ARN 2009 Procesamiento del ARN Departamento de Química Biológica
Expresión de genes
Propiedades del ARN Generalmente simple cadena (Alto grado de plegamiento) El azúcar es ribosa: -OH en 2 (-H en deoxi) AUGC (U reemplaza a T del ADN); pares A:U El ADN es nuclear en eucariotas; proteínas se sintetizan en citoplasma; RNA INTERMEDIARIO Experimentos de pulse chase usando 3 H-U
Microscopia electrónica de la transcripción de ARNr
Procariotas transcripción y traducción simultánea Eucariotas transcripción en núcleo traducción en citoplasma INTERVALO: Fase post transcripcional???
ARN en eucariotas RNA Pol I: rrna RNA Pol II: mrna RNA Pol III: trnas y snrnas
genes eucariotas intrones secuencias sin sentido exones secuencias codificantes
Gen eucariota típico
Procesamiento
Details of processing: 5 Cap 5 Cap: m7gppp (guanyltransferase) 3 PolyA (150-200) AAUAAA: Signals Cleavage of nascent transcript ca. 20 nt downstream Poly A polymerase adds 3 A Splicing
Pasos en el procesamiento del ARN: co-transcripcionales Capping: modifica el extremo 5 Clivaje y poliadenilación: forma el extremo 3 Splicing: ocurre en el núcleo antes del transporte
Exp con SV40: los transcriptos no siempre corresponden a las secuencia lineales del ADN Confirmación por tecnología del ADN recombinante Encontrado en mrna, trna and rrna Gen de la Ovalbumina : Microscopia electrónica Intron Split Genes Intron Exon Exon
Secuencia completa de eventos del procesamiento del ARN. SPLICING ALTERNATIVO Gran flexibilidad genética
Intrones en diferentes genes ARNm (0 a 60) ARNr ARNt (0 o 1) Genes en mitocondria Genes en cloroplastos
ARNhn es el precursor del ARNm HIBRIDIZACION ARN - ADN Weissmann y col. 1978
Splicing los intrones son removidos
Auto - splicing Clases de intrones Grupo I: genes nucleares, mitocondriales y cloroplásticos que codifican para ARNr, ARNt y ARNm, en Tetrahynena, Physarum, hongos y phage T4 Grupo II: transcriptos primarios de ARNm mitocondrial o cloroplástico en hongos, algas y plantas No auto - splicing Splicing de transcripto primario de ARNm: spliceosoma Splicing de ARNt de levaduras
Intrones no auto splicing Transcriptos primarios de ARNm Se forma el intermediario lazo Requiere: small nuclear ribonucleoproteins: snrnp o snurps small nuclear RNA: snrna (U1, U2, U4, U5, U6)
Señales de splicing exon GU-intrón-AG exón secuencia consenso 5 -AG GUAAGU-intrón-YNCURAC-Y n NAG G-3 Y: U o C A R: purina Y n : 9 pirimidinas N en levaduras 5 - GUAUGU-intrón-UACUAAC-YAG -3 Disturbios en secuencias consenso inhibe el splicing normal
Mecanismo de Splicing: las secuencias son claves Small nuclear RNAs (snrnas) act as guides in the splicing process: Forms the splicosome At the 3 splice site = AG Other consensus elements further upstream help define where these splice joints exist. Most begin with GU end with AG at the flanks spliceosoma
Esquema del mecanismo de Splicing en 2 etapas
Reacciones de transesterificación 1) - 2 OH de un A interno ataca al fosfodiester que une el extremo 5 del intrón al exón 1, produciendo el LAZO y moléculas 5 exón 2) - 3 OH del exón 5 ataca al fosfodiester que une el comienzo del exon 2 y el extremo 3 del intrón, ligado a los exones El intrón se libera como lazo El N de fosfodiésteres se conserva!!!!
El splicing puede estudiarse in vitro Hicks y col. Methods (2005) 37: 306
ME: Suero control DO: antisuero anti RNA-prot PAGE 4% PAGE 10% Sharp y col, 1984
Análisis de los productos de la reacción de splicing in vitro
Cinética del Splicing In vitro. Extracto nuclear de Hela Pre - radioactively labeled precursor RNA The splicing reactions were separated by gel electrophoresis. Notice that the intron and intronexon RNAs have an unusually reduced mobility in these polyacrylamide-urea gels.
Es este ARN atípico producto del splicing? Sharp y col, 1984
Mecanismo de splicing en 2 etapas: predicciones intrón spl tiene un grupo 3 OH exón P exón sitio spl 3 downstream intrón spl y exón 2+intrón nt ramificado (2, 3 y 5 OH unidos a nt) extremo 5 del intrón en la ramificación
Mecanismo de la RNasa T1 y T2
La ramificación involucra el extremo 5 del intrón unido a un sitio dentro del intrón Conclusión Los RNAm nucleares sufren splicing vía un intermediario ramificado o tipo lazo Sharp y col.
Como ensayamos el splicing? Comparamos la secuencia del ADN con la del ARNm maduro RT-PCR
Síntesis de la sonda para el ensayo de protección de la ribonucleasa (RPA)
Señal de ramificación A dentro de región especial del intrón WT Splicing Mutante 1 No splicing Mutante 2 Mutante 3 Splicing aberrante Splicing aberrante Secuencia UACUAAC Gen: actina de levaduras Langford y Gallwitz, 1983
RESUMEN Los precursores de los ARNm sufren splicing Se forma el intermediario lazo Requiere: Secuencias consenso en los extremos 5 y 3 de los intrones Secuencias consenso en el punto de ramificación En levaduras: UACUAAC y determina cual AG downstream es el sitio 3 de splicing En eucariotas superiores: UNCURAC El nt del BP is la A final
Spliceosomas: intermediarios unidos a partículas Spliceosoma humano levaduras
Small nuclear RNAs snrnas y snrnps son los agentes que reconocen las señales de splicing Actúan acoplados a proteínas Small nuclear ribonuclear proteins snurps Se unen al spliceosoma y juegan roles críticos U1, U2, U4, U5 y U6 RNA que esta siendo sintetizado
snarn son abundantes en el núcleo
Reconocimiento de los sitios de splicing sitio donor 5 sitio de ramificación sitio aceptor 3 Y: C o U N: cualquier nt snrna U1 reconoce la secuencia en el sitio donor interacción por apareamiento de bases snrna U2 se une al sitio de ramificación interacción por apareamiento de bases
Splicing en los transcriptos primarios de ARNm
Spliceosoma: ensamblaje de la maquinaria de splicing
Spliceosoma: ensamblaje de la maquinaria de splicing
Spliceosoma: los grupos reactivos entran en estrecha proximidad U5 funciona como puente
Formación del spliceosoma
U1snRNP Adenovirus E1A 9S 12S 13S
Apareamiento de bases entre U1 snrna y el sitio 5 de splicing es necesario pero no suficiente Porque cambios en U1 fallan en compensar cambios de bases en el sitio 5 spl? Es necesario proteína/s que reconozca la secuencia en 5????
S: exón -(4tioU) intrónexón + extracto spl UV cross-linking 4tioU a ARN Electroforesis U6snRNP Conclusiones U6 se une al nt 2 del intrón Evidencia por reversión del crosslinking U6 se asocia a S antes de formación lazo U6 precursor, U6 lazoy U6- U2 Steitz, 1991
Doble reconocimiento U1 y U6 Sitio 5 Prueba de lectura para mejorar la especificidad del splicing