Caracterización antigénica de Ascaris suum mediante SDS-PAGE y Western blotting

Caracterización antigénica de Ascaris suum mediante SDS-PAGE y Western blotting E. Frontera *, F.J. Serrano, A. Carrón, J.A. Mora, J.E. Pérez, D. Reina Cátedra de Parasitología y Enfermedades Parasitarias, Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura, Avda. de la Universidad s/n, 10071 Cáceres frontera@unex.es RESUMEN Se ha llevado a cabo un estudio, mediante SDS-PAGE, de la composición antigénica de Ascaris suum, previa separación de algunas de las estructuras anatómicas del mismo, tales como esófago, cutícula, ovario, útero y líquido pseudocelómico, con la finalidad de intentar reconocer aquellas fracciones antigénicas interesantes en el inmunodiagnóstico. Se identificó un amplio grupo de bandas proteicas en todos los extractos antigénicos caracterizados, de las cuales, las que se encuentran entre los 13-16 kda y 33-66 kda son comunes a la mayoría de ellos. Las fracciones inferiores a 20 kda no indujeron una producción de IgG detectable en animales hiperinmunizados con los antígenos anteriormente mencionados. Los extractos antigénicos uterino y ovárico son los que desencadenaron una mayor respuesta inmune humoral en los animales, mientras que el esofágico pareció ser el de menor inmunogenicidad. PALABRAS CLAVE: Ascaris suum Antígenos Caracterización Inmunodiagnóstico INTRODUCCIÓN Ascaris suum, el gusano redondo del cerdo, y Ascaris lumbricoides, han sido intensamente estudiados a lo largo del tiempo. Ambos parásitos son cosmopolitas, encontrándose el 25 % de la población humana infectada por A. lumbricoides, correspondiendo a la del tercer mundo los mayores índices de parasitación (Crompton, 1989; Chan et al., 1994). En el cerdo, A. suum se muestra como un parásito cada vez más prevalente (Kennedy, * Autor para correspondencia Recibido: 4-7-00 Aceptado para su publicación: 16-1-01

154 E. FRONTERA et al. 1988; Roepstorff & Nansen, 1994). Este helminto presenta un ciclo evolutivo directo, detectándose sobre todo en explotaciones intensivas que tienen deficientes instalaciones y manejo. No obstante, en explotaciones extensivas, donde se cría la inmensa mayoría del porcino ibérico de nuestro país, la importancia de la parasitosis que A. suum protagoniza es muy elevada, alcanzando cotas de hasta el 48 % en el porcino ibérico de Extremadura (Frontera, 1998). En el cerdo, los síntomas son escasos, presentándose como una parasitosis que afecta sobre todo a la producción (Murrell, 1986; Roepstorff & Nansen, 1994), con importante reducción en la ganancia de peso (Stewart & Hale, 1988) y decomisos de los hígados en matadero. A pesar de ello, existen escasas actuaciones que se encaminen a diagnosticar fidedignamente esta parasitación. Resulta por tanto evidente que cualquier avance en los estudios de los antígenos apropiados para su utilización en ensayos serodiagnósticos, podría suponer enormes ventajas económicas y sanitarias para todo el sector agroganadero de nuestro país y del resto del mundo. Varios autores han caracterizado antigénicamente al parásito completo o algunas de sus partes (Justus & Ivey, 1969; Torres & Barriga, 1974) por diversas técnicas como la difusión doble en agar o la inmunoelectroforesis. Sin embargo, este trabajo supone la primera aportación a la caracterización, mediante SDS-PAGE, del antígeno esofágico y, además, en muy pocas ocasiones, se han caracterizado los distintos extractos antigénicos por Western blotting, técnica que se ha aplicado en el presente estudio a todos los extractos somáticos del parásito. Así pues, en este trabajo, el objetivo fue el estudio y caracterización de distintos extractos antigénicos de Ascaris suum, mediante la técnica de SDS-PAGE, enfrentándolos posteriormente a sueros de cerdos hiperinmunizados con los mismos, determinando mediante Western blotting el mayor o menor grado de reactividad de sus fracciones proteicas, añadiendo, con este trabajo, información adicional y práctica para nuevos campos inmunodiagnósticos de la ascariosis porcina. Obtención de antígenos MATERIAL Y MÉTODOS Se procedió a la recolección y disección de individuos adultos de A. suum para la obtención de los distintos antígenos. Los helmintos fueron recogidos de cerdos de diferentes mataderos de la región extremeña, y detectados mediante la palpación directa in situ de diferentes tramos de intestino delgado. Las hembras fueron fijadas sobre un soporte, extrayendo el fluido pseudocelómico mediante succión con jeringa. Posteriormente, se realizó una incisión longitudinal, extrayendo las dos ramas uterinas, los ovarios, el esófago (de la porción más cervical del verme) y finalmente la cutícula. Preparación de los antígenos Aproximadamente 1 gr de los extractos somáticos aislados, fue homogeneizado junto a 4 ml de PBS (1x) estéril. El líquido sobrenadante resultante fue sometido a sonicación a

