto 33 6-21
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Foto 35 Foto 36 Foto 34 Paso 10 Colocar la gradilla en la campana del liofilizador y encenderlo (Foto 34). El aparato hace descender en su interior la temperatura hasta 55 C e inicia un proceso de secamiento de la muestra porque le extrae el agua mediante una bomba de vacío. Este proceso tarda entre 20 y 22 horas. Paso 11 Al día siguiente, apagar el liofilizador y retirar de él la gradilla con las ampolletas. Preparar luego una pistola de gas propano y proceder al estiramiento de las ampolletas en la parte opuesta a aquella en que está la muestra, es decir, hacer un cuello en cada una ablandando el vidrio con la llama y estirando la ampolleta por sus extremos (Fotos 35 y 36). El procedimiento requiere mucha precaución para evitar quemaduras en las manos por la llama. El objetivo de este paso es reducir el espacio por donde puede entrar aire (con humedad) a la muestra, antes de sellarla completamente. Paso 12 Una vez estiradas todas las ampolletas, colocarlas en el árbol del liofilizador insertando el extremo abierto de cada una en los soportes del árbol. De esta manera, el extremo que contiene la muestra quedará más visible (Foto 37). Repetir el proceso de secamiento durante 1 hora, aproximadamente. En este tiempo se eliminará la humedad que pudo haber entrado en la muestra durante el Paso 11. Foto 37 6-22
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Paso 13 Sin apagar el liofilizador, sellar al vacío las ampolletas, una por una, empleando la pistola de gas propano, derritiendo el vidrio con la llama donde se hizo el cuello o estiramiento (Foto 38). Una vez selladas, finaliza el proceso de liofilización. En caso de que se pierda el vacío al estar sellando una ampolleta, retirar esta parte de la ampolleta, remplazarla por una nueva y esperar que el vacío llegue al punto indicado para poder continuar con el sellado de las otras ampolletas. La duración de una muestra en almacenamiento, conservada mediante el proceso de liofilización, no se ha establecido formalmente; sin embargo, en nuestro laboratorio se han recuperado muestras liofilizadas que permanecieron almacenadas durante 30 años. La liofilización de muestras microbiológicas tiene, no obstante, una desventaja: para recuperar una muestra hay que romper toda la ampolleta y, por consiguiente, es necesario tener varias copias de cada una de las muestras liofilizadas para poder mantener una colección. Foto 38 6-23
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol 2. Conservación en papel filtro a 20 o C Este método permite conservar microorganismos durante períodos largos de tiempo. Materiales Papel filtro estéril, cortado en trozos pequeños de 1 cm 2 Incremento de P. griseola Pinzas Cajas petri estériles Agua destilada estéril Pipeta Sobres de papel mantequilla Pasos del proceso Paso 1 Cortar cuadritos (60-80) de papel filtro de 1 cm 2, colocarlos dentro de una caja petri o de un contenedor cerrado y esterilizarlos en autoclave. Paso 2 Colocar 10 cuadritos de papel filtro esterilizado sobre el medio de cultivo V8 en cada caja petri. 6-24
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Paso 3 Preparar una suspensión de conidias y micelio de un aislamiento del hongo, de la siguiente manera: Agregar agua destilada estéril sobre el aislamiento desarrollado en la caja petri. Raspar luego la superficie del aislamiento con la punta de la pipeta o una espátula hasta que se logre la suspensión. Tomar un poco de esa suspensión con la pipeta y colocar una gota en cada cuadrito de papel filtro esterilizado (en las cajas petri del Paso 2). Paso 4 Incubar las cajas a 24 C durante 12 días. Paso 5 Pasados los 12 días, retirar los cuadritos de papel filtro de las cajas petri de incubación con una pinza estéril, y cumpliendo con todas las condiciones de asepsia, depositarlos en una caja petri estéril vacía. Colocarlos invertidos (la cara en que está el hongo hacia abajo) para que no se enrollen al secarse. Secar estos cuadritos de papel filtro durante 7 días a 24 C. 6-25
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 6 Pasar los cuadritos secos (con una pinza estéril) a bolsitas de papel mantequilla estéril, las cuales se introducen, a su vez, en otra bolsa más grande del mismo material para almacenarlos (ver Fotos 42 y 43). Esta última bolsa, en la que se coloca toda la información referente al hongo P. griseola, se almacena a 20 C. 3. Conservación como suspensión en solución de peptona-sucrosa, en papel filtro a 20 o C Materiales Peptona al 10% Sucrosa al 20% Cajas petri Papel filtro cortado en trocitos de 0.5 cm (estériles) Pinza Espátula Pipetas Preparación de las soluciones de peptona y de sucrosa Ver F., 1. Liofilización, Paso 4. 6-26
