MICROSCOPÍA Trabajo Práctico N 6 MICROBIOLOGÍA (Octubre 2012) Claudia Herrmann cherrmann@iibintech.com.ar 1
MICROSCOPÍA Microscopio Óptico Campo claro Campo oscuro Contraste de fase Fluorescencia Confocal Microscopio Electrónico De transmisión (MET) De barrido (MEB) Microscopio de Fuerza Atómica 2
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1) Microscopio de campo claro Ocular (X10) Objetivo (X20, X40, X60, X100) Muestra Fuente Luz Condensador 4
1) Microscopio de Campo Claro La muestra debe ser delgada (casi transparente) Fijación Tinción Para aumentar la diferencia de contraste entre los microorganismos y el medio en las muestras es necesario realizar tinciones. Levaduras sin teñir Bacterias Tinción Gram 5
2) Microscopio de campo oscuro Objetivo Muestra Condensador Placa Opaca Fuente Luz - Se coloca una placa opaca en el condensador. d - Solo los rayos reflejados o difractados entran al objetivo. - Se obtiene una imagen con fondo oscuro y la muestra iluminada. - No es necesario fijar las muestras (Buen contraste entre la muestra y el fondo) 6
FUNDAMENTO Rayos No Desviados Lente del Objetivo Rayos Desviados por la muestra Muestra Lente del Condensador Placa Opaca Fuente de Luz 7
Campo Claro vs. Campo Oscuro Levaduras Chlamydomonas 8
3) Microscopio de Contraste de fase - Se basa en el retraso de las ondas de luz al atravesar objetos de distintos índices de refracción (densidades), aprovechando y amplificando dichos retrasos. - Convierte pequeñas diferencias i en índices de refracción variables y detectables por el ojo. - Permite observar estructuras sin necesidad de fijar las muestras. Obje etivo Anillo de fase Muestra Condensador - Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas de la muestra; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas Fuente Luz Disco Anular 9
3) Microscopio de Contraste de Fase La luz, al atravesar objetos con distintos índices de refracción, experimenta retrasos (desfases), sin embargo, estos no son tan notorios como para poder percibirlos. El MCF, mediante el diafragma anular y el anillo de fase, acentúa dichos retrasos, haciendo que zonas con distintos índices de refracción se traduzcan en una variación de contraste la cual puede ser observado. rayos en fase -1/4-1/4 Se observan imágenes con el fondo claro (rayos no desviados) y las muestras oscuras con limites bien definidos. ANILLO DE FASE Discos transparentes con un diseño en relieve Objetivo Los rayos desviados se cancelan con los no desviados 10
3) Microscopio de Contraste de Fase Células l Vivas Microscopio de Campo Claro Microscopio de Contraste de Fase No hay buen contraste con el fondo No se observan hay límites claros No se distinguen estructuras internas Buen contraste de células con el fondo Límites celulares evidentes (oscuros) Se distinguen estructuras internas 11
4) Microscopio de fluorescencia Filtro de emisión Muestra Condensador de Campo Oscuro Lámpara Filtro de excitación 12
MUESTRAS - Pueden presentar autofluorescencia ó estar teñidas con fluoróforos: - Anticuerpos conjugados - Hoecht (tiñe DNA) - Expresión de proteínas de fusión fluorescentes (GFP) - Pueden estar vivas o fijadas Microscopio Invertido - Son exitadas excitadas a una longitud de onda y fluorescen emitiendo a una longitud de onda mayor. 13
5) Microscopio confocal - Las muestras deben estar teñidas con fluoróforos o presentar autofluorescencia - Las muestras pueden estar vivas o fijadas - Las muestras son excitadas a una longitud de onda y fluorescen emitiendo a una longitud de onda mayor. - Solo los haces de luz que pasan por el foco llegan al detector. - Se observan planos. 14
5) Microscopio confocal - Un Rayo Láser se hace pasar a través del pinhole, este haz de luz pasa a través del espejo y luego a través del lente objetivo el cual llo enfoca sobre la muestra. - La luz emitida por la muestra es recibida por el lente objetivo y reflejada por el espejo. - Esta luz pasa a través de la apertura pinhole que no permite el paso de la fluorescencia originada por los planos fuera de foco. - Sólo la luz del plano focal llega al detector. 15
Algunas Aplicaciones i 1) Análisis de colocalización. 2) Inmunofluorescencias y detección de sondas. 3) Series Z (Reconstrucciones 3-D). 4) Time Series (Series Temporales). 5) FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching). 16
5) Microscopio confocal 1- Observación de una imagen desde el eje z. 2- Se registran imágenes correspondientes a diferentes planos xy. 3- Se reconstruyen imágenes de la muestra observadas desde los ejes x ó y. 17
5) Microscopio Confocal Microscopia de fluorescencia Microscopia Confocal Escherichia coli 18
6) Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM) - Se utiliza un haz de electrones e imanes como lentes. Fuente emisora de electrones -Los electrones se transmiten a través de la muestra (poca penetración: aprox. 10-100 nm) - Muestra extremadamente fina y de baja densidad Contraste con el fondo débil. TINCIÓN: absorbe electrones y produce una imagen más oscura de la región teñida (osmio, tungsteno, plomo o uranio) -Se genera vacío para evitar que los electrones colisionen con los átomos del aire y se desvíen. Condensador Muestra Objetivo - Tratamiento de las muestras: Lente - Fijación proyectora - Corte con micrótomo/criofractura - Tinción con sales de metales pesados. Pantalla - No explora superficies. El haz de electrones incidente atraviesa la muestra observada y los detalles finos o ultra-estructuras son capturadas en una pantalla (fósforo). 19
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CARACTERÍSTICAS del MET Objetos < 0.2 um (i (virus, estructuras t celulares ll it internas, etc.) )db deben observarse por ME (no pueden ser discriminadas con la resolución del MO) El poder de resolución del ME es mucho mayor que el de los MO debido a que la longitud de onda de los electrones es 100.000 veces menor que la de la luz visible. El contraste es el resultado de la dispersión diferencial de electrones por la muestra. El grado de dispersión es función del número y masa de átomos en la trayectoria de los electrones. Las células (mamífero y bacterias) son demasiado gruesas para ser examinadas satisfactoriamente en preparaciones enteras. La observación de su estructura interna exige que sean fijadas, deshidratadas, embebidas en plásticos y seccionadas (50 nm aprox). Los cortes luego se tiñen con sales de metales pesados y se montan. En el MET los rayos X generados revelan la estructura interna, tamaño y distribución de partículas, red cristalina, interfases y defectos puntuales de la red atómica, etc. El MET permite estudiar la composición química de la muestra. Puede hacerse un detallado estudio cristalográfico del material investigado. 21
6) Microscopio electrónico de transmisión (TEM) Célula eucariota Bacteria (Brucella) 1 um 22
7) Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) ó Scanning Electron Microscopy (SEM) -Se utiliza un haz de electrones e imanes como lentes. -Se genera vacío para evitar que los electrones colisionen con los átomos del aire y se desvíen. -Se captan los electrones emitidos por el objeto (no transmitidos). -Tratamiento de las muestras: -Fijación -Deshidratación -Cobertura con metales pesados. -Se observan topologías de superficies. 23
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La muestra es irradiada con un haz muy estrecho de electrones hace que la muestra desprenda electrones de baja energía (secundarios) que pueden ser recogidos sobre una placa cargada positivamente (ánodo) generando de este modo una señal eléctrica que es puede ser utilizada para generar una imagen de la muestra. El generador de barrido hace que el haz de electrones atraviese la muestra siguiendo un rastreo de barrido 25
7) Microscopio electronico de barrido (SEM) Pelos radiculares Bacterias (Rhizobium) 26
7) Microscopio de Fuerza Atómica (MFA) Microscopio mecano-óptico Resolución < 1nm Registra la topología de la muestra FUNDAMENTO: Se basa en la detección de las fuerzas atómicas (del orden de los nanonewton) ó moleculares de interacción entre una punta y la superficie del material estudiado. El MFA ha sido esencial en el desarrollo de la nanotecnología COMPOSICIÓN Cantilever: dimensión aprox. 200 um. Láser: La flexión del cantilever es registrado mediante un haz láser (medición óptica) que se refleja en su parte posterior para luego alcanzar un fotodetector. Punta: cristal de forma piramidal o cónica Punta: cristal de forma piramidal o cónica. Sus dimensiones bordean los 5 nm y 100 A de diámetro. 27
7) Microscopio de fuerza atómica (MFA) La muestra es movida en las tres direcciones, mientras el cantilever traza la superficie de la muestra en detalle. Todos los movimientos son controlados por una computadora. La fuerza de interacción entre la superficie de la muestra y la punta hacen que el cantilever se flexione. Un detector mide esta flexión conforme la punta barre la superficie y con ello se obtiene bi un mapa topográfico. 28
7) Microscopio de fuerza atómica (AFM) Algunos artefactos de la MFA Muestra Imagen Muestra Imagen 29
7) Microscopio de fuerza atómica (AFM) Proteína de unión a ADN (23 kda) ADN (500 pb) 30
Microscopía Algunas muestras requieren de TINCIONES para ser observadas por un determinado microscopio Cuáles son las tinciones más comunes que podemos utilizar en microbiología para observar y distinguir entre distintos microorganismos? 31
TINCIONES Colorantes Catiónicos: se combinan con los constituyentes celulares cargados negativamente tales como ácidos nucléicos, polisacáridos ácidos y superficies celulares. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina. Aniónicos: se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como numerosas proteínas. Ejemplos: Eosina, Fucsina acida y Rojo congo. Liposolubles: se combinan con las sustancias grasas. Ejemplos: Sudan negro. 32
