IV Conferencia Anual de las Plataformas Tecnológicas de Investigación Biomédica Madrid, 28 de febrero de 2011 Octubre 2010 Dr. Raúl REYERO (rreyero@ikerlan.es) Lab-On-a-Chip para aplicaciones diagnósticas POC (Capacidades de IKERLAN-IK4) 1
ÍNDICE 1 2 3 4 5 CONTEXTO DEL POC / POCT TECNOLOGÍAS MICROFLUÍDICAS PARA EL DIV POC SECUENCIA EN UN SISTEMA DE DIV POC SISTEMA DE DIV POC - LOC IKERLAN MICROSISTEMAS 6 IKERLAN MONDRAGÓN 7 INFORMACIÓN Y CONTACTO 2
1. CONTEXTO Diagnóstico In Vitro Las actividades de Diagnóstico In Vitro (DIV) se realizan fundamentalmente en tres ámbitos: - Laboratorios centralizados (ej. Hasta 50.000 test diarios y 500 parámetros) - Laboratorios distribuidos (ej. Regionales, locales, hospitalarios, etc.) - Sistemas DIV próximos al paciente (ej. POC, OTC, etc.) 3
1. CONTEXTO POC /POCT Definición: POC / POCT (Point Of Care / Point Of Care Testing) Análisis biológico de orina, sangre u otros fluidos corporales accesibles por procedimientos sencillos y realizado en la proximidad del paciente bajo la responsabilidad de facultativos y profesionales. Definición: OTC (Over The Counter) Análisis biológico de venta libre y disponible sin prescripción médica. Aplicaciones de los POC / POCT - Test de embarazo - Marcadores cardíacos - Coagulación - Cáncer colorectal - Monitorización de glucosa - Gases y electrolitos - Etc. 4
1. CONTEXTO POC /POCT distribuido Ubicación de los sistemas POC Los sistemas POC acercan la analítica al paciente allá donde éste los necesite: - Unidades de emergencia, UVIs, localizaciones remotas, hospital, etc. Los sistema POC se integran en la estructura del proceso asistencial a través de los LIS. Los sistemas POC responden a los futuros requisitos de la medicina personalizada y la medicina distribuida 5
1. CONTEXTO El DIV y los sistemas POC Sistema de DIV cualitativo POC Sistema de DIV cuantitativo Hay una gran brecha entre los precisos sistemas de análisis clínicos y los dispositivos portátiles y rápidos La solución viene de la mano de los sistemas POC con capacidad cuantitativa. Sistemas de DIV POC cuantitativos Estos modernos sistemas de DIV POC hacen uso de las tecnologías: - Microelectrónica - Microfluídica - Biosensores - Marcadores - Etc 6
1. CONTEXTO El DIV, los sistemas POC y los LOC El requisito clave de las empresas de DIAGNÓSTICO Realizar diagnósticos mejores, más rápidos con menores volúmenes de muestra, pero altamente reproducibles, sensibles y fiables. Los MICROSISTEMAS pueden aportar soluciones a todos los requisitos Integrando todas las funciones de los sistemas de análisis cuantitativo de un laboratorio en un componente : Lab-On-a-Chip ó LOC 7
2. TECNOLOGÍAS MICROFLUIDICAS PARA EL DIV POC Tipo de Test Preparación de la muestra Detección Óptica Análisis químico e Inmunoensayo Reactivos químicos y marcadores Electroquímica Otros Tecnologías Microfluídicas para sistemas de DIV POC Citometría Sin preparación Óptica Pruebas ADN / ARN Análisis químico e Inmunoensayo Óptica Electroquímica Preparación de la muestra sin amplificación Magnética y biosensores electroquímicos 8
3. SECUENCIA EN UN SISTEMA DE DIV POC Descripción de los pasos para realizar un análisis POC completo. Los pasos pueden reducirse en función de la aplicación o la tecnología utilizada. Recogida de la Muestra: Inserción de la muestra: Preparación de la muestra: Amplificación: Detección: - Sólidos - Torunda - Solución acuosa - Sangre - Etc. - Interface Micro-Macro - Conectores - Etc. - Mezcla de reactivos -Purificación y filtración -Concentración - Lisis - PCR - qpcr - RPA - Etc. -Óptica - Fluorescencia - Electroquímica - Etc. 9
