UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS. ESCUELA PARA GRADUADOS INSTITUTO DE REPRODUCCIÓN ANIMAL DE CÓRDOBA (IRAC)

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS. ESCUELA PARA GRADUADOS INSTITUTO DE REPRODUCCIÓN ANIMAL DE CÓRDOBA (IRAC) CGR BIOTECNOLOGÍA REPRODUCTIVA ESPECIALIZACIÓN EN REPRODUCCIÓN BOVINA DETERMINACIÓN DE LA DINÁMICA FOLICULAR Y EL CRECIMIENTO Y REGRESIÓN DEL CUERPO LÚTEO DE BÚFALAS Y BUVILLAS DE LA RAZA MURRAH EN EL TRÓPICO BAJO COLOMBIANO Alejandro Ojeda Rojas. MVZ Junio de 2012

1. JUSTIFICACIÓN DEL TEMA Los búfalos se han convertido en una especie de importancia económica en los países en vías de desarrollo en regiones tropicales y subtropicales. Los búfalos tienen la capacidad de mantener la productividad de los pastos, de tener una muy eficiente conversión, son muy resistentes y requieren de un relativo bajo costo de mantenimiento en las zonas tropicales, donde la disponibilidad de alimento no siempre es la ideal (Cervantes y col. 2010). Esto ha hecho que los búfalos se constituyan en una buena fuente de proteína animal, tanto de leche como de carne (Singh y col. 2000; Rensis y López-Gatius, 2007). Los búfalos en América Latina se concentran principalmente en 7 países: Argentina, Brasil, Colombia, Cuba, Perú, Trinidad y Tobago y Venezuela. Sin embargo, América latina aporta tan solo el 2.3% del inventario mundial; más del 90% de la población mundial de búfalos se concentra en el sur y suroeste asiático (Almaguer-Pérez, 2007). En los últimos 30 años la población mundial bufalina (172 263.305) ha incrementado en un 34%, mientras que en este mismo periodo el inventario bovino mundial solamente ha crecido en un 12%. Adicionalmente, desde la década de los setentas, la producción mundial de leche de búfala ha aumentado un 200% (Almaguer-Pérez, 2007). Los búfalos son originarios de Asia, de allí fueron llevados a Europa y más recientemente a Suramérica (Almaguer-Pérez, 2007). En un principio, los búfalos traídos a Suramérica tenían un propósito mayoritario de trabajo, pero al demostrar ser una especie rustica y con una capacidad de producir carne y leche de excelente calidad, ha venido siendo utilizada para la producción (Singh y col. 2000; Rensis y López-Gatius, 2007). En Colombia, los últimos 20 años ha aumentando notablemente el interés por la producción bufalina, viéndose un aumento en el número de cabezas y en la constitución de una Asociación de Productores de Búfalos (Aso búfalos de Colombia) (Cervantes y col. 2010). La especie bufalina ha alcanzado una gran importancia socioeconómica debido a la capacidad de producir leche y carne y al utilizarse para el trabajo en el campo. Los búfalos son muy rústicos y resistentes, por lo que se han adaptado a las condiciones del trópico bajo colombiano (Cervantes y col. 2010). Además, la leche de búfala es de alta calidad y es mejor pagada por las plantas

procesadoras de lácteos; mientras que, para la producción de carne, se ha reportado ganancia de peso similares y en algunos casos superiores a las reportadas por los bovinos en las mismas condiciones (Rensis y López-Gatius, 2007; Cervantes y col. 2010). Dentro de la especie Bubalus bubalis sp se encuentran 19 razas diferentes de las cuales se destacan Carabao, Mediterránea, Murrah y Jafarabadi (Almaguer-Pérez, 2007) siendo estas tres últimas las más difundidas en nuestro país (Cervantes y col. 2010). La productividad del sistema bufalino esta en gran parte limitada por la eficiencia reproductiva de las búfalas. Estas poseen grandes diferencias al compararlas con las vacas. Las búfalas son menos precoces, son poliéstricas estacionales de días cortos, aunque en zonas ecuatoriales presentan celos durante todo el año, y tienen un periodo de gestación mayor (Drost M. 2007; Azawi y col. 2008). Adicionalmente, el tamaño del ovario de la búfala es menor y esto ha sido asociado a una menor presencia de folículos preantrales. Se ha reportado que la búfala posee casi 10 veces menos folículos preantrales que la vaca, con una mayor tasa de atresia folicular y una menor cantidad de folículos antrales durante el desarrollo de la onda folicular (Kumar y col 1997; Mondadori y col. 2007; Mondadori y col. 2010). Estas diferencias en la fisiología ovárica impactan negativamente la eficiencia de los programas de biotecnología en la especie bufalina. Autores han reportado una baja concepción luego de la sincronización de celos, la cual es aún menor cuando la sincronización se realiza fuera de la estación reproductiva, durante la cual muchas búfalas pueden presentar inactividad ovárica (Rensis y col. 2007). Otras biotecnologías como la superovlación, la transferencia de embriones y la aspiración folicular, tampoco llegan a tener la eficiencia encontrada en la especie bovina (Campanile y col. 2010). El conocimiento y entendimiento de los fenómenos fisiológicos que se presentan en el ovario bovino permitió el desarrollo de biotecnologías reproductivas que potencializan la explotación de los gametos femeninos y la eficiencia reproductiva de las vacas. A pesar de la importancia que tienen los búfalos en la economía mundial y regional, existen aun pocos estudios que ahonden la fisiología ovárica de la búfala. El objetivo del presente estudio es determinar cómo es la dinámica folicular y el patrón de crecimiento y regresión del cuerpo lúteo de búfalas y buvillas de la raza Murrah sometidas a condiciones del trópico bajo colombiano.

