UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ. FACULTAD DE INGENIERÍA. INGENIERO AGROINDUSTRIAL.

Transcripción

1 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ. FACULTAD DE INGENIERÍA. INGENIERO AGROINDUSTRIAL. por Francisco de Jesús Hernández Negrete. Dr. Luis Manuel Rosales Colunga. Asesor. Noviembre del San Luis Potosí, S.L.P.

2 *Introducción. *Antecedentes. *Objetivos. *Justificación. *Metodología. *Resultados *Cronograma de actividades. *Referencias bibliográficas. 2

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4 Introducción Muchos de los procesos industriales se basan en el uso de combustibles fósiles como el petróleo, gas, y carbón. Dependencia energética. No son renovables. CO2. Efecto invernadero. Calentamiento global. FUENTE: anpier.org/ FUENTE: veoverde.com 4

5 Introducción Alternativas. FUENTE: miliarium.com Productos valiosos a partir de biomasa. FUENTE: curiosidadesdelamicrobiologia.mx Almidón (componente de la biomasa). 5

6 Introducción Almidón. Amilosa (α-glucano lineal). Amilopectina (α-glucano ramificado). FUENTE: blogalimentos.com 6

7 Introducción FUENTE: wikipedia.org/wiki/bacillus_megaterium Microbios capaces de hidrolizar el almidón. 7

8 Introducción Ventajas adaptativas. Métodos de manipulación sencillos. E. coli Amplio conocimiento acerca de sus sistemas. Se pueden modificar para generar una gran variedad de productos y utilizar diversos sustratos. 8

9 Introducción E. coli. Microorganismo modelo. No puede metabolizar almidón. FUENTE: samiorza.blogspot.mx/ 9

10 10 Introducción

11 Introducción E. coli. produce una α amilasa citosólica (AmyA). No es dependiente de maltosa. Cepas de E. coli. para utilizar almidón y otras maltodextrinas y producir compuestos valiosos. FUENTE: elgrafico.mx 11

12 Introducción MalZ AmyA 12

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14 Antecedentes. Wt = cepa silvestre Ingeniería de Escherichia coli K12 MG1655 para utilizar almidón. Amy0 = cepa que secreta AmyA al medio B.M = bacillus megaterium FUENTE: microbialcellfactories.com/content/13/1/74 Actividad de la amilasa secretada. tinción de M9 con Lugol más almidón, placas donde WT, Amy0, y Bacillus megaterium se cultivaron (Rosales-Colunga, 2014). 14

15 Introducción Esta cepa desarrollada tiene la capacidad de hidrolizar y crecer utilizando diferentes tipos de almidón? Diferentes tipos de almidón (dif. Porcentaje de amilosa y amilopectina) 15

16 Evaluar la degradación de distintos tipos de almidón y el crecimiento asociado por distintas cepas de E. coli. FUENTE: 16

17 O. específicos. *Obtener las cepas MG1655 (silvestre) y las mutantes *Evaluar el crecimiento de estas cepas utilizando maltosa y almidón. *Evaluar la degradación del sustrato por cada una de las cepas. *Interpretar el crecimiento de las diferentes cepas mutantes de E. coli. 17 FUENTE: elproyectomatriz.wordpress.com

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19 Justificación. El aprovechamiento de la biomasa es fundamental para establecer procesos sustentables dirigidos a la generación de productos valiosos. Siendo el almidón un componente considerable de la biomasa y un residuo abundante en la industria alimentaria, se busca entender el catabolismo de almidón y sus componentes por uno de los microorganismos más empleados tanto en investigación como en la industria. 19 FUENTE: abc.es

20 H(a): El crecimiento de cada cepa utilizada es influenciado por los distintos tipos de almidón, sin afectar el metabolismo de maltosa. 20

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22 Metodología. *Se desarrollaron por medio de herramientas de biología molecular. 22

23 Metodología. * Cepas. Nombre. Descripción. Silvestre (Wt) E. coli MG1655 Cepa silvestre de E. coli. Mutante 1 E. coli ΔamyA Cepa que carece del gen amya. Mutante 2 E. coli ΔmalS Cepa que carece del gen mals. Mutante 3 E. coli ΔmalZ Cepa que carece del gen malz. Mutante adaptada E. coli Amy6 Mutante adaptativa a crecer en almidón, que sobreexpresa y secreta AmyA. Tabla 1.1 muestra Cepas MG1655 (silvestre) y las mutantes amya, mals y malz de la colección KEIO. 23