Tinciones 2 TIPOS Positivas: Colorantes que tiñen al microorganismo y no al medio. Simples: uso de un solo colorante. Sirven para distinguir formas. Diferenciales: uso de un colorante inicial y luego un colorante de contraste. Sirven para diferenciar distintos tipos de células (Ejemplo: tinción Gram) Negativas: Colorantes que no tienen afinidad por los componentes celulares (Ejemplo: nigrosina). Tiñen al medio y no a las bacterias, sirven para ver células con cápsulas de mucopolisacáridos. 33
Tinción Gram Las bacterias gram+ y gram- se tiñen de forma distintai debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares (PC). La PC bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El componente de la PC que confiere rigidez es el peptidoglicano. PC Gram+ Gram- Gruesa capa de peptidoglicano (80-90%) Ácidos teicóicos Delgada capa peptidoglicano (10-20%) Membrana exterior Fosfolípidos Lipopolisacáridos id Lipoproteínas 34
Tinción Gram Permite distinguir dos grandes grupos de bacterias que poseen diferencias estructurales en la PC. Peptidoglicano Polimero de N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico unidos por péptidos. 35
GRAM POSITIVO GRAM NEGATIVO 36
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Esquema de la PC Bacteriana Gram POSITIVAS Gram NEGATIVAS 38
TINCIÓN GRAM Protocolo 1) Preparar un extendido A partir de cultivos en medio líquido: Se toma un poco de cultivo con el ansa y se desparrama sobre un portaobjeto. A partir de cultivos en medio sólido (FRESCOS): Se apoya el ansa sobre una colonia, luego se coloca una gota de agua sobre el portaobjeto y se desparrama el material con el ansa. 39
TINCIÓN GRAM 2) Fijar el material Gram + Gram - Esperar a que la muestra seque, Pasar el portaobjeto sobre el mechero. 3) Cubrir con Cristal violeta Dejar el colorante 60 segundos. 4) Lavar con agua 40
TINCIÓN GRAM 5) Agregar el mordiente (LUGOL) Lugol: solución de I 2 y KI Dejar actuar por 60 seg. Lava con agua. Gram + Gram - 6) Agregar el decolorante Decolorante: solución de acetona y etanol. Aplicar por 5 segundos El decolorante produce una DESHIDRATACIÓN de la pared de péptidoglicano. Este se contrae, se cierran los poros y se transforma en una barrera física impermeable al solvente la cual impide el lavado del cristal violeta que queda atrapado en el interior de las bacterias Gram+. 41
TINCIÓN GRAM 7) Agregar el colorante de contraste (Safranina) Gram + Gram - 8) Lavar con agua Gram + Gram - Violeta Azulado Rosado 42
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TINCIÓN GRAM Rosa (Gram -) Violeta (Gram +) 45
TINCIÓN DE ESPORAS (Técnica Schaeffer-Fulton) Endospora bacteriana: Estructura altamente resistente al calor y a condiciones ambientales desfavorables. El principal desencadenante de la formación de esporas es la falta de nutrientes. Se observan en los géneros Bacillus y Clostridium (Gram +). Altamente resistentes al calor, desecación, ácidos, álcali y desinfectantes. Estructura 46
Clasificación en función de su posición Bacillus cereus: central, ovalada, no deformante Bacillus subtilis: subterminal, cilíndrica, no deformante Clostridium: terminal, ovalada, deformante 47
Tinción de Esporas Protocolo 1) Preparar el extendido y fijar por calor. 2) Cubrir con verde de malaquita y calentar por 3 minutos. 3) Lavar con agua. 4) Agregar colorante de contraste t (safranina). 5) Lavar con agua. 48
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Tinción de Ácido Resistencia (Ziehl-Neelsen) Permite distinguir bacterias del género Mycobacterium Estas poseen Permite distinguir bacterias del género Mycobacterium. Estas poseen en su pared acido micólico (hidroxilípido de cadena ramificada) que se encuentra acomplejado al péptido glicano de la pared celular. 50
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REACTIVOS: 1. Fucsina Fenicada: Colorante soluble en los componentes lipídicos Cuando se aplica calor a la muestra logra atravesar la barrera de ácido micólico y tiñe de rojo los componentes lipídicos de la PC. 2. Alcohol Ácido: decolorante 3. Azul de Metileno: Colorante de contraste. Tiñe las bacterias que no son ácido resistentes. 52
Protocolo: Tinción de Ácido Resistencia (Ziehl-Neelsen) 1) Preparación del extendido y fijación por calor. 2) Cubrir el portaobjeto con fucsina fenicada (fucsina básica con fenol). 3) Calentar hasta emisión de vapores. 4) Lavar con agua. 5) Agregar decolorante (HCl 3%, EtOH 95%). 6) Lavar con agua. 7) Agregar el colorante de contraste (Azul de metileno). 8) Lavar con agua. 53
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Etapas de Formación de la Espora 55