2. OBJETIVOS: GENERAL: Determinar la dinámica folicular y el crecimiento y regresión del cuerpo lúteo de búfalas y buvillas de la raza Murrah en el trópico bajo colombiano ESPECÍFICOS: Determinar la duración del ciclo estral en búfalas y buvillas Murrah ubicadas en el trópico bajo colombiano. Establecer el número de ondas foliculares, el día de su emergencia y el número de folículos reclutados durante el ciclo estral en búfalas y buvillas Evaluar el patrón de crecimiento, desarrollo y regresión del cuerpo lúteo de búfalas y buvillas.

3. MARCO TEÓRICO: a. Anatomía del tracto reproductivo de la búfala: El tracto reproductivo de la búfala consta de un par de ovarios, un par de oviductos, el útero que tiene dos cuernos, el cérvix, la vagina y los genitales exteriores. La posición anatómica de estas estructuras es muy similar a la encontrada en los bovinos (Azawi y col. 2008). En términos generales, su tracto reproductivo es más firme, porque su túnica muscular suele ser más gruesa (Drost M. 2007). Los ovarios son más pequeños que en la vaca, tienen una forma ovoide o almendrada, miden 0,5 a 3 cm de ancho, 1,1 a 5 cm de largo y de 0,5 a 2,5 cm de espesor y pesan alrededor de 3,4 g. Cumplen una función endocrina (producción de hormonas) y exocrina (producción de oocitos) (Drost M. 2007; Azawi y col. 2008). Para esto, el parénquima del órgano cuanta con una organización consistente en medula vascular (en el centro del órgano) donde se ubican principalmente venas, arterias y vasos linfáticos; y en corteza ovárica donde se encuentran los folículos en sus diferentes etapas de desarrollo (Singh y col. 2000). Se han registrado por diversos autores (Baruselli y col. 1997; Kumar y col. 1997; Mandadori y col. 2007) las siguientes medidas para los folículos ovarianos en búfalas (tabla 1): Tabla 1: Tamaño del folículo de acuerdo a su estadio de desarrollo en la onda de crecimiento folicular. Tipo de Folículo Tamaño Autor Primordial 35 μm Mandadori y col. 2007 Primario 41.8 μm Mandadori y col. 2007 Secundario 50-100 μm Kumar y col. 1997 Terciario 100-300 μm Kumar y col. 1997 Ovulatorio 13-16 mm Baruselli y col. 1997

Además, ha sido reportado que el número de folículos primordiales disponibles en búfalas (12.000) es menor que el reportado en vacas (150.000) y que también presentan una mayor tasa de atresia (Kumar y col 1997; Mondadori y col. 2007; Mondadori y col. 2010). Este puede deberse a que, los bovinos han sido seleccionados durante décadas de acuerdo a su potencial reproductivo, a diferencia de lo que ha ocurrido con los bubalinos, donde son escasos los programas de mejoramiento genético (Kumar y col. 1997; Mondadori y col. 2010). Otra diferencia con los bovinos es el cuerpo lúteo, que en los bufalinos suele encontrarse más inmerso en el estroma ovárico (Figura 1). En búfalas el CL maduro varía de 10-15 mm versus de 12.5-25 mm en la vaca (Singh y col. 2000; Drost M. 2007). Figura 1: El cuerpo lúteo de la búfala se encuentra más inmerso en el estroma ovárico que el cuerpo lúteo de la vaca. Además, la papila ovulatoria es menos prominente. Esto hace que sea más difícil la palpación transrectal del cuerpo lúteo en la búfala que en la vaca (tomado de Drost, 2007). Los oviductos son los órganos que se encargan de dar paso al oocito. Este, luego de la ovulación, es atrapado por las fimbrias y llega a la luz oviductal donde, en caso de realizarse la copula, sucede la fertilización. Adicionalmente, el oviducto provee un ambiente óptimo para los gametos masculinos, que deben sufrir capacitación espermática para adquirir potencial fertilizante. En las búfalas los oviductos son de paredes muy gruesas, pues poseen abundante tejido muscular. Su longitud varía entre los 18 a 22 cm y tiene un ancho aproximado de 45 mm (Azawi y col. 2008).