CARACTERIZACIÓN ANTIGÉNICA DE Ascaris suum 155 las condiciones de 175 W, 50 % de potencia y ciclos de segundos alternos durante 20 minutos en un sonicador Sonics & Materials Vibra-Cell Mod. 600-att dual outpunt, y, finalmente, centrifugado a 1.500 g, durante 30 minutos a 4 C. El producto resultante fue conservado a 80 C hasta su posterior utilización. El líquido pseudocelómico fue directamente centrifugado a las mismas condiciones y pasado a través de un filtro de 0,28 m conservándolo a 80 C hasta su uso. Suero hiperinmune Se utilizaron 10 animales de raza ibérica, de ambos sexos, con un peso entre 22-34 Kg y 3,5 meses de edad. Estos animales fueron obtenidos, al destete, del Centro de Selección y Reproducción de la Consejería de Agricultura y Medio Ambiente de la Junta de Extremadura, siendo hijos de madres coprológicamente negativas a A. suum y desparasitadas reiteradamente. Se mantuvieron en estancias higiénica y sanitariamente correctas, sin posibilidad de incorporación de elementos de diseminación de A. suum. Se establecieron 5 lotes de 2 cerdos cada uno, de forma que cada lote fue inmunizado con un antígeno distinto en adyuvante completo de Freund: antígeno cuticular (ACU), antígeno esofágico (AEF), antígeno uterino (AUT), antígeno ovárico (AOV) y antígeno pseudocelómico (APS). El protocolo de inmunización se estableció mediante 3 inmunizaciones separadas quince días a una dosis de 10 g de antígeno/kg peso vivo. SDS-PAGE Las diferentes bandas proteicas de los extractos antigénicos aislados, fueron separadas mediante SDS-PAGE en geles al 12 % de poliacrilamida y en condiciones reductoras (Laemmli, 1970), en una cubeta de electroforesis BIO-RAD Mod. Protean II xi Cell. Con el fin de identificar cada fracción según su peso molecular y naturaleza, se hizo correr junto a los extractos antigénicos, un patrón de proteínas de peso molecular conocido y, finalmente, el gel fue teñido con las tinciones de azul de Coomassie y argéntica. La identificación de las distintas bandas se estableció por comparación con los pesos moleculares de las proteínas patrón utilizadas. La intensidad de cada banda se midió según la escala estándar de grises (0-256) de la imagen digitalizada y computerizada (programa TNImage 3.0.8a). Western Blotting Una vez que las fracciones proteicas fueron separadas mediante SDS-PAGE, se realizó la transferencia de las mismas a una membrana de nitrocelulosa (Whatman n.º 1), utilizando para ello el aparato BIO-RAD Mod. Transblot SD Semi-dry Transfer Cell. Sobre esta membrana se llevó a cabo la incubación de los sueros hiperinmunes en solución Tris-Base (TBS) a la dilución 1:8, previo bloqueo de la misma con seroalbúmina bovina (BSA) al 5 %, usando una placa de incubación de membranas Immunetics Mod. Miniblotter 25. Tras esta incubación, se añadió un conjugado anti-igg porcina marcado con peroxidasa (Sigma, A-5670) a una dilución 1:2000 en TBS + BSA al 1 %, finalizando la técni-

