I Curso sobre Bioindicación en EDARS de fango activo.

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1 I Curso sobre Bioindicación en EDARS de fango activo. ESTUDIO DE: CARACTERÍSTICAS MACRO- Y MICROSCÓPICAS, BACTERIAS FILAMENTOSAS Y MICROFAUNA DE UN FANGO ACTIVO. Laura Isac, Eva Rodríguez y Natividad Fernández

2 ESTUDIO DE LAS CARACTERÍSTICAS MACRO- Y MICROSCÓPICAS DE UN FANGO ACTIVO Características macro- y microscópicas de un fango activo 1. Introducción a la microbiología en depuradoras de fangos activos 2. Evaluación de las características macroscópicas y microscópicas de un fango activo 2.1. Observación macroscópica del fango activo 2.2. Observación microscópica del fango activo 2.3. Preparación de muestras para observación microscópica 3. Relación entre el estado estructural de un fango activo y los rendimientos de depuración en planta Bacterias filamentosas en el fango activo 4. Estudio de las claves de identificación de bacterias filamentosas: principales características taxonómicas 5. Técnicas de tinción de bacterias filamentosas 5.1. Tinción Gram (Método Hücker modificado) 5.2. Tinción Neisser (Método de Eikelboom y van Buijsen, 1981) 5.3. Procedimiento de observación de muestras fijadas y teñidas 6. Cuantificación de bacterias filamentosas en una muestra 7. Protocolo para la identificación de organismos filamentosos Microfauna de un fango activo 8. Nociones básicas en bioindicación. 9. Conocimientos básicos sobre Protistas. 10. Índice biótico de fangos (SBI, Sludge Biotic Index) o Método Madoni. 11. Instrucciones para la observación microscópica. 12. Formatos de recogida de datos. 13. Bibliografía. Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 2

3 Microfauna de un fango activo 8. Nociones básicas en bioindicación. PREMISAS: - Se requieren unos conocimientos mínimos en protozoología que permitan al especialista la distinción de los grandes grupos de protistas (ciliados, flagelados, amebas testáceas, etc.), así como la pertenencia de éstos a los denominados grupos funcionales (Madoni, 1994) (sésiles, reptantes, nadadores, algunas especies en particular, etc.). - El estudio microbiológico (microfauna y estado estructural) de un fango activo debe ser una actividad diaria en la EDAR, que permita un histórico de datos suficiente sobre el que aplicar estudios estadísticos, con los que establecer las relaciones bioindicadoras en la planta estudiada. En este sentido, el estudio de los datos microbiológicos debe ser abordado en conjunción con los parámetros operacionales y físico-químicos de la EDAR. -Cualquier estudio microbiológico de un fango activo en el que las característiscas macro- y microscópicas del flóculo y la población de organismos filamentosos no son tratados de forma conjunta al estudio de la microfauna, aporta información sesgada sobre el estado real del sistema de tratamiento. NOCIONES BÁSICAS SOBRE BIOINDICACIÓN: -Los flagelados son organismos poco frecuentes en sistemas de depuración maduros bajo condiciones estables de funcionamiento. Suelen observarse en las fases de puesta marcha del proceso en compañía de rizópodos, para seguidamente ser reemplazados por los ciliados. Una población de flagelados abundante indica la presencia de algún tipo de alteración en el sistema. -Los rizópodos, al igual que los flagelados, son poco frecuentes en sistemas de depuración maduros. Pueden aparecer durante las fases de arranque junto con los flagelados, siendo sustituidos posteriormente por los ciliados. Sin embargo, las amebas testáceas pueden aparecer de forma estable junto con algunos ciliados en sistemas que funcionan a elevados tiempos de retención celular (TRC) y en los que las condiciones de oxigenación son favorables. Con frecuencia, las amebas testáceas están asociadas a estados de nitrificación en el reactor. -Los ciliados nadadores son más abundantes en las fases de puesta en marcha que en fangos maduros. En las fases maduras de colonización, la presencia del flóculo de fango activo, sustrato de los ciliados sésiles, asegura la presencia de éstos, claros competidores con los nadadores por las bacterias en disolución. Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 25

