1 TRABAJO PRÁCTICO Nº 8 Objetivos CARACTERIZACIÓN FISICO-QUÍMICA DE LÍPIDOS Caracterizar grasas y aceites respecto de su composición y estructura. Evaluar la calidad o el estado de grasas y aceites. Determinar el índice de saponificación de grasas y/o aceites de distintos PM medios. Separar e identificar los lípidos simples de una muestra por cromatografía en capa fina. Determinar el índice de acidez, de peróxidos y de Kreiss de algunos aceites, como indicadores de la rancidez hidrolítica y oxidativa. Introducción Los lípidos son moléculas orgánicas formadas básicamente por carbono, hidrógeno y oxígeno. Además pueden contener fósforo, nitrógeno y azufre. Es un grupo de sustancias muy heterogéneas que sólo tienen en común estas dos características: Son insolubles en agua Son solubles en disolventes orgánicos, como éter, cloroformo, benceno, etc. Junto a las proteínas y carbohidratos, los lípidos constituyen los principales componentes de las células vivas. Los lípidos son importantes componentes de los alimentos debido a que proveen energía (aportan entre el 35-40% del total de las calorías promedio de un adulto) como así también ácidos grasos esenciales. Transportan vitaminas liposolubles y contribuyen al flavor de los alimentos. Se extraen de diferentes partes de vegetales y animales por varios procedimientos (presión, fusión). Los productos resultantes pueden someterse a varios tratamientos antes de su consumo (refinado, hidrogenación). Pueden ser consumidos en forma visible (separada de su fuente original - manteca, aceite, etc.) o como constituyente básico del alimento (leche, queso, carne, etc.). Los aceites vegetales provienen principalmente de las semillas de: soja, algodón, maní, palma, coco y oliva. Clasificación de los lípidos Se clasifican en dos grupos en función a que posean o no ácidos grasos (AG) en su composición, estos son los lípidos saponificables e insaponificables respectivamente. Ácidos grasos Los AG son moléculas formadas por una larga cadena hidrocarbonada de tipo lineal, y con un número par de átomos de carbono. Tienen en un extremo de la cadena un grupo carboxilo (COOH). CH 3 (CH 2 ) n COOH Se conocen unos 70 AG que se clasifican en dos grupos: Ácidos grasos saturados: Sólo tienen enlaces simples entre los átomos de carbono. Son ejemplos de este tipo de ácidos el imirístco (14C); el palmítico (16C), el esteárico (18C), etc. Ácidos grasos insaturados: Tienen uno o varios enlaces dobles en su cadena y sus moléculas presentan codos, con cambios de dirección en los lugares donde aparece un doble enlace. Ejemplos: el oleico (18C, un doble enlace), el linoleico (18C, dos dobles enlaces), etc. El tipo y proporción de AG son característicos de cada tipo de grasa o aceite. La presencia de dobles enlaces influye sobre el punto de fusión de los AG. A medida que aumenta el número de dobles enlaces, la molécula se vuelve más retorcida disminuyendo el punto de fusión. A su vez los AG de configuración trans son más lineales que los cis teniendo puntos de fusión más altos.