156 E. FRONTERA et al. ca mediante la adicción de un sustrato (cloronaftol) que al unirse al complejo antígeno-anticuerpo, permite observar dicha unión mediante una reacción colorimétrica. La digitalización de las imágenes y la realización de la imagen fotográfica se realizó con un escaner HP Scanjet II cx y cámara 35 mm Polaroid Digital Palette Cl 5000S. RESULTADOS Caracterización antigénica de los adultos de A. suum El estudio de la composición antigénica de los diferentes extractos, permitió comprobar su naturaleza compleja, siendo los ACU, AUT y AOV los que presentan un mayor número de bandas, mientras que las menos numerosas aparecieron en el APS (Fig. 1). Todos los extractos presentaron varias bandas comunes entre sí, principalmente los grupos de proteínas comprendidos entre 33-66 kda y entre 13-16 kda, que fueron los más intensamente teñidos en todos los casos. En el sentido opuesto, el grupo comprendido entre 17 y 22 kda apenas fue detectable. El estudio del perfil proteico indica que el ACU presentó múltiples bandas, destacando sobre todo las correspondientes a 190, 96, 64, 36-47, 23 y 16 kda. Algo menos numerosas fueron las bandas del AEF, resaltando las de muy alto peso molecular y las correspondientes a 75, 64, 54, 44 y 15 kda. El AUT presentó también multitud de bandas, destacando las de 190, 64, 54, 44 y 17 kda. Lo mismo ocurrió con el AOV compartiendo casi todas las bandas con el AUT, aunque con mayor intensidad en las de alto peso molecular y con menor intensidad en las de bajo peso molecular. Finalmente, el APS presentó un bajo número de bandas pero muy fuertemente teñidas, correspondiendo a proteínas de 190, 132, 90, 40 y sobre todo la de 14 kda. En la Tabla 1, se indican las fracciones proteicas más intensamente teñidas, cuya presencia coincide en la mayoría de los 5 antígenos estudiados. Tabla 1 Principales fracciones proteicas compartidas por los cinco antígenos estudiados mediante la técnica SDS-PAGE 190 kda 64 kda 54 kda 36-47 kda 17 kda ACU + + + AEF + + + AUT + + + + + AOV + + + + + APS + +

CARACTERIZACIÓN ANTIGÉNICA DE Ascaris suum 157 Fig. 1. Composición antigénica de los diferentes extractos de A. suum separadas por SDS-PAGE (Calle 1: Patrón de peso molecular, Calle 2: AEF, Calle 3: AUT, Calle 4: AOV, Calle 5: ACU, Calle 6: APS).