El útero es de tipo bicorne es decir que tiene dos cuernos. Estos son sumamente enrollados sobre sí mismos en la búfala y pueden medir de 2,2 a 2,5 cm de ancho y de 31 a 34 cm de longitud en la hembra vacía. El cuerpo uterino es bastante corto (0,8-1,3 cm de longitud). El útero se encargará de proveer un ambiente óptimo para que se dé e desarrollo inicial del embrión, la posterior implantación y el desarrollo fetal hasta el parto (Azawi y col. 2008; Martin y col. 2008). El cérvix o cuello uterino, difiere del de la vaca, por ser más pequeño y tener una luz más tortuosa y reducida. Puede constar de 3 a 5 anillos cervicales y tener una longitud que varía entre los 5,5 y 6,5 cm. La vagina es el órgano de la copula. Posee una pared gruesa y en su luz una mucosa. Puede medir entre 17 y 22 cm de largo. La vulva tiene dos comisuras, la superior es levemente redondeada mientras que la inferior forma una angulación algo aguda. Se observa un clítoris rudimentario, con labios carnosos y escasos pelos. b. Ciclo estral y dinámica folicular en la búfala: La primera ovulación ocurre en la búfala alrededor de los 15 a 18 meses, pero esta se ve muy influenciada por factores como la nutrición, la región y la condición corporal. Las búfalas se consideran poliestricas estacionales de días cortos con una duración del ciclo estral de aproximadamente 21 días (rango 18-24 días) (Singh y col. 2000; Drost M. 2007). Sin embargo, se ha encontrado que en los países tropicales, donde no hay estaciones, la función reproductiva se ve influenciada principalmente por la oferta de alimentos, siendo un poliestrico continuo (Baruselli y col. 1997; Campanile y col. 2010). El estro tiene una duración aproximada de 18 horas (rango 5-36 horas), pero los signos de celo son muchos menores en comparación con la vaca. Adicionalmente, no es común el comportamiento homosexual durante el celo. La ovulación ocurre aproximadamente 30 horas luego de iniciarse el estro (Warriach y Ahmad, 2007). Se ha reportado que la mayoría de las búfalas presentaron celos de alta intensidad (75.6%) y larga duración (80%), con más de la mitad de las búfalas expresando ambas características (57.8%) (Baruselli y col. 1997; Warriach y Ahmad, 2007). Al igual que en los bovinos, el desarrollo folicular se da en ondas (Martin y col. 2008). Una onda consta de las etapas de reclutamiento, selección y dominancia (Awasthi y col. 2006). Este desarrollo sucede por el control ejercido por las hormonas GnRH-FSH-LH (Presicce y col. 2004). Durante el reclutamiento, un grupo de folículos un grupo de folículos, estimulados por la FSH, inicia su desarrollo hacia la ovulación o la atresia (Presicce y col. 2004). Posteriormente, algunos

folículos seleccionados continúan su crecimiento, mientras que los demás dan inicio a la atresia folicular. Finalmente en la dominancia, un folículo alcanza un mayor desarrollo que los demás folículos de su misma onda de crecimiento (Baruselli y col. 1997; Awasthi y col. 2006). El destino del folículo dominante dependerá de la situación hormonal en la cual se desarrolle es decir, si el folículo dominante se desarrolla bajo la presencia de progesterona proveniente de un cuerpo lúteo, este sufrirá atresia (Presicce y col. 2004). Sin embargo, si este folículo logra la dominancia durante la fase folicular, ovulara gracias al estimulo proveniente del pico de LH (Figura 2). En la búfalas, se ha encontrado que dos ondas de crecimiento folicular es el patrón más común (63.3%), en comparación con tres (33.3%) y una onda (3.3%). El número de ondas influye en la duración del ciclo estral (Awasthi y col. 2006; Campanile y col. 2010; Perera B.M.A.O. 2011). Figura 2: representación esquemática de los cambios hormonales de la búfala durante su ciclo estral (tomado de: Perera, 2011).

