Replicación del DNA
NATURALEZA DE UN CROMOSOMA?? Es lineal? Es circular? Esta formado por muchos fragmentos? Es igual en procariotes que en eucariotes? COMO SE DUPLICA? Tiene un sitio de inicio? Múltiples sitios? QUIEN INICIA??
Replicación cromosoma circular
Cromosoma circular
Mutantes termocondicionales 40oC control 30oC dna A, dnab, dnac otras wt 3HT 30oC 30oC b a t
Minicromosomas para determinar el origen mínimo DNA cromosomal (E. coli) + Enzima de restricción E. coli DNA plasmídico + Enzima de restricción origen + Transformar bacterias R + mezclado ligasa R Medio con antibiótico
X DNA NO se replica Ori-coli Medio con antibiótico R Se replica
Secuencia del origen de replicación bacteriano R1 R4 R2 R3 Región de los treceámeros (tres repeticiones de 13 nucleótidos), 70% AT 4 Nonámeros o cajas DnaA (R) once sitios GATC en la secuencia de 245pb
OriC E. coli Secuencia rica en T-A
Metodo de footprinting para determinar el sitio de origen de la replicación
Dna A reconoce el sitio de inicio de la replicación 1) Nucleasa + DNA Ori 2) Dna A + DNA Ori 3) DnaB + DNA Ori 4) DnaC + DNA Ori 245 1 2 3 4 1
Sitios de unión de DnaA en el origen
Proteína DnaA Monómero 52kDa Se une con alta afinidad y de forma cooperativa a las cajas dnaa Complejo DnaA-ATP mayor afinidad por el DNA que complejo DnaA-ADP, y éste que DnaA solo. Estequiometría de hasta 20 subunidades de DnaA por oric Une ATP y lo hidroliza a ADP en forma dependiente de DNA Una vez abiertos los treceámeros, DnaA se ubica en las cadenas sencillas
Reconocimiento del oric DnaA reconoce el origen, lo activa y lo protege. Parece existir una fase helicoidal básica en la región de origen
DnaA, REGULACION Interacciones de DnaA Regulación por DnaA Regulación de DnaA DnaA DnaB DnaC RNA polimerasa Ici SeqA DiaA DNA Girasa Orígenes de replicación dnaa dam Factores sigma Proteínas Fts Unión a membrana ATP/ADP (RIDA) Sitios data (5 cajas DnaA) Mutantes, sobreproducción Hda/IdaB, subunidad beta DARS 1,2 (DnaA reactivating sequence 1,2)
Ori C ACTIVACION DEL ORIGEN DnaA-ATP DnaA-ATP DnaB-DnaC (6X) DnaA-ADP DnaA-ADP Dna B DnaC
DnaB Monómeros de 60kDa que forman un homohexámero Actividad de helicasa Dominios para : Unión a DNA de cadena doble Unión a DNA cadena sencilla Interacción con DnaC y DnaA Hidrólisis de NTPs (ATP) Dna C Monómeros de 28 kda Homohexámero que permite la llegada de DnaB ATPasa: al hidrolizar ATP pierde afinidad por DnaB Por qué sus mutantes afectaron la iniciación en el origen?
La helicasa rodea una de las hebras del DNA dúplex y se desplaza rompiendo puentes de hidrógeno, logrando la apertura de la doble hélice por exclusión estérica. Una hebra es retenida en el interior del anillo y la otra es excluida.
DnaA, REGULACION Regulación de DnaA Regulación por DnaA Interacciones de DnaA ATP/ADP (RIDA) Unión a membrana Sitios data (5 cajas DnaA) Hda/IdaB, subunidad beta Mutantes, sobreproducción DARS 1,2 /DnaA reactivating sequence 1,2) Orígenes de replicación DnaA Dam Factores sigma Proteínas Fts DnaA DnaB DnaC RNA polimerasa Ici SeqA DiaA DNA Girasa
Cajas DnaA en: data oric dnaa X X X X X X X X X XXX DNA duplicación promotor X X X X X X X X X XXX X X X X X X X X X XXX
REGULACION POR METILACION Me GATC CTAG SeqA Me DAM
Reconocimiento y activación del oric Resumen Hda/IdaB Beta
FACTORES QUE INFLUENCIAN LA INICIACION DE LA REPLICACION PROCARIOTE dna A X X X DnaA DnaA OriC D naa - ATP Exceso DnaA Ici DNA primasa data DnaB DNA pol III holo (beta) SeqA DnaC DnaA - ADP DnaC DNA hemimetilado DnaA - ATP Dam Me Membrana
Las proteínas SSB se unen con alta afinidad al DNA de cadena sencilla y lo protegen de nucleasas y de asociaciones intracatenarias SSB
La replicación del DNA requiere un cebador Dna G, Primasa, 60 kda RNA polimerasa Sintetiza cebador de 12nt DNA Primasa reconoce a DnaB
Arthur Kornberg DNA Pol I primera polimerasa descrita Péptido de 103 kda Dependiente de molde de DNA Dirección de la síntesis 5-3 Requiere extremo 3 OH
Actividades de la DNA polimerasa I
Mutantes de E.coli en el gen de la Pol I son viables, por lo tanto la DNA poli no es la principal enzima replicativa (pero no soportan deleciones del gen). Mutantes de DNA pol II son viables, aún con el gen deletado. La DNApol III es la principal enzima en la replicación del DNA. Las mutaciones son letales.