2 Aceites y grasas alimentarias Las grasas y aceites alimentarios están formadas principalmente por AG esterificados al glicerol (acilglicéridos). Pueden existir como mono, di y tri ésteres. En los alimentos los más comunes de los tres son los triglicéridos (95%) que se diferencian entre si por su composición en ácidos grasos. La mayor parte de los aceites vegetales provenientes de las semillas oleaginosas, son altamente insaturados y contienen AG de 18C. Los triglicéridos (TG) con ácidos grasos saturados se encuentran en la manteca de cacao, aceite de coco, etc. Los TG líquidos a temperatura ambiente son llamados aceites y los sólidos son llamados grasas. Glicerina Triglicérido Ácido graso Análisis de grasas y aceites en alimentos El análisis de grasas y aceites para uso alimentario puede tener diferentes objetivos: Conocer la identidad, clasificar (aceite de oliva, soja, mezcla) Extraer información relativa a algún constituyente (tipo de ácido graso) Conocer sus características (estado de conservación, vida útil, alteración) Los principales análisis que se realizan son los siguientes 1. Identificación del tipo de grasa 2. Determinación de mezclas de grasas o aceites 3. Determinación de componentes extraños (disolventes, metales, pesticidas, etc) 4. Determinación de aditivos 5. Grado de refinado 6. Evaluación del estado o calidad 7. Identificación de grasas endurecidas o interesterificadas Identificación del tipo de grasa Se realizan con el objeto de caracterizar la composición química de la grasa o aceite. También permiten evaluar genuinidad o adulteración. Se emplean una serie de índices mediante los cuales se pueden determinar ciertos grupos funcionales o componentes de las mismas. Algunos de ellos son: Índice de saponificación (IS): Sirve para conocer el molecular (PM) promedio de los ácidos grasos que componen un lípido. El IS no es una magnitud absoluta sino que es función del peso molecular (PM) de los AG que componen el lípido. Cuanto menor sea el PM medio de los AG presentes mayor será el número de moléculas de triglicéridos (y por lo tanto de AG) resultando un IS mayor. Dentro de cada tipo de grasa los porcentajes de los diferentes AG se mantienen aproximadamente constante. Por lo que este índice es un buen referente para establecer la identidad de una muestra. EL IS se define como la cantidad de KOH en mg consumido por 1 g de grasa durante la saponificación. Índice de hidroxilo: Determina los ácidos hidroxigrasos, alcoholes grasos, acilgliceroles y glicerina libre. Se establece como el peso en mg de KOH necesario para neutralizar el ácido acético que se combina por acetilación con 1 g de grasa. Índice de yodo (IY): Esta medida es una estimación del grado de insaturación de una grasa, es decir de la cantidad de dobles enlaces de los AG presentes en la misma. El yodo es capaz de fijarse a los dobles enlaces. El IY se define como la cantidad de I 2 que absorbe una grasa expresado en g por 100 g de muestra (Ej. ácido oleico 89.9, linoleico 181 y linolénico 273).
3 Índice de tiocianógeno: Se determina por la fijación de tiocianógeno ((SCN) 2 ) a los dobles enlaces de los AG insaturados. Se expresa como peso de I 2 equivalente al (SCN) 2 ) absorbido por 100 partes de peso de la grasa. Determinaciones cromatográficas: Las técnicas cromatográficas (generalmente la cromatografía de gases o en capa fina) permiten separar, identificar y determinar los ácidos grasos como esteres metílicos ya sea libres o formando parte de los triglicéridos. Además permiten detectar adulteraciones presencia de anilinas, otros colorantes no autorizados, etc. La cromatografía en capa delgada (TLC) generalmente se realiza en silica gel como absorbente. Los componentes lipídicos de la muestra interaccionan con el absorbente sólido y se separan en función de sus polaridades individuales que están determinadas por el número y tipo de grupos polares y no polares. Para la separación se pueden emplear diversos solventes de diferente polaridad en el caso de los fosfolípidos que son los más polares se requiere un sistema de solventes altamente polares. Evaluación del estado o calidad La calidad de las grasas se ve influida por los procedimientos de obtención, elaboración y almacenamiento. Para analizar las posibles modificaciones que pueden sufrir las grasas existen métodos analíticos encaminados a detectar procesos de lipólisis, autooxidación y estabilidad térmica Lipólisis: Viene determinada por el contenido de AG libres debido fundamentalmente a la hidrólisis parcial de los TG. Los glicéridos pueden descomponerse en medio alcalino, por acción de la luz, enzimas (lipasas), calor y humedad. El calentamiento de las grasas a altas temperaturas produce hidrólisis de los