4. MARCO METODOLÓGICO: a. Materiales y métodos: Localización: la fase experimental se llevará a cabo en las instalaciones del Centro Internacional para la Formación Agropecuaria (CIFA), ubicado en el municipio de Puerto Salgar (Cundinamarca, Colombia). Este municipio se encuentra a 195 km de Bogotá DC, a 117 msnm y una temperatura promedio de 27 C. Animales: se utilizarán dos grupos experimentales de 10 individuos cada uno. Un grupo con hembras buvillas vírgenes y otro grupo con hembras multíparas. Todos los individuos serán de la raza Murrah y se encontrarán bajo las mismas condiciones ambientales, nutricionales y de manejo. Adicionalmente, todos los animales se encontrarán cíclicos al iniciar el experimento (Fotografía 1). Fotografía 1: búfalas que se utilizarán en el experimento Protocolo de sincronización: se utilizará un protocolo convencionalmente utilizado para realizar inseminación artificial a término fijo (Figura 3). Este protocolo consiste en la

aplicación de un dispositivo intravaginal que libera progesterona al día cero, junto con la aplicación de 2 mg de benzoato de estradiol. Posteriormente al día 8 se retira el dispositivo intravaginal y se aplica PGF2 alfa y 400 UI de Novormon. Finalmente al día 9 se aplican 2 mg de BE. Figura 3: Protocolo de sincronización que se utilizará en búfalas y buvillas. Seguimiento ultrasonográfico: no se realizará una inseminación artificial luego del celo del protocolo de sincronización. 15 días después se dará inicio a la detección de celos y al seguimiento ultrasonográfico diario. Se tomará el día del celo como el día cero y a partir de ese momento se realizaran dos ecografías transrectales diarias (mañana y tarde) con el fin de hacer mapeos ováricos que permitan evaluar el número y diámetro de los folículos antrales y el diámetro del CL (Presicce y col. 2004). Procesamiento de datos y análisis estadístico: con la información proveniente del mapeo ovárico y la detección de celos se obtendrán los siguientes datos: o Duración del Ciclo estral (Intervalo Estro-Estro) o Número de ondas foliculares en un ciclo estral o Día de emergencia de las ondas foliculares o Número de folículos reclutados en cada una de las ondas o Día y diámetro de la desviación del folículo dominante (dos desviaciones estándar por enzima que la media de los folículos de su cohorte) o Diámetro de ovulación del folículo dominante

o Regresión del CL (segundo día consecutivo en el cual disminuye el diámetro de la estructura) Se realizará estadística descriptiva a cada una de las variables analizadas. Se utilizará una prueba de Fisher para comparar los datos provenientes de las buvillas y las búfalas. b. Recursos, Materiales y Drogas: Tabla 2: Recursos, materiales y drogas requeridos para la realización del proyecto. No. Ítem Valor Unitario Valor 1 Mangas de Palpación rectal Ultrasensibles (Caja) 50.000 200.000 2 Lubricante (frasco) 5.000 20.000 3 Ecógrafo (Mindray DP 2200 Vet) 25.000.000 25.000.000 4 Papelería 100.000 100.000 5 Dispositivos intravaginales (ouro fino) 8 dias 18.000 360.000 6 2 mg BE día 0 y día 9 (ouro fino) 2.500 50.000 7 Dia 8 PGF (ouro fino sincrodiol) novormon 4000 80.000 8 Computador portátil 2.000.000 2.000.000 9 Papelería NA 20.000 10 Cámara Fotográfica 500.000 500.000 c. Recursos financiaros El experimento se llevará a cabo en las instalaciones del Centro internacional para la Formación Ganadera CIFA. Ubicado en Puerto Salgar Cundinamarca. El centro permitirá la utilización de los animales, así como de la infraestructura y el ecógrafo. Todos los demás rubros serán financiados por el estudiante Alejandro Ojeda Rojas. d. Infraestructura: El experimento se llevará a cabo en las instalaciones del Centro Internacional de Formación Agropecuaria (CIFA) donde se contará con potrero de experimentación, corrales, manga y brete (Fotografías 2 y 3).

Fotografía 2: corral de espera a la salida del ordeño en el Centro Internacional de Formación Agropecuaria (CIFA) Fotografía 3: instalaciones para el manejo de los animales y la recolección de datos durante la fase experimental.