158 E. FRONTERA et al. Antígenos de A. suum reconocidos por los sueros de cerdos inmunizados Según se muestra en la Figura 2, los sueros homólogos frente al APS reconocieron sobre todo la fracción de 28 kda, mientras que los heterólogos reaccionaron frente a la zona correspondiente a 80-190 kda. De igual manera, frente al ACU se observó una mayor reacción en las bandas de 190 y 65 kda, tanto por parte de los sueros homólogos como heterólogos (Fig. 3). En otro de los Western blotting, frente al AOV, destacó la fuerte intensidad de reacción de los sueros con el antígeno homólogo y con el antígeno uterino, especialmente en las bandas en torno a los 57, 64 y 31 kda (Fig. 4). Igualmente, frente al AUT, el perfil de respuesta inmune es muy semejante al observado en el del AOV, destacando principalmente dos zonas de reacción con los sueros homólogos en torno a los 112 kda y 54-63 kda (Fig. 5). Por último, frente al AEF, la mayor reacción frente al homólogo se observa entre 75-97 kda y 37 kda, aunque estas fracciones son reconocidas por otros sueros, especialmente de uno de los cerdos inmunizados con el ACU (Fig. 6). 205 > 97 > 66 > 48 > 42 > 28 > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fig. 2. Antígenos del extracto APS reconocidos por los sueros de cerdos inmunizados (Calles 1y2:cerdos inmunizados con ACU, Calles 3y5:con AEF, Calles 4y7:con AUT, Calles 6y9:con AOV, Calles 8y10:con APS). En general, los sueros hiperinmunes reaccionaron sólo con los componentes antigénicos mayores de 20 kda, excepto frente al AUT, en el que la reacción fue más intensa con reconocimiento de bandas con pesos moleculares algo menores.

CARACTERIZACIÓN ANTIGÉNICA DE Ascaris suum 159 205 > 97 > 62 > 55 > 42 > 22 > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fig. 3. Antígenos del extracto ACU reconocidos por los sueros de cerdos inmunizados (Calles 1y2:cerdos inmunizados con ACU, Calles 3y5:con AEF, Calles 4y7:con AUT, Calles 6y9:con AOV, Calles 8y10:con APS). 205 > 97 > 66 > 55 > 45 > 29 > 17 > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fig. 4. Antígenos del extracto AOV reconocidos por los sueros de cerdos inmunizados (Calles 1y2:cerdos inmunizados con ACU, Calles 3y5:con AEF, Calles 4y7:con AUT, Calles 6y9:con AOV, Calles 8y10:con APS).

160 E. FRONTERA et al. 205 > 97 > 66 > 48 > 42 > 28 > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fig. 5. Antígenos del extracto AUT reconocidos por los sueros de cerdos inmunizados (Calles 1y2:cerdos inmunizados con ACU, Calles 3y5:con AEF, Calles 4y7:con AUT, Calles 6y9:con AOV, Calles 8y10:con APS). 205 > 97 > 66 > 50 > 42 > 20 > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fig. 6. Antígenos del extracto AEF reconocidos por los sueros de cerdos inmunizados (Calles 1y2:cerdos inmunizados con ACU, Calles 3y5:con AEF, Calles 4y7:con AUT, Calles 6y9:con AOV, Calles 8y10:con APS).