TG liberando ácidos grasos y glicerol. El glicerol se puede descomponer en acroleína la que es muy volátil originando olores profundos. Existe una relación inversa entre el punto humo y el contenido de ácidos grasos libres, a bajo punto de humo mayor cantidad de AG libres. Los aceites con bajo punto de humo no son adecuados para las frituras porque dan olor y sabor desagradable a los alimentos. Índice de acidez (IA) o grado de acidez: Refleja la cantidad de AG hidrolizados (AG libres) a partir de los TG. El IA se define como los mg de KOH necesario para neutralizar los AG libres presentes en 1 g de materia grasa. El grado de acidez es el porcentaje en peso expresado en función de un AG específico (convencionalmente el ácido oleico). En un aceite o grasa normalmente este valor 0,6 mg KOH/g ó 0,30% como ác. oleico. Útil para: determinar actividad hidrolítica, analizar aceites de fritura o crudos, clasificar los aceites de oliva y evaluar la eficiencia del refinado. Autooxidación: Las grasas y aceites experimentan un proceso de oxidación parcial al aire que es tanto más acusada como mayor es la insaturación de los AG presentes en la misma. La reacción de autooxidación de las grasas se puede dividir en tres etapas: 1. Iniciación 2. Propagación 3. Terminación Durante la etapa de propagación se forman diferentes hidroperóxidos siendo los principales productos de la oxidación. Estos productos generalmente son inestables produciéndose compuestos de cadena corta como ácido propiónico, butírico y aldehídos que son los responsables del olor y gusto desagradable conocido como rancio reduciendo el tiempo de vida media y valor nutricional de los alimentos. Por lo tanto el aumento del contenido de hidroperóxidos puede ser usado como un indicador de la calidad de las grasas en la etapas tempranas del deterioro oxidativo. Este se determina mediante el índice de peróxidos. Índice de peróxidos: Indican cuan oxidada esta la grasa. Se expresa en meq de oxigeno activo contenidos en 1 Kg de materia grasa, calculados a partir del I 2 liberado con KI.
4 DESARROLLO PRÁCTICO Nro. 9 Consignas CARACTERIZACIÓN FISICO-QUÍMICA DE LÍPIDOS - Caracterizar grasas y aceites a través de la determinación del PM medio de los AG que lo constituyen mediante la realización del índice de saponificación. - Separar, determinar e identificar la composición química de una muestra grasa mediante el empleo de TLC. - Evaluar la calidad o el estado de grasas y aceites determinando los índices de acidez y peróxidos de una muestra. Índice de saponificación La saponificación es el proceso de tratar una grasa neutra con un álcali, descomponiéndola a glicerol y ácidos grasos. El índice (o valor, o número) de saponificación se define como la cantidad de álcali necesario para saponificar una cantidad dada de una grasa o un aceite, expresada como los mg de hidróxido de potasio necesarios para saponificar 1 g de muestra. A la grasa se le agrega una solución de KOH en alcohol, con exceso del reactivo y se calienta a reflujo para hidrolizarla totalmente. Luego, se titula por retroceso el exceso de KOH con HCl y paralelamente se corre un blanco, utilizando fenolftaleína como indicador. Por diferencia se obtiene el índice de saponificación. Materiales y métodos Muestras: - Aceite de girasol - Manteca Materiales: - Vaso de precipitados, de 250 ml, para fundir la grasa - Embudo de Buchner, adecuado al matraz de Kitasatos - Perlas de vidrio para ebullición - 2 buretas, de 50 ml - Papel de filtro, de tamaño apropiado al embudo de Buchner; para filtrar el aceite y la grasa fundida - 4 matraces, de 250-300 ml, acoplables al refrigerante - Micropipeta de 1000 µl o pipetas volumétricas de 1 ml - Matraz de Kitasatos. Reactivos: - Hidróxido de potasio alcohólico, aproximadamente 0.7 N - Ácido clorhídrico, aproximadamente 0.5 N, valorado con exactitud - Disolución indicadora de fenolftaleína; al 1 % en etanol del 95 % Equipos: - Condensador de aire (reflujo), de 650 mm de largo, como mínimo. - Balanza analítica - Placa calefactora o baño de agua; con control de temperatura variable. Metodología 1. Funda si se trata de una muestra sólida. Filtre la muestra de grasa fundida o la muestra de aceite a través de papel de filtro, para eliminar las impurezas. 2. Pese, con exactitud, 5 g de grasa fundida o de aceite en un matraz de 250-300 ml, que se pueda conectar a un condensador. Anote el peso de la muestra. Prepare la muestra por duplicado. 3. Adicione exactamente (desde una bureta) 50 ml de KOH alcohólico al matraz. 4. Prepare un blanco, con exactamente 50 ml de KOH alcohólico, en un matraz de 250-300 ml. 5. Añada varias perlas de vidrio para la ebullición a los matraces con la muestra de grasa o aceite y al blanco.