CRONOGRAMA: Tabla 3: cronograma de actividades a realizar durante la ejecución del proyecto. En Meses 1 2 3 4 5 6 Presentación del anteproyecto X Selección de los animales, X sincronización de celos Seguimiento ultrasonográfico X X Análisis de la información X X X Entrega de resultados X Revisión de literatura X X X X X X

5. RESULTADOS ESPERADOS: Con el presente estudio se pretende dar una aproximación inicial a las características propias de la dinámica folicular y desarrollo luteal de las búfalas en condiciones del trópico bajo colombiano. Adicionalmente, se quiere determinar si existe alguna diferencia en estas variables al comparar buvillas con búfalas. Con la realización de este estudio, se pretende obtener información útil para los médicos veterinarios que se desempeñen el área de reproducción y biotecnología de búfalas en el trópico bajo colombiano. La realización de este estudio permitirá la formación de un estudiante de Especialización en Biotecnología de la Reproducción Bovina. Se espera lograr la publicación de los resultados provenientes de este proyecto en una revista científica.

6. BIBLIOGRAFÍA: o Almaguer-Pérez Y. 2007. El búfalo, una opción de la ganadería. REDVET 8(8). En: http://www.produccion-animal.com.ar/informacion_tecnica/razas_de_bufalos/99- opcion.pdf o Awasthi M.K., Khare A., Kavani F.S., Siddiquee G.M., Panchal M.T., Shah R.R. 2006. Is one-wave follicular growth during the estrous cycle a usual phenomenon in water buffaloes (Bubalus bubalis)?. Anim Reprod Sci 92: 241-253. o Azawi O.I, Ali A.J., Lazim E.H. 2008. Pathological and anatomical abnormalities affecting buffalo cows reproductive tracts in Mosul. Iraqi J Vet Sci 22 (2): 59-67 o Baruselli P.S., Mucciolo R.G., Visintin J.A., Viana W.G., Arruda R.P., Madureira E.H., Oliveira C.A., Molero-Filho J.R. 1997. Ovarian follicular dynamics during the estrous cycle in buffalo (Bubalus bubalis). Theriogenology 47: 1531-1547. o Campanile G., Baruselli P.S., Neglia G., Vecchio D., Gasparrini B., Gimenes L.U., Zicarelli L., D'occhio M.J. 2010 Ovarian function in the buffalo and implications for embryo development and assisted reproduction. Anim Reprod Sci 121: 1-11. o Cervantes E., Espitia A., Prieto E. 2010. Viabilidad de los sistemas bufalinos en Colombia. Rev Colombiana Cienc Anim 2(1): 215-224 o Drost M. 2007. Bubaline versus bovine reproduction. Theriogenology 68: 447-449. o Martin I., Irikura C.R., Gimenes L.U., Barroso Orlandi C.M., Oba E., Pinheiro Ferreira J.C. 2008. Ovarian follicular dynamic during early pregnancy in buffalo bubalus bubalis heifers. Ciência Anim Bras 9(1): 121-127. o Kumar A., Solanki V.S., Jindal S.K., Tripathi V.N., Jain G.C. 1997. Oocyte retrieval and histological studies of follicular population in buffalo ovaries. Anim Reprod Sci 47: 198-195. o Mondadori R.G., Luque M.C.A., Santin T.R., Báo S.N. 2007. Ultrastructural and morphometric characterization of buffalo (bubalus bubalis) ovarian preantral follicles. Anim Reprod Sci 97: 323-333. o Mondadori R.G., Santin T.R., Fidelis A.A.G., Porfírio E.P., Báo S.N. 2010. Buffalo (bubalus bubalis) pre-antral follicle population and ultrastructural characterization of antral follicle oocyte. Reprod Domest Anim 45: 33-37.

o Perera B.M.A.O. 2011. Reproductive cycles of buffalo. Anim Reprod Sci 124: 194-199. o o o o Presicce G.A., Senatore E.M., Bella A., Santis G.D., Barile V.L., Mauro G.J.D., Terzano G.M., Stecco R., Parmeggiani A. 2004. Ovarian follicular dynamics and hormonal profiles in heifer and mixed-parity Mediterranean Italian buffaloes (Bubalus bubalis) following an estrus synchronization protocol. Theriogenology 61: 1343-1355. Rensis F.D., López-Gatius F. 2007. Protocols for synchronizing estrus and ovulation in buffalo (bubalus bubalis): a review. Theriogenology 67: 209-216. Singh J., Nanda A.S., Adams G.P. 2000. The reproductive pattern and efficiency of female buffaloes. Anim Reprod Sci 60-61: 593-604. Warriach H.M., Ahmad N. 2007. Follicular waves during the oestrous cycle in nili-ravi buffaloes undergoing spontaneous and PGF2alpha-induced luteolysis. Anim Reprod Sci 101: 332-337.