DNA polimerasas bacterianas Enzima gen Polimerización 5-3 Actividad exonucleasa 3 -- 5 Actividad exonucleasa 5 -- 3 Función principal I pola + + + Reparación II polb + + - Reinicio de la replicación, reparación III polc + + - Replicasa
Subunidades de la DNA polimerasa III de E.coli sub # por holoenzima Mr Función Pol III Núcleo dnae α 2 Alfa 132,000 Subunidad catalítica dnaq ε 2 épsilon 27,000 Proofreading hole θ 2 theta 10,000 Acoplador Pol III dnax τ 2 tau 71,000 Dimerización dnax γ 1 gamma 48,000 hola δ 1 delta 35,000 holb δ 1 delta 33,000 holc χ 1 xi 15,000 hold ψ 1 psi 12,000 dnan β 4 beta 37,000 Procesividad Abrazadera que carga las subunidades β al DNA Complejo γ ó complejo τ Pol III* Pol III holo
Pol III Pol III*
DNA polimerasa III La DNA pol III es la que replica las dos cadenas de DNA a la vez. Corrige errores con su actividad exonucleasa 3-5
Subunidad beta homodímero
Fidelidad se refiere al seguimiento exacto de la secuencia de DNA que sirve como molde La fidelidad de la replicación en bacterias: 10-8 a 10-10 Procesividad # de nucleótidos que se sintetizan en un solo evento de unión. Una enzima procesiva agrega miles. Distributividad. Se refiere a la síntesis que avanza agregando pocos nucleótidos por evento de unión.
Pol III Pol III* Formación de la holoenzima Dímero asimétrico?
Procesividad de la DNApolimerasa III La procesividad de la DNApol lii* aumenta de 50 nts a más de 50,000 nts gracias a la subunidad β
DnaB -DnaC Hda/IdaB Beta DNA primasa DnaA
FRAGMENTO DE OKASAKI
La replicación es semidiscontinua Fragmentos de Okazaki 1200-2000 nt Interrupción de la replicación por la cadena retrasada??
El molde de la cadena retrasada se debe doblar para parecer que va en la misma dirección que la cadena adelantada
RNasa H remueve el cebador, pero no es eficiente eliminando desoxinucleótidos (el último del cebador) DNA polimerasa I ayuda a remover el cebador, actividad exonucleasa 5-3 Actividad de polimerasa reemplaza los nucleótidos eliminados 17 DNA ligasa cataliza la formación de enlace fosfodiéster
DNA ligasa
Topoisomerasas Topoisomerasas I Topoisomerasa I Topoisomerasa III Topoisomerasas II Topoisomerasa II (DNA Girasa) Topoisomerasa IV
Topoisomerasas I
Girasa Topoisomerasas II
Topoisomerasas II Topo IV Decatenasa
Termino de la replicación
Síntesis del DNA Semiconservativa Dependiente de cebador de RNA Semidiscontinua Bidireccional
EUCARIOTE Tamaño de genoma Pol procariote: 1000 nt/seg Pol eucariote: 2000 nt/min (al menos 25 veces más lenta que la pol de bacterias) Orígenes de replicación Varios orígenes de replicación? Diferentes tipos ó es una secuencia única? Experimentos con plásmidos Levaduras vs eucariotes superiores Estructura del origen-deleciones Replicación Depende del ciclo celular
Inicio de la replicación en eucariotes Mas de 10 kpb
Inicio de la replicación en eucariotes Saccharomyces cerevisiae ATTTAATATTTTGGA Encontradas en zonas silenciadas
ORIGEN DE REPLICACION ATTTAATATTTT TAAATTATAAAA ARS: Secuencias de Replicación Autónoma. PROTEINAS ORC (1-6) M ARS ORC: Complejo de Replicación del Origen M-G1 CDC6 ARS CDT1
G1- S PROTEINAS MCM (2-7) CDC6 ARS CDT1 MCM: Minicromosomales de Mantenimiento CDC6 CDT1 HELICASA: MCM 6 x 2 MCM 4 x 2 (ATP asa) MCM 7 x 2 MCM 5, MCM 2 y MCM 3 CDC6 CDT1 PUNTO DE CONTROL
Regulación del Pre-RC FASE M Ciclinas B-CDK-M (Secuestra a Cdt1) Ciclinas B-CDK-M FASE G1/S
CDC45 CDC6 CDT1 Sld3 Pol α Ciclinas /CDK-G1 CDC6 CDC45 CDT1 Sld3 MCM 10 DDK/CDK-S Pol α CDC6 CDC45 CDT1 Sld3 MCM 10 ACTIVACIÓN DEL COMPLEJO DE INICIACIÓN
ORC : 6 subunidades, se fija selectivamente a ARS en un mecanismo dependiente de ATP. CDC6 Proteínas estructurales CDT1 MCM, (Mcm 2 7, pesos moleculares de 101, 91, 97, 82, 93, y 81 kda). Helicasa CDC45 Sld3 La unión de la proteína Cdc45 en el origen completa la formación del complejo de pre-iniciación Pol α MCM 10 En eucariotes, la DNA pol α/primasa es parte de un complejo de 4 proteínas (180, 68, 58 y 48 kda), p48 y p58, son requeridas para la actividad de Primasa.