4 -En un fango activo, se entiende que la sucesión de microorganismos ocurre de la siguiente manera (Madoni, 1994) (Figura 2): Figura 2. Sucesión de microorganismos durante el establecimiento de la biomasa en un fango activo (En Madoni, 1994) -Los ciliados reptantes y sésiles dominan de forma conjunta la microfauna de un fango activo maduro, bajo condiciones estables de funcionamiento. Esta situación se debe a la dependencia de ambos grupos por la presencia de flóculos de fango activo y a la falta de competencia por el alimento. La relación entre ambas poblaciones está en dependencia con ciertas condiciones ambientales como la concentración de carga orgánica en el reactor. -Normalmente, un fango activo bajo condiciones estables de funcionamiento presenta estas 3 características (Madoni, 1994): ٱ La población de protozoos se presenta en una densidad superior a 10 6 ind L -1 ٱ La microfauna se compone principalmente de ciliados reptantes y sésiles, sin apenas presencia de flagelados ٱ Las especies y grupos de ciliados están muy diversificadas, de manera que ningún grupo supera numéricamente a otro con un factor superior a 10 En el caso de que estas premisas no se cumplan, la identificación del grupo dominante permitirá obtener información sobre la situación particular del sistema (Tabla 3). En fangos activos, la clasificación de protistas empleada con mayor frecuencia es la que atiende a la relación establecida entre los protozoos, el flóculo y los hábitos alimenticios (Tabla 4). Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 26

5 Tabla 3. Algunas situaciones en planta reflejadas en la observación microscópica y puestas de manifiesto con la dominancia de un grupo u otro del conjunto de la microfauna (En Madoni, 1994): GRUPO DOMINANTE NIVEL DE DEPURACIÓN POSIBLES CAUSAS Pequeños flagelados Pequeños nadadores (ciliados) Grandes nadadores (ciliados) Ciliados reptantes Ciliados sésiles y reptantes Ciliados sésiles Amebas desnudas y flagelados Amebas testáceas Bajo Mediocre Mediocre Bueno Bueno En descenso Pobre Bueno Oxigenación insuficiente; sobrecarga orgánica; sustancias en fermentación TRC escaso; fango con aireación insuficiente Sobrecarga orgánica; fango pobremente aireado Transitoriedad en la carga orgánica, extracción de fangos reciente, etc. Carga orgánica muy alta, poco degradable --- Tabla 4. Protistas más frecuentes en fangos activos atendiendo a los hábitos alimenticios y a la relación con el flóculo de fango activo (Madoni, 1994). Carnívoros Nadadores Bacterívoros Reptantes Sésiles Holotricos Acineria incurvata Amphileptus sp. Coleps hirtus Litonotus spp. Spathidium spp. Suctores Acineta spp. Metacineta sp. Podophrya spp. Tokophrya spp. Colpoda sp. Colpidium colpoda Colpidium campylum Cinetochilum margaritaceum Cyclidium glaucoma Dexiotricha sp. Glaucoma scintillans Loxocephalus sp. Paramecium spp. Pseudochohnilembus pusillus Sathrophilus sp. Spirostomum teres Tetrahymena pyriformis Uronema nigricans Aspidisca cicada Aspidisca lynceus Chilodonella uncinata Euplotes affinis Euplotes moebiusi Euplotes patella Stylonychia spp. Trithigmostoma cucullulus Trochilia minuta Acineria uncinata Drepanomonas revoluta Carchesium spp. Epistylis spp. Opercularia coarctata Opercularia microdiscus Opercularia minima Stentor spp. Vaginicola crystallina Vorticella convallaria Vorticella microstoma Vorticella octava Zoothamnium spp. Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 27

6 9. Conocimientos básicos sobre Protistas. Las bacterias consituyen aproximadamente el 90-95% de la biomasa de un reactor y son los principales responsables de la transformación/oxidación de la materia orgánica y otros contaminantes como los nutrientes (nitrógeno y fósforo). Los protistas representan un 5% de la biomasa y cumplen funciones esenciales para el desarrollo del proceso: 1 las poblaciones bacterívoras mantienen activas las poblaciones bacterianas y contribuyen a la eliminación de bacterias patógenas; 2 participan en el proceso de floculación secretando exopolímeros, configurando la estructura del flóculo. Además, los protozoos son excelentes indicadores del estado de funcionamiento del sistema. Tanto las bacterias como los protistas se pueden dividir en dos grandes grupos en función del nicho ecológico ocupado en el reactor biológico: microorganismos asociados al flóculo (bacterias y protistas "floculantes") y microorganismos dispersos, no asociados al flóculo. Los primeros son los más significativos en la planta y constituyen la comunidad autóctona de los reactores biológicos pues se reciclan por un sistema de recirculación y no son eliminadas con el efluente. Dentro de los protistas, los ciliados se han clasificado siguiendo un criterio ecológico en los siguientes grupos "funcionales" (Serrano et al., 2004): - Sésiles: asociados al flóculo de forma permanente por medio de pedúnculos de fijación. Epistylis sp. Ciliado sésil colonial Vorticella sp. Ciliado sésil solitario - Reptantes: ciliados aplanados que se asocian al flóculo a través de cilios o cirros que se disponen de forma preferente en una de las superficies corporales. Aunque pueden desprenderse y nadar ocasionalmente en el medio, se consideran como parte de la comunidad floculante. Aspidisca sp. Chilodonella sp. Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 28

