ESPECTROFOTOMETRÍA Lic. José Manuel Arriaga Romero
PRINCIPIOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS Características de la luz Longitud de onda Es igual a la distancia entre dos puntos idénticos sobre ondas de luz consecutivas Mientras más cerca estén una onda de otra La longitud de onda es más pequeña La luz contiene mayor cantidad de energía Hay mayor número de fotones en una distancia dada
Mientras menor es la longitud de onda, hay mayor número de fotones en una distancia dada Mayor cantidad de fotones representa mayor energía Las longitudes de onda más pequeñas representan mayor cantidad de energía que las longitudes de onda más grandes
Espectro electromagnético La unidad de la longitud de onda es el nanómetro 1 nm = 10-9 m Se expresa por la letra griega lambda (λ) En base a las longitudes de onda el espectro electromagnético se divide en tres rangos Luz ultravioleta (UV) 190 nm a 390 nm Luz visible (VIS) 390 nm a ± 750 nm Luz infrarroja (IR) mayor de 750 nm
La luz en el rango ultravioleta es invisible La luz en el rango visible excita las células retinianas Percepción de colores La luz en el rango infrarrojo se percibe como calor y sus longitudes de onda se expresan en μm 1 μm = 10-6 m
Las longitudes de onda menores a las del rango ultravioleta incluyen los rayos X y la radiación gamma Tienen tanta energía que penetran los tejidos Las longitudes de onda mayores a las del rango infrarrojo (medidas en cm) incluyen a las ondas de radio
Curvas de espectro de absorción Cada color visible corresponde a un rango de longitudes de onda Cada soluto coloreado absorbe un patrón único de longitudes de onda cuyas energías corresponden a los niveles de energía de los electrones en los enlaces químicos
El color percibido de una solución será dominado por las longitudes de onda que son transmitidas (y no por las absorbidas) por el soluto Las longitudes de onda absorbidas y transmitidas son complementarias una de otra El color visible de una solución será el complemento de las longitudes de onda que son absorbidas
Una solución de hemoglobina absorbe luz verde a 540 nm y se ve de color rojo Una solución de bilirrubina absorbe luz azul a 450 nm y se ve de color amarillo
El patrón de absorbancias a diferentes longitudes de onda es tan distintivo que un soluto puede un soluto puede ser identificado por su espectro de absorción Una curva de espectro de absorción es una gráfica que muestra los patrones de absorbancias de un soluto a diferentes longitudes de onda
Otro uso del espectro de absorción es para decidir la longitud de onda a la que se hará un análisis cuantitativo Debe elegirse la longitud de onda a la que la absorbancia es mayor, debido a que aún una pequeña cantidad de soluto puede producir na cantidad medible de absorbancia
En los ejemplos anteriores la hemoglobina es medida a una longitud de onda de 540 nm y la bilirrubina a 450 nm Debe elegirse el pico de absorción que presente el mayor ancho, aún si hay otro con mayor pico de absorción pero más estrecho
Transmisión y absorción de luz Un espectrofotómetro utiliza una lámpara de alta intensidad y mide la cantidad de luz que penetra la solución coloreada La proporción de luz que penetra la solución se llama transmitancia (T)
Se expresa como porcentaje (%T) de la luz que atraviesa la solución (I) en relación a la cantidad de luz que entra a la solución (l o ) l o es la luz incidente y l es la luz transmitida
La absorbancia se define como el logaritmo negativo de la transmitancia A = - log T = - log l/l o La fórmula simplificada para su cálculo, habiendo aplicado una transmitancia de 100 % para l o y transformando l en %T, es: A = 2- log %T
Tiene la ventaja que hay proporcionalidad directa con la concentración de soluto A mayor concentración de soluto mayor absorbancia, y viceversa Esto permite obtener una gráfica lineal cuando se grafican las absorbancias de luz obtenidas con diferentes concentraciones de soluto Llamada curva de calibración
Ley de Beer Es la expresión formal de la relación entre la absorbancia y la concentración de soluto Se basa en tres supuestos La luz que incide sobre el soluto es monocromática (una sola longitud de onda) El soluto que está siendo analizado es el único coloreado presente en la solución La única luz que está siendo medida proviene de la fuente de luz analítica
La adherencia a estas tres condiciones es difícil Hay limitaciones inherentes a la precisión en la medición de la cantidad de luz transmitida El %T es una función logarítmica, por lo que deben evitarse las lecturas entre 95 y 100 %T y entre 0 y 10 %T
Calibración Si todas las condiciones son óptimas La absorbancia de una solución debiera ser proporcional a la concentración de su soluto coloreado Una solución calibradora debiera ser suficiente Si se han cumplido con las condiciones sólo se necesita Poner el espectrofotómetro en 0 %T (oscuridad completa = absorbancia infinita) Poner el espectrofotómetro en 100 %T (falta completa de color = absorbancia 0)
La calibración se simplifica con la fórmula siguiente: AA dddddd dddddddddddddddddddddd AA dddddd cccccccccccccccccccc = CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC dddddd dddddddddddddddddddddd CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC dddddd cccccccccccccccccccc Reordenando se obtiene la fórmula de Beer-Lambert: Concentración del desconocido = AA dddddd dddddddddddddddddddddd AA dddddd cccccccccccccccccccc X Concentración del calibrador Que se resume como: C M = AA MM AA SSSS X C St C M = concentración del soluto en la muestra A M = absorbancia del soluto coloreado en la solución de la muestra C St = concentración del soluto en el calibrador A St = Absorbancia del soluto coloreado en la solución del calibrador
La espectrofotometría es un método analítico que usa las propiedades de la luz para mediciones cualitativa y cuantitativas. La medición depende tanto de la longitud de onda como de las propiedades de la partícula de luz.