DNApolε DNApolδ MCM8 (primasa) CDC45 Sld3 Cebador RNA/DNA RPA; factor de replicación A RFC; factor de replicación C DNA pol ε Cadena continúa GINS DNA pol δ Cadena discontinúa PCNA
RPA; factor de replicación A: Es un heterotrímero, recubren el DNA de hebra sencilla protegiéndolo del ataque por exonucleasas e impidiendo que vuelva a formar hebras dobles entre las bases componentes. RFC; factor de replicación C: Es un heteropentámero, encargado de cargar a PCNA alrededor del DNA.. El RFC reconoce el extremo 3 del pre-fragmento de Okazaki y, mediante la hidrólisis del ATP.
Proliferating Cell Nuclear Antigen PCNA Proteína 29kDa Incrementa procesividad de la DNA pol delta 40 Forma un trímero alrededor del DNA GINS Heterotetrámero
Polimerasas de eucariotes DNA polymerases undertake replication or repair DNA polymerase Function Structure α alfa δ delta ε epsilon γ gamma β beta ζ zeta η eta ι iota κ kappa High fidelity replicases Nuclear replication Polimerasa-primasa Nuclear replication Cadena discontinua Nuclear replication Cadena continua Mitochondrial replication High fidelity repair Base excision repair Low fidelity repair Thymine dimer bypass Base damage repair Requiered in meiosis Deletion and base substitution 350kDa tetramer 250kDa tetramer 350kDa tetramer 200kDa dimer 39kDa monomer Heteromer Monomer Monomer monomer
(Helicasa) PCNA MCM8 (primasa) Pol δ-cadena lagging Pol ε-cadena líder
Cdt1 DDK
Pol ε Polδ
Terminación en eucariotes El dilema de los cromosomas lineales
Terminación en eucariotes Telomeros
Terminación en eucariotes Telomerasa U
Terminación en eucariotes Telomerasa
ORIGEN DE REPLICACION EUCARIOTE Solo uno o múltiples? Tiempo de replicación/tamaño de genoma Replicación en embriones/células somáticas Múltiples orígenes?/orígenes diferenciales? Encendido durante el ciclo Existe una secuencia única? Experimentos con plásmidos Levaduras vs eucariotes superiores Estructura del origen-deleciones Replicación una vez por ciclo? Depende del ciclo celular
Inicio de la replicación en eucariotes Mas de 10 kpb
Inicio de la replicación en eucariotes Saccharomyces cerevisiae ATTTAATATTTTGGA Encontradas en zonas silenciadas
ARS Proteínas ORC ORC 1-6 Cdc6 Cdt1 ORC 1-6
Cdc6 ORC 1-6 Cdt1 Proteínas MCM 2 al 7 Cdc6 ORC 1-6 Cdt1 Cdc6, Cdt1 Cinasa de G1/S ORC MCM 2,3,5????? MCM 4,6,7 MCM 4,6,7 ORC
MCM Cdc6-Cdt1 ORC Cdc6-Cdt1 MCM Cdc45, sld3 MCM ORC MCM DDK, CDK MCM Cdc 45 Cdc 45 MCM Cdc6, cdt1 RPA, DNApolα-primasa Cdc 45 MCM polαprimasa RPA RFC, DNApolδ, DNApolε
5 polipéptidos 4 polipéptidos (Helicasa) MCM8 (primasa) (PCNA-like) 4-5 polipéptidos PCNA Pol δ-cadena lagging Pol ε-cadena líder
Regulación del Pre-RC
Cdt1 Cdt1 DDK
Proliferating Cell Nuclear Antigen PCNA Proteína 29kDa Incrementa procesividad de la DNA pol delta 40 Forma un trímero alrededor del DNA
Polimerasas de eucariotes DNA polymerases undertake replication or repair DNA polymerase Function Structure α δ ε High fidelity replicases Nuclear replication Polimerasa-primasa Nuclear replication Cadena discontinua Nuclear replication Cadena continua 350kDa tetramer 250kDa tetramer 350kDa tetramer γ Mitochondrial replication 200kDa dimer β ζ High fidelity repair Base excision repair Low fidelity repair Thymine dimer bypass 39kDa monomer Heteromer η Base damage repair Monomer ι Requiered in meiosis Monomer κ Deletion and base substitution monomer
Pol ε Polδ
Terminación en eucariotes El dilema de los cromosomas lineales
Terminación en eucariotes Telómeros
Terminación en eucariotes Telomerasa U
Terminación en eucariotes Telomerasa 3