EL IMPACTO DE CALIDAD SEMINAL EN LOS PROGRAMAS DE IATF G. M. Brogliatti Director técnico del Centro Genético Bovino de Eolia SA y del Centro de Inseminación Artificial La Argentina Chica INTRODUCCION La inseminación artificial (IA) es la biotecnología de mayor difusión entre los ganaderos del mundo. La misma posee un gran impacto en el avance genético poblacional y un costo reducido. Uno de los factores más importantes a tener en cuenta en un programa de inseminación artificial es la calidad del material seminal, donde debe incluirse la sanidad propia de los reproductores, la higiene durante el proceso de congelación y la calidad biológica evaluada mediante parámetros como la motilidad y la morfología. Para garantizar la fertilidad del semen de toro congelado para IA, las partidas de semen de los eyaculados criopreservados son solamente evaluados -en forma rutinaria- por sus niveles de motilidad espermática post-descongelado. Estas evaluaciones son realizadas, comúnmente, en forma subjetiva, por medio de la observación de una muestra de semen y un cubreobjetos en un microscopio de luz equipado preferentemente con óptica de contraste de fases. La morfología espermática también es utilizada como indicador de la habilidad de los espermatozoides para sobrellevar los procesos de congelado y descongelado. Los resultados obtenidos dependen enteramente de la habilidad y experiencia del evaluador. En Europa y USA cada vez más centros de inseminación artificial incorporan analizadores de motilidad espermática computarizados (los llamados instrumentos CASA), con el propósito de tener una mayor objetividad en la evaluación seminal y la posibilidad de analizar los diferentes patrones de motilidad espermática que se encuentran en una muestra de semen, particularmente luego de su procesado. EQUIPOS Y METODOLOGIA DE TRABAJO Computer Assisted Semen Análisis (CASA) fue desarrollado en la Universidad de Pennsylvania por Liu y Warne en 1977 y perfeccionado por Amann y Hammersatedt en 1980. El sistema involucra una cámara de video conectada a un microscopio de interfase y a una computadora que digitaliza las imágenes del tamaño y de los movimientos espermáticos. Las imágenes digitalizadas a través del tiempo permiten analizar la velocidad de las células, el movimiento rectilíneo, circular o lateral. En sus comienzos las máquinas tardaban varios minutos para realizar los cálculos matemáticos; actualmente el conteo de todas las variables se realiza en una fracción de segundo. Otros problemas ya solucionados fueron los diluyentes con leche descremada y yema de huevo los cuales dificultan la identificación de los espermatozoides y el análisis. Actualmente este inconveniente fue solucionado con una tinción de Hoechst específica para ADN y una luz Ultravioleta.
CASA - IVOS Sperm Analizer Hamilton Thorne El equipo IVOS sperm analizer de Hamilton-Thorne es un sistema integrado ópticovisual computarizado que realiza un análisis seminal preciso y objetivo. IVOS es un sistema internacionalmente conocido por ser un equipo rápido, certero, constante y científicamente testeado y validado. Opuesto a la iluminación continua de los microscopios tradicionales, el equipo IVOS utiliza una luz estroboscópica a una velocidad de 1/1000 de segundo para visualizar el movimiento de los espermatozoides. De esta forma una cámara de video colecta en tiempo real 60 fotografías por segundo y así puede definir de manera muy precisa el desplazamiento de los espermatozoides. A través de complejos cálculos matemáticos desarrollado por una computadora, el IVOS permite hacer un análisis con el más alto nivel de certeza en mediciones de velocidad y parámetros de motilidad seminal. El equipo IVOS permite el cálculo del conteo total de una muestra seminal, la cantidad de espermatozoides mótiles y concentración como también todos los valores de velocidad, movimiento lateral, progresivo y linealidad de la trayectoria espermática. El sistema IDENT, es una tinción utilizada para evaluar semen que ha sido diluido común diluyente a base de leche. La muestra es incubada con el colorante Hoescht 33348 el cual se incorpora al ADN de los espermatozoides y de esta manera puede ser identificado a través de la iluminación con luz ultravioleta y fluorescencia, permitiendo la evaluación de la concentración y motilidad espermática. Para evaluar morfología espermática se realiza un frotis con eosina y nigrosina y se evalúan 100 células en microscopio óptico a 1000X con objetivo de inmersión. Los espermatozoides anormales deben ser valorados como defectos de cabeza y cola o acrosomas. CORRELACION ENTRE LOS PARAMETROS DEL CASA, LA FERTILIZACION IN VITRO Y LOS PORCENTAJES DE PREÑEZ A CAMPO Como se ha descrito anteriormente, pocos parámetros individuales de viabilidad