7 Algunos de estos ciliados se han llamado reptantes-nadadores, pues se pueden encontrar tanto asociados al flóculo como en el licor mixto. Estos ciliados suelen ser aplanados, si bien los cilios somáticos se distribuyen de forma diferente a ambos lados del cuerpo. Litonotus sp. - Nadadores: ciliados que se mueven libremente en el licor mixto, por lo que no forman parte de la comunidad estable en el sistema de depuración. Glaucoma sp. Paramecium sp. La comunidad de protistas en las estaciones depuradoras de fangos activos es menos diversa en cuanto a número de especies que en los medios naturales, puesto que las condiciones del sistema están restringidas por el diseño de las plantas y las características de los vertidos, podríamos definirlo como un "ecosistema artificial" que opera bajo condiciones restringidas. Para la identificación de los géneros y especies de protistas presentes en una muestra de fango activo se recurre al empleo de claves de identificación, en las que se utilizan características observables con los métodos de microscopía óptica convencional o tinciones simples. Es frecuente recurrir a técnicas de tinción específica que permiten la observación de estructuras difícilmente observables en vivo. Sin embargo, la observación en vivo es también un paso fundamental en la identificación, ya que algunas características sólo son observables de esta manera y en algunos grupos permiten la confirmación a nivel específico. La primera clave propuesta es la realizada en función del tipo de movimiento y los apéndices implicados en el mismo, puesto que este carácter morfológico es relativamente fácil de distinguir en las observaciones microscópicas. No obstante, profundizaremos en esta cuestión durante las sesiones prácticas. Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 29

8 Existe una primera clasificación 1, muy elemental, que responde al tipo de movimiento: Apéndices locomotores FLAGELADOS CILIADOS Pseudópodos AMEBAS DESNUDAS AMEBAS TESTÁCEAS HELIOZOOS 1 Los esquemas de los organismos aquí recogidos, con excepción del "Ciliado tipo", proceden del manual Streble y Krauter (1987) Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 30

9 Características morfológicas en FLAGELADOS: Flagelo Sáculo de los flagelos Estigma Flagelos Cloroplasto Núcleo Euglena viridis Heteronema acus Estriación de la membrana 2 Flagelos Peranema tricophorum Bodo sp. Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 31

10 Características morfológicas en SARCODINOS: AMEBAS DESNUDAS Núcleo Pseudópodos Ectoplasma Amoeba sp. Vahlkampfia vahlkampfi Vahlkampfia limax Endoplasma AMEBAS TESTÁCEAS Testas aglutinadas Nebela collaris Opérculo Difflugia spp. Pseudópodo Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 32

11 AMEBAS TESTÁCEAS (continuación) Testas transparentes Arcella sp. Euglypha alveolata HELIOZOOS Endoplasma Vacuolas de turgencia Actinophrys sp. Axópodos Núcleo Ectoplasma Actinosphaerium sp. Vacuolas digestivas Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 33

12 Características morfológicas en CILIADOS (I): Ciliado tipo Serrano et al., 2004 Cirros frontales Cirros frontoventrales Cirros ventrales Zona adoral de membranelas (ZAM) Vacuola contráctil Cirros transversos Ciliado tipo Espirotrico Cirros caudales Ciliado tipo Espirtotrico ZAM Macronúcleo Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 34

13 Características morfológicas en CILIADOS (II): Zooide Ciliación oral Macronúcleo Estriación Cinturón aboral Pedúnculo Espasmonema Ciliado tipo Oligohimenóforo peritrico Formación de larva trocófora Tentáculos Vacuola contráctil Núcleo Pedúnculo Ciliado tipo Suctor Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 35