24 Metodología. * *Obtención del medio de cultivo. *Resiembra. JULIO 20 AGOSTO 15 SEPTIEMBRE 14 24

25 Metodología. Las cepas se cultivaran a 37 C en medio mínimo M9 utilizando maltosa y almidón como fuente de carbono. El crecimiento se determino midiendo la D.O. a 600 nm FUENTE: ehowenespanol.com 25

26 Metodología. * Preparación de inóculos. Medio de evaluación de crecimiento. 26

27 Metodología. * M9/maltosa y M9/almidón Cultivos 37 C, 150 rpm Toma de las muestras. Mediciones del crecimiento en un espectrofotómetro a 600nm. 27

28 Metodología. El contenido de almidón se determinará por su capacidad de formar un complejo con el yodo. FUENTE: pinterest.com 28

29 Metodología. Tinción con lugol 1:10 Preparación M9/almidón Incubación a 37 C 29

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31 ABSORBANCIA (D.O) ABSORBANCIA (D.O) ABSORBANCIA (D.O) Resultados Wt = cepa silvestre M1 = AmyA 0.1 Wt M1 0.1 Wt M2 M2 = MalS M3 = MalZ TIEMPO (h) TIEMPO (h) Wt M TIEMPO (h) 31

32 Absorbancia (D.O) Resultados. Crecimiento sobre M9/maltosa de las cepas silvestre y mutante adaptiva Tiempo (h) Wt Wt6 32

33 Absorbancia (D.O) Absorbancia (D.O) Absorbancia (D.O) Absorbancia (D.O) Cinéticas de crecimiento sobre M9/maltosa de las cepas silvestre y mutantes Tiempo (h) Tiempo (h) Wt Wt6 Wt AmyA Tiempo (h) Tiempo (h) Wt MalS Wt MalZ Resultados. 33

34 Determinación de la degradación del sustrato y actividad amilolítica por cada una de las cepas con distinto tipo de almidón. Almidón 1 Almidón 2 Resultados. 34

35 ABSORBANCIA (D.O) CINÉTICA DE CRECIMIENTO EN ALMIDÓN MG1655 Wt6 Amy0 Amy6 MG Wt Amy Amy TIEMPO (H) Resultados. 35

36 ABSORBANCIA (D.O) ALMIDÓN 2 MG1655 Wt6 Amy0 Amy MG Wt Amy Amy TIEMPO (H) Resultados. 36

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38 Conclusiones *Todas las cepas evaluadas presentan una fase lag de 12 horas para el crecimiento en maltosa *El tipo de almidón influye sobre el crecimiento y la actividad amilolítica de las cepas evaluadas. *La cepa adaptativa para crecer en almidón no presenta una desregulación del operón de maltosa 38

39 Meses/acciones Feb-Mar Abr-Mayo Jun-Jul Agos-Sept Oct-Nov Dic-Ene Agos-sept Oct-Nov Búsqueda de tema y recopilación de información. Correcciones, retroalimentación y presentación del protocolo. Búsqueda de bibliografía. Conservación de las cepas obtenidas Obtener las cepas MG1655 (silvestre) y las mutantes e Identificar las condiciones de cultivo de estas cepas. Evaluar el crecimiento de las cepas utilizando maltosa y almidón. Evaluar la degradación del sustrato por cada una de las cepas anteriores Interpretar el crecimiento de las diferentes cepas mutantes de E. coli. Captura de resultados y presentación del proyecto. 39

40 * Aux, G. W. (2009). U.S. Patent Application 12/395,180. * Cenci, G., Caldini, G., & Strappini, C. (1998). Effect of different starches on Escherichia coli (S1) β glucuronidase expression. Journal of basic microbiology, 38(2), * Cunningham, S. D., Shann, J. R., Crowley, D. E., & Anderson, T. A. (1997). Phytoremediation of contaminated water and soil. ISO 690 * EcoCyc E. coli Database (2015), * Enzyme: α-amylase (2015), * FitzPatrick, M., Champagne, P., Cunningham, M. F., & Whitney, R. A. (2010). A biorefinery processing perspective: treatment of lignocellulosic materials for the production of value-added products. Bioresource technology, 101(23), * Rosales-Colunga and Martínez-Antonio Microbial Cell Factories 2014, 13:74 * Rosales-Colunga, L. M., Razo-Flores, E., Ordoñez, L. G., Alatriste-Mondragón, F., & De León-Rodríguez, A. (2010). Hydrogen production by Escherichia coli ΔhycA ΔlacI using cheese whey as substrate. international journal of hydrogen energy, 35(2),