CARACTERIZACIÓN ANTIGÉNICA DE Ascaris suum 161 Los antígenos que mostraron un mayor reconocimiento de fracciones proteicas a partir de los sueros hiperinmunes fueron el AOV y el AUT, siendo el AEF y el ACU los de menor intensidad. Aunque en todos los casos los sueros heterólogos reconocieron un número elevado de fracciones, el número de bandas y la intensidad de tinción fue mayor en los sueros homólogos. DISCUSIÓN El estudio de la composición proteica de las diferentes partes de A. suum, ha demostrado, en todos los casos, que se trata de mosaicos antigénicos muy complejos. Algunos autores no han evidenciado una composición tan compleja (Germán, 1993), lo cual pudiera ser debido a que hemos utilizado posiblemente técnicas de tinción más sensibles. Puede influir también, de manera importante, el hecho de haber estudiado por separado, distintas estructuras anatómicas y no el parásito completo, permitiendo la diferenciación de bandas proteicas de similar peso molecular. Nuestros resultados se asemejan a los obtenidos por Wang et al. (1994), que identifican numerosas bandas compartidas con A. lumbricoides entre 14 y 230 kda. Un aspecto a resaltar es la presencia de numerosas bandas compartidas por los distintos extractos antigénicos de este estudio (Tabla 1), sobre todo entre los AUT y AOV. Este hecho está en concordancia con diversos trabajos como el de Wu & Foor (1982), al comparar las características antigénicas de los oocitos, por un lado, y del oviducto y útero por otro, sugiriendo que no existe una importante variación antigénica en la evolución de los oocitos a huevos fertilizados del útero. Todos estos componentes comunes explicarían el alto grado de homogeneidad en el reconocimiento por parte de los sueros heterólogos frente a los cinco antígenos ensayados por Western blotting. Precisamente son los AOV y AUT los que muestran un mayor número de bandas y son más intensamente teñidas mediante Western blotting, lo que sugiere que el aparato reproductor de las hembras posee los antígenos más inmunógenos de los nematodos adultos. Evidencia que debería tenerse en cuenta en el diseño de posibles métodos inmunoprofilácticos en la ascariosis porcina. Mediante SDS-PAGE, el menor número de bandas proteicas entre todos los extractos se encontró en el APS, cuya fracción de 14 kda destacó entre ellas por su intensidad. Quizás sea esta característica la que haya contribuido a que sea una de las fracciones proteicas más estudiadas a lo largo del tiempo por diversos autores (Ambler et al. 1972; McGibbon & Lee, 1990; Wardlaw et al. 1994), para los que es el mayor alergeno de A. suum. Se le conoce como alergeno A, ABA-1 (Stromberg, 1979; McReynolds et al. 1993) y es común a otros ascarídidos (Iglesias et al. 1995, 1996). Está presente también en tejidos larvarios, lo que podría implicar un papel funcional importante, quizás responsable de la resistencia a la migración larvaria. Sin embargo, no es ésta la única fracción de interés, destacando por nuestra parte las zonas entre los 36-47 y 84-97 kda, perfectamente reconocidas por los sueros hiperinmunes en todos los antígenos, y a las que asignamos una alta importancia inmunógena.

162 E. FRONTERA et al. CONCLUSIONES Los extractos antigénicos analizados a partir de adultos de A. suum han resultado ser verdaderos mosaicos antigénicos, destacando por el número e intensidad de bandas proteicas los extractos uterino y ovárico. Por el contrario, el fluido pseudocelómico fue el que presentó el menor número de dichas fracciones. Muchas de las bandas resultaron ser comunes entre los distintos antígenos, especialmente entre los 33-66 kda y 13-16 kda. Las fracciones inferiores a 20 kda no indujeron una producción de inmunoglobulina G en animales hiperinmunizados. En cambio, las zonas entre los 36-47 y 84-97 kda fueron las más intensamente reconocidas por la misma técnica en la mayoría de los antígenos. Los extractos ovárico y uterino mostraron la mayor capacidad inmunógena entre los antígenos estudiados. Por el contrario, la menor inmunogenicidad se observó con el antígeno esofágico. AGRADECIMIENTOS Este estudio ha sido financiado por el proyecto CICYT AGF96-0557. Al técnico especialista, Manuel Gómez Blázquez. SUMMARY Antigenic characterization of Ascaris suum by SDS-PAGE and Western blotting In this study, the antigenic composition of Ascaris suum was studied. Adult worms were dissected and the different anatomic parts separated: oesophagus, cuticle, ovary, uterus and body fluid and proteins separated using SDS-PAGE. Antigen characterization of the proteins was then carried out to identity fractions of interest for immunodiagnostic procedures. A broad group of protein bands was identified in all antigenic extracts, particularly the fractions ranging from 13 to 16 kda and from 33 to 66 kda. Proteins lower than 20 kda did not induce any measurable IgG production in hyperinmunized animals. The uterine and ovarian antigenic extracts yielded the highest immune responses, while the oesophagial antigens were the least immunogenic. KEY WORDS: Ascaris suum Antigens Characterization Immunodiagnosis REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS AMBLER J., DOE J. E., GEMMELL D. K., ROBERTS J. A. & ORR T. S., 1972. Biological techniques for studying the allergenic components of nematodes. I. Detection of allergenic components in Ascaris suum extracts. J. Immunol. Methods, 1, 317-328. CROMPTON D. W. T., 1989. Prevalence of ascariasis. In: Ascariasis and its prevention and control (Edited by Crompton D. W. T., Nesheim M. C. & Pawlowski Z. S.). Taylor & Francis, London.