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Pasos del proceso Paso 1 Tomar una caja petri que contenga un aislamiento esporulado del hongo y agregarle 2 ml de la solución de peptona-sucrosa (Foto 39). Paso 2 Raspar con una espátula estéril, o con la misma pipeta con que se agregó la solución, la superficie del aislamiento contenido en la caja petri para desprender las conidias del hongo (Foto 40). De este modo se obtiene una suspensión de conidias. Paso 3 Depositar con una pinza estéril 20 cuadritos de papel filtro en la caja petri del Paso 2 e impregnarlos con la suspensión del hongo en la solución de peptona-sucrosa (Foto 41). Foto 39 Foto 40 Paso 4 Retirar los cuadritos de papel filtro de esa caja petri con una pinza estéril y colocarlos en una caja petri estéril que tenga papel filtro en el fondo, para que se sequen a 24 C durante 7 días. Foto 41 6-27
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Paso 5 Transcurrido ese tiempo, guardar los cuadritos en sobres estériles de papel mantequilla (Foto 42) para almacenarlos a 20 C, escribiendo en ellos la información referente al hongo, como fecha de almacenamiento, nombre de la cepa, etc. (Foto 43). Foto 42 G. Prueba de almacenamiento Esta prueba es la forma práctica y confiable de garantizar que el aislamiento almacenado está libre de microorganismos contaminantes y ha sobrevivido a las condiciones del almacenamiento. Pasos del proceso Foto 43 Paso 1 Tomar uno de los cuadritos de papel filtro que había sido impregnado con la suspensión del hongo y que fue secado por 7 días a 24 C. Paso 2 Sembrar el cuadrito de papel filtro (muestra de almacenamiento) en medio de cultivo V8. Después de 5 días, el patógeno almacenado debe haber crecido en este medio de cultivo (Foto 44). Foto 44 6-28
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular Paso 3 Observar el crecimiento del hongo en el estereoscopio. Si presenta agentes contaminantes (hongos o bacterias diferentes), tanto la muestra observada como los demás cuadritos de papel filtro deberán desecharse, y se repetirá entonces el proceso de conservación. H. Recuperación del hongo almacenado 1. Conservado en suspensión liofilizada en ampolletas Materiales Ampolletas con el hongo liofilizado Solución de peptona al 10% Solución de sucrosa al 20% Cajas petri con medio de cultivo V8 Pipeta con chupo Mazo (de mortero) Servilleta estéril Pinza (Foto 45) Foto 45 6-29
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Foto 46 Foto 47 Paso 1 Romper la ampolleta que contiene el hongo golpeándola con un mazo (Foto 46) por el extremo opuesto a aquél en que está el hongo liofilizado (la servilleta sirve para amortiguar el golpe y la rotura del vidrio). Retirar con la pinza el algodón que está dentro de la ampolleta (Foto 47). Paso 2 Depositar con la pipeta, en la mitad abierta de la ampolleta, cuatro gotas de la solución de peptonasucrosa (ver F., 1. Liofilización, Paso 4). Las conidias liofilizadas del hongo quedan así suspendidas en la solución y pueden retirarse de la ampolleta (Foto 48). Paso 3 Sembrar la suspensión de conidias del hongo de la ampolleta en una caja petri que contenga el medio de cultivo V8, para reiniciar el proceso de crecimiento del microorganismo (Foto 49). Foto 48 Foto 49 6-30
Guía Práctica 6: Phaeoisariopsis griseola Enfermedad: Mancha angular 2. Conservado en papel filtro a 20 o C Pasos del proceso Paso 1 Trasladar, con una pinza estéril, uno de los cuadraditos de papel filtro que portan el hongo que habían sido almacenados en bolsitas a 20 C (ver F., 2. Conservación en..., Paso 6) a una caja petri (Foto 50) que contenga el medio de cultivo V8. Paso 2 Depositar 1 o 2 gotas de la solución de peptonasucrosa en los cuadritos de papel filtro que contienen el hongo; de esta manera se hidrata el hongo y así podrá ser esparcido sobre toda la superficie del medio (Foto 51), usando la punta de la pipeta. De esta manera se aumenta el campo de crecimiento del hongo. Foto 50 Paso 3 Incubar las cajas petri del paso anterior a 24 C. El desarrollo del hongo se reactivará y después de 12 días estará listo para ser usado en los procesos microbiológicos que se hayan planeado. Foto 51 6-31
Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol 3. Conservado a 20 o C en papel filtro de suspensión en peptona-sucrosa Pasos del proceso Paso 1 Sacar de los sobres de papel mantequilla (ver F., 3. Conservación como, Paso 5) de 1 a 2 trocitos de papel filtro que porten el hongo almacenado en suspensión de peptona-sucrosa, y sembrarlos en el medio de cultivo V8 contenido en las cajas petri. Paso 2 Incubar las cajas petri del paso anterior a 24 C. Después de 2 o 3 días se puede ver el crecimiento del hongo. A los 12 días después de la incubación, el hongo estará listo para ser incrementado. 6-32