5 6. Conecte a un condensador los matraces. Haga hervir, suave pero regularmente, sobre una placa calefactora (o baño de agua) hasta que la muestra quede transparente y homogénea, lo cual indica una saponificación completa (esto exige aproximadamente 30-60 minutos). (Nota: los vapores deberían condensarse en el refrigerante tan abajo como sea posible o, en caso contrario, se puede ocasionar un riesgo de incendio). 7. Deje que las muestras y blanco se enfríen un poco. Enjuague el interior del refrigerante, arrastrando con un poco de agua desionizada destilada (dd). Desconecte el matraz del condensador. Deje enfriar la muestra y el blanco hasta temperatura ambiente. 8. Añada 1 ml de fenolftaleína a las muestras y blanco y valore (desde una bureta) con HCl 0,5 N hasta que justo desaparezca el color rosa. Anote el volumen de agente valorante consumido. 9. Refluya las muestras en blanco durante el mismo periodo de tiempo que haya utilizado para la muestra Calcular: Donde: IS = Índice de saponificación (mg KOH/g) 56,1 = peso equivalente de KOH (mg/mmol) N = normalidad de ClH (mmol/ml) W = masa de la muestra (g) B = volumen del valorante para el blanco (ml) M = volumen del valorante para la muestra (ml) Calcular el PM medio de la grasa a partir del IS hallado. Este depende del tamaño de los AG, en grasas de elevado PM el IS es bajo y viceversa. Por lo tanto: Para saponificar 1 mol de éster o grasa Para saponificar el PM de una grasa 1 mol de KOH x Nro de UE 1 mol de KOH x Nro de UE Para saponificar 1 g de grasa = IS (mg/g) Separación de lípidos simples por medio de la cromatografía en capa fina (TLC) La TLC se trata de una técnica o método físico de separación de dos o más componentes presentes en una mezcla basada en la velocidad de desplazamientos de los mismos. En ella participan dos fases, una móvil y otra estacionaria. En la TLC, una capa delgada de fase estacionaria se encuentra ligada a un soporte inerte. La mayoría de las clases de lípidos pueden ser separados por medio de cromatografía de absorción sobre capas finas empleando diferentes solventes en función de la polaridad de los lípidos que se deseen separar. Para la separación de lípidos polares se emplean solventes polares y no polares para la separación de lípidos neutros. La muestra y los patrones se aplican como manchas cerca de uno de los extremos de la placa. Esta se coloca en una cámara de desarrollo con el solvente apropiado (fase móvil). La fase móvil migra por capilaridad, ascendiendo por la placa transportando y separando los componentes de la muestra. La bandas así separadas pueden ser visualizadas y comparadas con patrones.