CARACTERIZACIÓN ANTIGÉNICA DE Ascaris suum 163 CHAN M. S., MEDLEY G. F., JAMISON D. & BUNDY D. A. P., 1994. The evaluation of potential global morbidity attributable to intestinal nematode infections. Parasitology, 109, 373-387. FRONTERA E., 1998. Obtención de antígenos de Ascaris suum. Tesis de licenciatura. Universidad de Extremadura. GERMÁN P., 1993. Estudios electroforéticos en Nematodes parásitos de ganado de interés económico. Tesis Doctoral. Universidad de Sevilla. IGLESIAS R., LEIRO J., UBEIRA F. M., SANTAMARINA M. T. & SANMARTÍN M. L., 1995. Anisakis simplex: stage-specific antigens recognized by mice. J. Helminthol., 69, 319-324. IGLESIAS R., LEIRO J., UBEIRA F. M., SANTAMARINA M. T., NAVARRETE I. & SANMARTÍN M. L., 1996. Antigenic cross-reactivity in mice between third-stage larvae of Anisakis simplex and other nematodes. Parasitol. Res., 82, 378-381. JUSTUS D. E. & IVEY M. H., 1969. Ascaris suum: immunoelectrophoretic analysis of antigens in developmental stages. Exp. Parasitol., 29, 290-298. KENNEDY T. J., 1988. Prevalence of swine parasites in major hog producing areas in the United States. Agri-Practice, 9, 25-32. LAEMMLI U. K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophague T4. Nature, 227, 680-685. McGIBBON A. M. & LEE T. D., 1990. The major Ascaris allergen. VII Congres International de Parasitologie, París, S5-A42, 20-24 August. McREYNOLDS L. A., KENNEDY M. W. & SELKIRK M. E., 1993. The polyprotein allergens of nematodes. Parasitol. Today., 9 (11), 403-406. MURRELL K.D., 1986. Epidemiology, pathogenesis and control of major swine parasites. Vet. Clin. N Am-Food Anim. Pract., 2, 439-454. ROEPSTORFF A. & NANSEN P., 1994. Epidemiology and control of helminth infections in pigs under intensive and non-intensive production systems. Vet. Parasitol., 54, 69-85. STEWART T. B. & HALE O. M., 1988. Losses to internal parasites in swine production. J. Anim. Sci., 66, 1548-1554. STROMBERG B. E., 1979. The isolation and partial characterization of a protective antigen from developing larvae of Ascaris suum. Int. J. Parasitol., 9, 307-311. TORRES P. & BARRIGA O. O., 1974. Análisis antigénico de Ascaris suum, Ascaris lumbricoides, Toxocara mystax y Ascaridia galli, mediante difusión doble en agar e inmunoelectroforesis. Boletín Chileno de Parasitología, 29, 79-85. WANG C. Y., CHOOI P. L. K., KIAN T. S. & WAH M. J., 1994. Characterization of Ascaris lumbricoides and Ascaris suum antigens. Chinese J. Parasit. Dis. Control, 7 (2), 104-108. WARDLAW A. C., FORSYTH L. M. G. & CROMPTON D.W.T., 1994. Bactericidal activity in the pig roundworm Ascaris suum. J. Appl. Bacteriol., 76 (1), 36-41. WU Y. J. & FOOR W. E., 1982. Immunological studies of the relationship between the antigenic change of Ascaris oocytes and the junctional fluid of the fertilization chamber. J. Parasitol., 68 (6), 1048-1052.