4. SISTEMA DE DIV POC - LOC IKERLAN es un Centro de Investigación Tecnológico que ha desarrollado, entre otras, una plataforma para aplicaciones de Diagnóstico In Vitro basada en un micro-sistema (Lab-On-a-Chip) integrado y flexible basado en la tecnología PCR. 10
4. SISTEMA DE DIV POC - LOC Micro PCR La técnica de PCR permite el diagnóstico mediante la detección de secuencias genéticas La aplicación se hace hoy en día en el laboratorio por personal especializado La MICRO-PCR es el resultado de la combinación de desarrollos microfluídicos, nanobiotecnología y biología molecular La aplicación se puede hacer en campo por personal especializado o no especializado, dependiendo de la aplicación a la que vaya dirigida PCR Micro PCR 11
Procesos de diagnóstico integrados Micro PCR Después de la recogida de la muestra y su inyección en el dispositivo 4. SISTEMA DE DIV POC LOC Proceso integrado de la Micro PCR Preparación de la Muestra Purificación, Concentración, Lisis, etc. Captura de la Diana Reconocimiento de Biomoléculas con alta afinidad y especificidad Generación de señal y amplificación Detección de la señal Procesado de los datos Interpretación / Aplicación SISTEMA INTEGRADO de DIAGNÓSTICO MOLECULAR 12
4. SISTEMA DE DIV POC LOC Características y ventajas Diseño de un micro-sistema de diagnóstico Lab on a Chip Concentración y aislamiento Identificación de secuencias especificas de oligonucleótidos (ADN-ARN) Técnica de PCR en tiempo real El proceso en una única cámara Menor cantidad de muestra Simplificación de la preparativa de la muestra. Menor cantidad de reactivos Reducción del tiempo total del análisis (e.j. 24min vs 48 hr) 13
4. SISTEMA DE DIV POC LOC El dispositivo LOC Chip de polímero desechable de bajo costo Preparación de la muestra Dos opciones de lisis Concentración de la muestra en el chip Cámara PCR de 2.6 µl PCR que integra el sistema de calentamiento y sensor de temperatura Detección óptica a través de un sistema de lectura externo Heaters T sensor Outlet Spring loaded contact Heater contacts Reaction chamber Heater contacts Inlet O-rings Capsule Sensor contacts Disposable chip Optical/Thermal Reader 14
4. SISTEMA DE DIV POC LOC Lisis térmica On Chip Pyrex Opciones de lisis y resultados Lisis química PCR reagents N S Pyrex S N PCR mixture loading PCR reagents N S Bacteria Lysis S N PCR mixture loading Bacteria or virus Chamber closed Magnetic bead Pyrex Magnetic bead Lysis buffer qpcr Pyrex Sensibilidad del test: 20 CFU Validación con 80 muestras reales Tiempo total / Analisis : 24 min vs 48 hr Preparación de la muestra: 2 min Aislamiento ADN: 2 min Resultado final qpcr: 20 min Coste del análisis 2 vs 15 EN ISO 1614:2003 standard El sistema cumple con los requerimientos de detección de la Salmonella spp. y Campylobacter spp. en hospitales y granjas 15
4. SISTEMA DE DIV POC LOC Validación de datos - Bacterias Muestras suministradas por una granja danesa y un hospital español 81 muestras reales testeadas Concentración de la muestra, purificación, PCR y detección en un único chip fgrams of DNA in 24 minutes (sample prep and qpcr) End point PCR product from reference vs Salmonella spp. End point PCR product from reference vs Campylobacter microdevice microdevice spp. Relative accuracy 95.6 % Relative sensitivity 95.6 % Relative specificity 100 % Relative accuracy 95.8 % Relative sensitivity 94.7 % Relative specificity 100 % D. Verdoy et al. Proceeding of µtas 09, Jeju, Korea 2009 D. Bang et al., µtas 09, Jeju, Korea 2009 16