14 10. Índice biótico de fangos (SBI, Sludge Biotic Index) o Método Madoni (Madoni, 1994). Procedimiento que permite estimar la calidad del fango activo y su nivel de actividad biológica. Es decir, proporciona información sobre el estado depurador del sistema y en consecuencia sobre la eficiencia depuradora de la planta. Para la determinación del SBI es necesario llevar a cabo la caracterización de la microfauna y la determinación de las siguientes variables: - Grupo funcional dominante: Como "grupo funcional" se entienden diferentes grupos de protozoos, especies y asociaciones de grupos de protozoos ciliados que, por las condiciones ambientales a las que están asociados, son tenidos en cuenta en la determinación de este índice cuando aparecen de forma dominante sobre el conjunto de la microfauna. Ciliados reptantes + sésiles* y/o amebas testáceas Ciliados sésiles* > 80% Opercularia spp. Vorticella microstoma Ciliados nadadores bacteriófagos Pequeños flagelados nadadores (>100)** *Opercularia spp. y Vorticella microstoma no abundantes **Diagonal completa de la cámara de Fuchs-Rosenthal - Densidad de individuos: número de individuos por litro. Calculados como media de varios recuentos. - Diversidad de la microfauna: número de unidades taxonómicas diferentes identificadas en la muestra. En el SBI se entiende como "unidad taxonómica" la determinación de un organismo a nivel especie y nivel género en el caso de protozoos ciliados y amebas testáceas, respectivamente; en el caso de los metazoos (rotíferos y nematodos) y flagelados, no es necesaria la identificación para ser considerados como unidades taxonómicas, tan sólo el reconocimiento del grupo "rotíferos" o "nematodos", respectivamente. - Número de pequeños flagelados: recuento realizado sobre la diagonal completa de la cámara Fuchs-Rosenthal. Serán tenidos en cuenta cuando superen el número de 10. Una vez conocidos los datos concernientes a las variables anteriormente expuestas (grupo dominante, diversidad, etc.), el procedimiento se limita a la determinación de un valor numérico (0-10) en una tabla de doble entrada. Dicha tabla de doble entrada (Tabla 5) ha sido elaborada a partir de estudios de correlación desarrollados sobre los datos de microfauna y algunos de los parámetros operacionales Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 36

15 más importantes, tomados en diversas EDAR. Son dos los principios básicos en la determinación de este índice: (1) La dominancia de los distintos grupos funcionales que componen la microfauna está en relación con las condiciones ambientales y operacionales de la planta. (2) El funcionamiento del proceso empeora conforme se reduce el número de especies y grupos funcionales de la microfauna. Tabla 5. Tabla de doble entrada para la determinación del valor del SBI. Grupo dominante Densidad > <5 (ind./l) F <10 10<F<100 F <10 10<F<100 F <10 10<F<100 F <10 10<F<100 > < > < > < > < > < > < Notación: 1. Ciliados reptantes + sésiles* y/o amebas testáceas 2. Ciliados sésiles* > 80% 3. Opercularia spp. 4. Vorticella microstoma 5. Ciliados nadadores bacteriófagos 6. Pequeños flagelados nadadores (> 100) ** *Opercularia spp. y Vorticella microstoma no abundantes **Diagonal completa en la cámara de Fuchs-Rosenthal F<10 Menos de 10 pequeños flagelados en la diagonal de la cámara de recuento 10<F<100 Entre 10 y 100 pequeños flagelados en la diagonal de la cámara >10, 8-10, 5-7, < 5 Número de unidades taxonómicas Finalmente, una vez determinado el valor númerico del SBI, es necesario buscar la correspondencia con la calidad de fango que determina este método (Tabla 6). Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 37

16 Tabla 6. Clases de fango según el valor del SBI. SBI CLASE DIAGNOSIS 8-10 I 6-7 II 4-5 III Fango estable y muy bien colonizado, excelente actividad biológica y muy buen funcionamiento Fangos estable y bien colonizado, actividad biológica en descenso; buen funcionamiento Depuración biológica insuficiente en la balsa de aireación; funcionamiento medio 0-3 IV Depuración biológica escasa en la balsa de aireación; bajo rendimiento Índice Shannon-Weaver: La expresión para el cálculo de este índice es la siguiente: H = - Σ (p i ) (log 2 p i ) (bit/individuo) Siendo, Σ (p i ) = 1 p i = nº individuos de la especie i/nº total de individuos de la muestra Es el índice de diversidad más empleado en ecosistemas acuáticos. Es una medida cuantificable y objetiva que define los taxones y su proporción en el ecosistema. 11. Instrucciones para la observación microscópica. La observación de una muestra de fango activo requiere los siguientes pasos: - Observación cualitativa: para este procedimiento se puede proceder a concentrar la muestra. Consiste en realizar la identificación de todas las especies presentes. En las preparaciones en fresco, los microorganismos se encuentran vivos y pueden observarse directamente, empleando el contraste aportado por el propio material biológico o empleando el contraste de fases si es que el material biológico es de densidad homogénea. También pueden utilizarse diversos colorantes que pongan de manifiesto alguna estructura de interés como la tinción verde de metilo en protozoos (específica para núcleos), por ejemplo. Para la determinación de organismos es necesario observar sus estructuras internas: núcleo, vacuolas pulsátiles, flagelos, patrones de ciliación, etc. Algunas de Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 38