6 Materiales y métodos Muestras: Preparar las muestras en una concentración de 20 µg/ml en una disolución 2:1, v/v, de cloroformo: metanol. - Aceite de girasol - Aceite de oliva - Manteca de cacao - Aceite de maíz - Manteca - Gasa vacuna - Patrones: TG, ácido graso, éster de colesterol y colesterol Materiales: - Micropipetas - Cubeta de desarrollo con tapa - Papel para forrar la cubeta - Lápiz - Placa cromatográfica de capa fina: Sílica Gel, de 0,25 mm de espesor. Reactivos: - Disolución de cloroformo:metanol, 2:1 - Fase móvil: Disolución de Hexano:éter dietílico:ácido acético, 78:20:2 - Disolución de ácido sulfúrico acuosa al 50% Equipos: - Secador de pelo - Estufa Metodología Preparación de las placas de Sílica gel 1. Coloque las placas en estufa a 110ºC por 15 min y, a continuación deje enfriar e temperatura ambiente por 5 min. 2. Con lápiz trace una línea a 1 cm del borde inferior de la placa. 3. Haga marcas con el lápiz para indicar los lugares de siembra de las muestras y patrones a 1 cm de distancia. Identificando cada una de ellas. 4. Aplicar aproximadamente 10 µl de las muestra y patrones utilizando micropipetas en los lugares marcados en la placa 5. Deje secar las manchas. Desarrollo de las placas 1. Forre la cubeta con papel. 2. Vierta la fase móvil, hasta que la altura en la cubeta sea de 0,5 cm aproximadamente. 3. Coloque la tapa y deje transcurrir 15 min para que la atmosfera de la cubeta se sature del vapor del disolvente. 4. Coloque en la cámara de desarrollo la placa de TLC y deje desarrollar hasta que frente del eluyente alcance aproximadamente 2 cm del borde superior de la placa. 5. Retire la placa y marque la posición del frente del disolvente. Visualización de los lípidos 1. En una campana extractora de gases rocíe la placa con ácido sulfúrico diluido al 50% en agua. Deje secar. 2. Caliente la placa, durante 5-10 min a 100-1201ºC. Deje secar. 3. Marcar las manchas 4. Calcular para cada mancha el valor de su Rf. 5. Identificar los constituyentes grasos de las muestras comparadas con los patrones
7 Nota: La fase móvil empleada permite la separación de los lípidos neutros, para la separación de lípidos polares se debería emplear en la fase móvil una disolución de Cloroformo:metanol:agua (65:25:4). En la siguiente figura se observa la separación de lípidos simples por cromatografía en capa fina empleando una fase móvil no polar. Menos polar Más polar Índice de acidez Esteres de colesterol TG AG Colesterol Muestra Esteres de colesterol Esteres Triglicéridos metílicos de ácidos grasos Triglicéridos Ácidos grasos libres 1,2-Diglecéridos 1,2-Diglicéridos Colesterol 1 y 2 Monoglicéridos Fosfolípidos El índice se define como los miligramos de hidróxido de potasio necesarios para neutralizar los ácidos grasos libres presentes en un gramo de grasa o de aceite. Se analiza volumétricamente una muestra liquida de grasa disuelta en etanol del 95% neutralizado, con hidróxido de sodio previamente valorado hasta el punto final de fenolftaleína. Se usan el volumen y la normalidad del hidróxido de sodio consumido junto al peso de la muestra, para calcular el índice de acidez o ácidos grasos libres. Materiales y métodos Muestras: - Aceite de girasol - Aceite de oliva Materiales: - Vaso de precipitados, 250 ml, para derretir la grasa - Embudo de Buchner, que se adapte al matraz de Kitasatos - Bureta 10 ml - 4 matraces de Erlenmeyer, de 250 ml - Muestras de grasa o de aceite, o de ambos - Papel de filtro para filtrar la grasa fundida y el aceite - Probetas, de 100 ml - Una micropipeta de 1000 µl o una pipeta volumétrica de 1 ml - Matraz de Kitasatos. Reactivos: - Etanol neutralizado (Neutralice con álcali el etanol al 95%, utilizando fenolftaleína como indicador, hasta una coloración rosa permanente) - Disolución indicadora de fenolftaleína (Disuelva 1 gramo de fenolftaleína en 50 ml de etanol al 95%, en un matraz aforado de 100 ml. Diluya con agua dd hasta enrasar). - Disolución valorada de hidróxido sodio 0,1 N Equipos: - Balanza analítica - Placa calefactora o baño de agua; con control de temperatura variable.