espermática muestran una relación significativa con la fertilidad de la muestra de semen descongelada, especialmente si los porcentajes de viabilidad se encuentran dentro de límites de normalidad aceptables. Por lo tanto, tests funcionales in vitro, capaces de discernir la habilidad del semen descongelado para llevar a cabo procesos celulares específicos y complicados como la capacitación, la reacción acrosomal, la fecundación in vitro (FIV) y la inducción del desarrollo embrionario in vitro han sido diseñados y testados para determinar su relación con la fertilidad obtenida luego de la IA (H Rodríguez-Martinez, 2000). Estudios retrospectivos del semen criopreservado de toros con un rango amplio de fertilidad post-ia han demostrado una correlación positiva y estadísticamente significativa entre tasas de clivaje zigótico in vitro y las tasas de no retorno al estro 56 días después de la IA. Evaluando los resultados a nivel de la producción de blastocitos in vitro, la correlación con la fertilidad in vivo existió, pero con coeficientes de
correlación más bajos, probablemente debido a la mayor dependencia por parte del embrión temprano de las condiciones de cultivo que de la fuente de los espermatozoides para alcanzar el estadio de blastocito. La técnica de producción in Vitro de embriones es utilizada actualmente para obtener descendencia de vacas de alto valor genético que poseen alguna falla en la ovulación o en la superovulación y en la transferencia de embriones. Como describíamos anteriormente esta técnica también puede ser utilizada para evaluar toros de diferente fertilidad. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue de determinar cual de los parámetros de motilidad espermática estaba correlacionado con los porcentajes de fertilización in vitro de cuatro diferentes toros. Para ellos se obtuvieron ovocitos de ovarios de frigorífico los cuales fueron madurados entre 18-24 h en medio de maduración y luego fueron designados al azar en cuatro diferentes grupos con una concentración final de 2x10 6 células espermaticas/ml. 24 horas después estos zigotos fueron cultivados en medio SOFaas por un día y en medio SOFaas con 1,5M glucosa por 6 días más. Los parámetros de motilidad fueron determinados con un CASA (HTMceros 12.1, USA) a las 0 y a las 1:30 h del procesamiento e incubadas en Hepes-TALP a 38º C. La correlación entre los porcentajes de fertilización In Vitro y los parámetros de motilidad medidos por el CASA fueron analizados por una regresión lineal y los valores de r 2 fueron comparados para cada parámetro en la Tabla 6 y 7. El número de espermatozoides mótiles mostró una significativa correlación con el porcentaje de fertilización. Tabla 6: parámetros del CASA y porcentaje de clivaje en cuatro toros diferentes utilizados en fertilización in vitro. Toro n= PARAMETROS ovocitos %FIV PMS VAP ALH BCF LIN A 112 67.86 1.09 91.5 7 31 53 M7 97 50.52 0.91 77.9 4.7 37.3 54 CL 89 43.82 0.2 85 5.4 33.9 52 MP 115 39.13 0.15 97 7.1 35 46 Tabla 7: Correlación Lineal entre los parámetros del CASA y el porcentaje de FIV PARAMETROS r 2 PMS 0.8 VAP 0.004 ALH 0.038 BCF 0.4 LIN 0.39 Podemos concluir que el número de espermatozoides mótiles progresivos obtenidos por el CASA muestra una considerable correlación lineal con los porcentajes de fertilización in vitro en los cuatro toros. Este parámetro se puede utilizar como una herramienta más para predecir la fertilidad de un toro. La linealidad como indicamos
anteriormente es un factor que al ser incluido en una fórmula de fertilidad incrementa el resultado. De todas manera, el coeficiente de fertilidad in vitro es de baja correlación. En un experimento en el que se inseminaron a tiempo fijo un grupo de 69 vaquillonas Braford en el norte de Santa Fe con dos toros de diferente linealidad se observo que el porcentaje de preñez total fue de 62 %. El porcentaje de preñez de toro de baja linealidad en la primer replica fue de 60 % y en la segunda del 30 %; mientras del porcentaje de preñez de toro de alta linealidad fue de 64 % y del 44 %, respectivamente. No se observaron diferencias significativas pero sí numéricas (entre el 4 y el 14 % mas) en el porcentaje de preñez de ambos toros a pesar de tener diferente LIN. Posiblemente al incrementar el número de animales involucrados los resultados sean significativos. Tanto en los experimentos realizados in vitro como en la prueba a campo observamos que la linealidad es un factor importante a atener en cuenta al evaluar material seminal. En un programa de inseminación artificial a gran escala se podrán evaluar este y otros parámetros que correlacionen con la fertilidad del semen. SEMEN REFRIGERADO VS CONGELADO EN PROGRAMAS DE IATF El uso de semen fresco en sistemas de IATF podría disminuir el costo de la preñez