17 estas estructuras sólo son observables mediante métodos de tinción y por ello, a veces, es necesario cultivar los organismos. Estos métodos de tinción, especialmente indicados para la identificación de ciliados son, sobre todo, técnicas de impregnación argéntica (Fernández-Galiano, 1994; Impregnación con nitrato de plata de Klein, 1926) que permiten poner de manifiesto patrones de ciliación, núcleos, etc. - Recuento de microorganismos u observación cuantitativa: este procedimiento requiere realizar un mínimo de 3 recuentos de la microfauna sobre 25 µl de volumen. Es importante no olvidar que los microorganismos presentes en los bordes de la preparación también han de ser contabilizados. Posteriormente, se efectúan medias y se obtienen los porcentajes de especies y de grupos funcionales. El recuento de microfauna también puede efectuarse sobre una muestra previamente fijada con Líquido de Bouin. importante contabilizar los microorganismos aquí presentes Una vez efectuada la observación de la muestra y los recuentos de microfauna, se llevan a cabo los siguientes análisis: - Análisis de la diversidad de la muestra (protozoos ciliados) mediante la aplicación de índices de diversidad (Shannon-Weaver (1949), Margalef (1951), etc.). - Análisis del conjunto de la microfauna según el Método Madoni o SBI, índice de aplicación específica a fangos activos que permite extraer de una forma relativamente sencilla, información sobre el estado de depuración del sistema (Madoni, 1994). Sin embargo, la información aportada por dicho índice debe ser completada y contrastada con otros datos como el estado estructural del fango (bacterias filamentosas, IVF, etc.), la diversidad, parámetros de control y físico-químicos, o la propia experiencia del observador. Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 39

18 13. Bibliografía Arnáiz, C., Jiménez, C. y Estévez, F. (1999). Determinación rápida de microorganismos filamentosos en fangos activos. Tecnología del Agua 193, Departamento de Agua y Saneamiento del Ayuntamiento de Madrid (1997). Manual de laboratorio para el análisis de aguas residuales y lodos de depuración. Ed. Artes Gráficas Municipales. Madrid. EMASESA, (1997). Organismos filamentosos en el fango activo. Departamento de Aguas Residuales de la Empresa Municipal de Abastecimiento y Saneamiento de Aguas de Sevilla, S.A. (EMASESA). Foissner, W. y Berger, H. (1996). A user-friendly guide to the ciliates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hidrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshw. Biol. 35, Isac Oria, L. (2003). Determinación de la actividad biológica aerobia. Aplicación en procesos de depuración de aguas residuales urbanas e industriales. Tesis doctoral. Universidad de Sevilla. Jenkins, D., Richard, M. G. y Daigger, G. T. (1993). Manual on the Causes and Control of Activated Sludge Bulking and Foaming. WRC, Pretoria y USEPA, Cincinnati. Jiménez, C., Fernández, N., de la Horra, J. M., Rodríguez, E., Isac, L., Salas, D. y Gómez, E. (2001). Sistema rápido de estimación de los rendimientos en depuración de una E.D.A.R. en función de las características macroscópicas y microscópicas del fango activado. Tecnología del Agua 216, Laboratorio Central del Departamento de Saneamiento del Ayuntamiento de Madrid (1996). Observación microscópica del fango activo: caracterización del flóculo e identificación de microorganismos filamentosos. Jornadas Prácticas del de mayo de Madoni, P. (1994). A Sludge Biotic Index (SBI) for the evaluation of the biological performance of activated sludge plants based on the microfauna analysis. Wat. Res. 28, 1, Serrano, S., Pérez-Uz, B., Arregui, L. y Calvo, P. (2004). Claves de identificación de Protistas en estaciones depuradoras de fangos activos. Universidad Complutense de Madrid. Ponencia en el curso: "Protozoos en el fango activado". Fundación Emasesa. Sevilla, marzo de Streble, H. y Krauter, D. (1987). Atlas de los microorganismos de agua dulce. La vida en una gota de agua. Ed. Omega, Barcelona. Bibliografía empleada en los esquemas de microorganismos: Streble, H. y Krauter, D. (1987). Serrano, S., Pérez-Uz, B., Arregui, L. y Calvo, P. (2004). Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 40