8 Metodología 1. Funda si se tratan de muestras sólidas a temperatura ambiente, calentándolas como máximo a 15 C por encima del punto de fusión. Filtre la muestra a través de un papel de filtro. A modo de prueba preliminar pese con precisión 5 g de la grasa o el aceite, en un Erlenmeyer, de 250 ml. 2. Añada 100 ml de etanol neutralizado y 2 ml de disolución de fenolftaleína, agite hasta disolver. 3. Valore lentamente las muestras con NaHO 0,1 N, hasta alcanzar el punto final. Vendrá indicado por la aparición de una coloración rosa débil que persista por 30 seg. Use la tabla siguiente para determinar si el peso de la muestra es el correcto en función del rango de índice acidez. Rango de A (%) Muestra( g) Alcohol (ml) Concentración del álcali 0,00 a 0,2 56,4 ± 0,2 50 0,1 N 0,2 a 1,0 28,2 ± 0,2 50 0,1 N 1,0 a 30,0 7,05 ± 0,05 75 0,25 N 4. Repita los pasos del 1 al 3 por triplicado anotando los pesos de las muestras y volúmenes del agente valorante empleado, sacar un promedio. Calcular : ó Donde: % de A = porcentaje de acidez o de ácidos grasos libres (g/100g), expresado como ác. oleico IA = mg de KOH necesarios para neutralizar los AG libres en 1 g de muestra V = volumen del agente valorante KOH para la muestra (ml) N = normalidad del KOH valorante (mol/1.000 ml) 282 = peso molecular del ácido oleico (g/mol) W = masa de la muestra (g) 56100 = peso molecular del KOH (mg/mol) Estos se relacionan de la siguiente manera Índice de peróxidos El índice de peróxidos se define como los miliequivalentes de peróxido (oxígeno activo) por kilogramo de grasa, tal y como se determina en un procedimiento volumétrico para medir la cantidad de grupos peróxidos o hidroperóxidos. A una cantidad conocida de grasa o de aceite, se le añade un exceso de yoduro de potasio, el cual reacciona con los peróxidos contenidos en la muestra. El yodo liberado se determina volumétricamente con una disolución de tiosulfato de sodio, previamente valorada frente a un patrón, utilizando como indicador una disolución de almidón. Para determinar el índice de peróxidos, se utiliza la cantidad calculada de yoduro de potasio necesaria para reaccionar con los peróxidos presentes. Materiales y métodos Muestras: - Aceite de girasol - Aceite de oliva Materiales: - Vaso de precipitados, 250 ml, para derretir la grasa - Embudo de Buchner, que se adapte al matraz de Kitasatos - Bureta, de 25 ó 50 ml - 4 matraces de Erlenmeyer, de 250 ml, provistos de tapón de vidrio
9 Reactivos: Equipos: - Muestras de grasa o de aceite, o de ambos - Papel de filtro, adecuado para el embudo de Buchner; - 2 probetas, de 50 ml - Una micropipeta de 1000 µl o una pipeta volumétrica de 1 ml - Matraz de Kitasatos. - Disolución de ácido acético-cloroformo 3:2 - Disolución de yoduro de potasio, saturada - Disolución valorada de tiosulfato de sodio 0,1 N - Disolución indicadora de almidón, al 1 %. - Balanza analítica - Placa calefactora o baño de agua; con control de temperatura variable. Metodología 1. Funda si se tratan de muestras sólidas a temperatura ambiente, calentándolas como máximo a 15 C por encima del punto de fusión. Filtre la muestra de grasa fundida o la muestra de aceite a través de un papel de filtro, para eliminar las impurezas. 2. Pese (con precisión de 0,001 g) 5 g muestra, en un Erlenmeyer de 250 ml con tapón de vidrio. 