lograda a través de una mayor eficiencia (menor cantidad de espermatozoides totales por dosis) y también, aumentando la tasa de concepción (mayor tiempo de vida útil del semen en el oviducto por no haber sufrido la agresión del proceso de congelado). Este experimento se realizó para evaluar los porcentajes de preñez obtenidos con semen fresco vs. congelado y correlacionar algunos parámetros evaluados en el semen fresco con los porcentajes de preñez. Se utilizaron 176 vaquillonas cruzas (Bos indicus x Bos taurus). En el Día 0 todas las vaquillonas recibieron un dispositivo intravaginal con progesterona CIDR-B (Pfizer Sanidad Animal, Argentina.) y 2 mg de benzoato de estradiol (EB, Syntex S.A., Argentina) intramuscular (im). En el Día 8 se retiró el CIDR-B y se aplicó 500 µg de Cloprostenol (Celar, Zoovet, Argentina) im., 24 h más tarde (Día 9), se aplicó 1 mg de EB im. En este mismo día, se colectó el semen de tres toros de raza Tuli por electroeyaculación y se realizó la evaluación por microscopia común, y sistema computarizado de imágenes (CASA). También mediante la coloración con cloruro de tetraciclina (CTC), se determinó la reacción de acrosoma. La mitad del eyaculado fue diluido y congelado con un diluyente comercial Andromed (Minitub, Alemania) y la otra mitad fue rediluida al doble y refrigerada a 5 grados centígrados con otro diluyente comercial, Laiciphos (IMV, Francia). La dosis final, tanto del semen congelado como del refrigerado fue de aproximadamente 10 millones de espermatozoides mótiles por dosis y ambos fueron evaluados nuevamente en el momento de la IATF en porcentaje de motilidad por microscopía común y en porcentaje de acrosomas intactos por CTC. En el Día 10 del tratamiento (52 a 56 h posterior al retiro del CIDR-B) las vaquillonas fueron divididas al azar en dos grupos, uno de ellos (IA Fresco; n=85) fue IATF con semen que había sido refrigerado a 5 grados centígrados de 24 a 30 h antes, mientras que el grupo restante (IA Congelado; n=91) fue IATF con semen congelado. El diagnóstico de preñez fue realizado a los 30 días de la IATF por ultrasonografía transrectal. Los datos fueron analizados a través de Regresión Logística.
No se observaron diferencias significativas entre la utilización de semen fresco y congelado [IA Fresco 46/85 (54,1%); IA Congelado 40/91 (44,0%); P=0,1820), toro utilizado (P=0,7228), tampoco se encontraron correlaciones entre porcentaje de motilidad y preñez, ni entre porcentaje de acrosomas intactos y preñez. Los resultados obtenidos sugieren que el semen refrigerado puede ser una buena alternativa para utilizar en programas de IATF, ya que utilizando la mitad de la dosis se pueden obtener aproximadamente un 10% más de preñez. CONCLUSIONES FINALES Como han descripto otros autores anteriormente, pocos parámetros espermáticos individuales evaluados in vitro se relacionan estadísticamente con la fertilidad in vivo. Sin embargo, combinando los resultados de algunos análisis seminales incluidos en un análisis de regresión múltiple ha demostrado tener una relación significativa con la fertilidad de los toros evaluados con poder discriminativo, aunque de carácter retrospectivo. En la actualidad en Suecia, se exige como prerrequisito que todos los toros de un test de progenie sean evaluados previamente por medio de CASA y Fertilizacion in vitro. Los resultados de dichos métodos de análisis son combinados para calcular un valor predictivo y una fertilidad potencial esperada (como tasas de no retorno) la cual ha mostrado una fuerte relación con la fertilidad post-ia. Estos experimentos realizados indican, que es posible el uso del análisis computarizado del movimiento del semen y una combinación de tests de laboratorio para determinar la calidad seminal y para predecir la fertilidad potencial de un toro para IA. La calidad del semen a utilizar en un programa de IATF es un factor preponderante. Una pajuela de semen de calidad debe tener una concentración, motilidad, morfología e higiene controlada. Entendemos por calidad de una pajuela una concentración de 30 a 40 millones de esperamatozoides totales con un 30 % de motilidad progresiva a la descongelación Esto estaría indicando un total de 9 millones de espermatozoides motiles progresivos. Con respecto a la morfología es necesario tener un mínimo de 70% de espermatozoides normales con no mas del 20 % de defectos de cabeza y del 25 % de defectos de cola y acrosoma. La norma de OIE para higiene del material seminal indica que debe poseer menos de 500 UFC / ml para ser considerada de clase I. Es Obligatorios en nuestro país que los toros de colecta sean libres de enfermedades como Brucelosis, TBC, y venéreas como Tricomonas y Campilobacter es ideal que también sean libres de IBR, DVB, Leucosis, Neospora y Leptospira.