4. SISTEMA DE DIV POC LOC Validación de datos - Virus Cultivos virales cuantificados y muestras nasofaringeas de pacientes preparadas y suministradas por el Hospital Donostia Los valores Ct se compararon con los obtenidos por el departamento de Microbiología del Hospital Donostia Los resultados confirmaron las prestaciones del protocolo de la extracción y captura del ARN en un chip Este análisis no es una prevalidación con docenas de muestras. En este caso se muestran los resultados obtenidos con duplicados y repeticiones realizadas 4 veces 17
4. SISTEMA DE DIV POC LOC Situación actual IKERLAN-IK4 dispone de una plataforma prototipo que incorpora la preparación de la muestra, procesos PCR y válvulas integradas para el diagnóstico basado en ADN. Verificada para Salmonenella spp. y Campilobacter spp. con 80 ensayos reales. IKERLAN-IK4 dispone de la tecnología para desarrollar sistemas de multidetección (ej. Hasta 6 biomarcadores). Orientada al diagnóstico de enfermedades infecciosas. IKERLAN-IK4 cuenta con la protección de la IP de las tecnologías básicas. 18
5. IKERLAN MICROSISTEMAS Infraestructura y personal IKERLAN MICROSISTEMAS: Nuevo edificio de laboratorios de I+D+i instalado en el POLO GARAIA de Mondragón. Inaugurado en Noviembre de 2009. Laboratorios con una superficie de 2.754 m2. Sala blanca de 300 m2. Equipos de fotolitografía Equipos de procesos químicos Zonas de caracterización y tests Zonas de integración de chips y dispositivos (Prototipos y pre-industrialización) Herramientas y equipos de diseño y simulación Investigadores y personal auxiliar. 16 doctores e ingenieros 6 doctorandos 1 técnicos de laboratorio 2 técnicos de servicios 19
5. IKERLAN MICROSISTEMAS Capacidades tecnológicas Microfluídica. Litografía SU8 Fabricación de dispositivos con polímeros COC Fabricación de dispositivos con sustratos rígidos: Silicio, Pyrex y PMMA Fabricación de dispositivos sin sustrato Integración de Aveguides y electrodos Biodetección Microóptica (ej. Fluorescencia, OLED, etc.) Magnética Electroquímica (ej. Amperimétrica) Biosensores. LOC (Lab-on-a-Chip) LOF (Lab-on-a-Foil) Bandas de detección Integración mecánica, electrónica, comunicaciones y microelectrónica 20
5. IKERLAN MICROSISTEMAS Soluciones Sanitarias Ámbitos Micro sondas microdetección - microdosificación Diagnóstico molecular (ej. ADN, proteínas, etc.) Inmunoensayos Patologías de interés Enfermedades infecciosas Enfermedades metabólicas Cáncer Aplicaciones Electroforesis para manipulación de partículas y células Control de fluidos Biodetección Multidetección micropcr: qpcr, RT PCR, Dispositivos de diagnóstico POC 21
5. IKERLAN MICROSISTEMAS Capacidades de transferencia Chips Diseño personalizado Fabricación de dispositivos con polímeros SU8 o COC Fabricación de prototipos y preseries Dispositivos Desarrollo de dispositivos para evaluar procesos y sistemas microfluídicos Desarrollo de biodetectores Desarrollo de dispositivos de detección personalizados Desarrollo de sistemas de diagnóstico POC Fabricación de prototipos y preseries 22
6. IKERLAN MONDRAGÓN Personal investigador Más de 150 doctores e Ingenieros 50 técnicos de laboratorio y servicios 50 doctorandos y becarios Áreas de conocimiento Ingeniería Mecánica Diseño mecánico Automática y Electrónica de Potencia Electrónica Comunicaciones Sensores Tecnologías del software y de la información Tecnologías de diseño y producción Innovación estratégica Laboratorios Ensayos electromágnéticos y acústicos Ensayos térmicos Etc. 23
7. INFORMACIÓN Y CONTACTO IKERLAN-IK4 CENTRO DE INVESTIGACIONES TECNOLÓGICAS TECHNOLOGICAL RESEARCH CENTRE Pº J.M. Arizmendiarrieta, 2 E-20500 Arrasate Mondragón (Gipuzkoa) - SPAIN Dr. Raúl REYERO e-mail: rreyero@ikerlan.es Tel.: +34 943 71 24 00 Fax: +34 943 79 69 44 24