3. Adicione 30 ml de la disolución de ácido acético-cloroformo y agite hasta disolver. 4. Añada 0,5 ml de la disolución de KI saturada, mezclar 10 segundos. Deje reposar, durante 1 minuto al abrigo de la luz. Añada 30 ml de agua destilada 5. Valore las muestras con la disolución de tiosulfato de sodio 0,1 N, con agitación enérgica para liberar todo el yodo de la fase del cloroformo, hasta que el color amarillo se haya desvanecido. 6. Añada 0,5 ml de la disolución de almidón al 1% y continúe la valoración, agitando enérgicamente para liberar todo el yodo de la fase clorofórmica hasta que justo desaparezca el color azul. 7. Anote el volumen de agente valorante consumido. (Si se utilizase menos de 0,5 ml de disolución de tiosulfato, repita la determinación). 8. Prepare y valore una muestra en blanco (omitiendo solamente el aceite). Anote el volumen de agente valorante consumido. Calcular : Donde: Índice de peróxidos = meq de peróxido/kg de muestra S = volumen del agente valorante para la muestra (ml) B = volumen del agente valorante para el blanco (ml) N = normalidad de la disolución de Na 2 S 2 O 3 (meq/ml) 1000 = factor de conversión de unidades (g/kg) W = masa de la muestra (g) Ensayo de Kreiss Se basa en la producción de color rojo debido a la reacción extremadamente sensible entre la floroglucina y un compuesto presente en las grasas o aceites rancios: el aldehído epidrínico. Reactivos: - HCl concentrado. - Solución al 1% de floroglucina en éter etílico Metodología En un tubo provisto de tapa, introducir 0,9 g de aceite y 1 ml de HCl concentrado; tapar y agitar vigorosamente durante 20 seg. Luego agregar 1 ml de solución de floroglucina y nuevamente tapar y agitar 20 seg. A los 10 min observar la coloración.
10 Si la grasa o el aceite está rancio, la capa inferior (ácida) toma un color rosa, violáceo o rojo (descartar colores amarillos o naranjas); en este caso se completa el ensayo con la modificación de Kreiss para ello: Hacer 2 diluciones del aceite original: a) 1 volumen de muestra + 9 volúmenes de vaselina líquida (1/10) b) 1 volumen de muestra + 19 volúmenes de vaselina líquida (1/20) Realizar nuevamente el ensayo con 1 ml de cada dilución tal como se detalló anteriormente. Resultados: Sin cambio de color: No hay rancidez. Reacción positiva en la muestra sin diluir y negativa en a) y b): Indica que no hay rancidez suficiente como para producir cambios en el olor y sabor, pero que pronto se producirán estos cambios. Reacción positiva en el ensayo a) pero negativa en el b) indica rancidez incipiente, acompañada de cambios ya perceptibles en el olor y sabor. Reacción positiva en la dilución b): Rancidez definida. BIBLIOGRAFIA CÓDIGO ALIMENTARIO ARGENTINO ACTUALIZADO Tomo II. Metodología Analítica. De la Canal y Asociados SRL. Buenos Aires, argentina. FENNEMA, O. R., PARKIN, K. L. DAMORAN, S. Fennema: Química de los alimentos. 3 a edición, Editorial CRC Press. Edición en la lengua española editorial Acribia S. A. (2008) España. HART, F. L. Y FISHER H. J. Análisis Moderno de los Alimentos. LESS, R. Análisis de los alimentos. Métodos Analíticos y de Control de Calidad. Segunda Edición. Editorial Acribia S. A. España. NIELSEN, S. S. Análisis de los alimentos Manual de Laboratorio. Editorial Acribia S. A. (2007). España. PEARSON, D. Técnicas de Laboratorio para Análisis de los Alimentos. Editorial Acribia S. A. (1993). España.