INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL T E S I S

Transcripción

1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA Efecto de la Inmunización Intranasal con Toxina de Cólera y Extracto Total de Naegleria fowleri en la Activación de Células Dendríticas y Macrófagos en el Modelo de la Meningitis en Ratones BALB/c. T E S I S PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS DE LA SALUD PRESENTA MA. CONCEPCIÓN PEÑA JUÁREZ TUTORES DR. SAÚL ROJAS HERNÁNDEZ DR. MARCO AURELIO ROCRÍGUEZ MONROY México D.F a 10 de Octubre del 2011.

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4 Contenido INTRODUCCIÓN EL SISTEMA INMUNITARIO COMÚN DE MUCOSAS PASAJES NASALES NAEGLERIA FOWLERI MODELO DE INFECCION EN RATON CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENO CÉLULAS DENDRÍTICAS (DC S) ANTECEDENTES JUSTIFICACIÓN HIPÓTESIS OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS PARTICULARES MATERIAL Y MÉTODO RECURSOS BIOLÓGICOS Ratones Toxina de cólera (CT) Amibas BIOENSAYOS PRELIMINARES CULTIVO AMEBIANO REACTIVACIÓN DE LA VIRULENCIA OBTENCIÓN DEL EXTRACTO TOTAL DE AMIBAS INMUNIZACIONES OBTENCIÓN DEL NALT OBTENCIÓN DE CÉLULAS DEL NALT OBTENCIÓN DE LOS PASAJES NASALES TINCIÓN DE APC S INMUNOHISTOQUÍMICA INCLUSIÓN DE MUESTRAS EN PARAFINA INMUNOHISTOQUÍMICA RESULTADOS OBTENCIÓN DE CÉLULAS DE NALT, PASAJES NASALES (PN) Y GANGLIOS CERVICALES(GC) CITOMETRÍA DE FLUJO INMUNOHISTOQUÍMICA DISCUSIÓN

5 CONCLUSIÓNES APÉNDICE MEDIO DE CULTIVO BACTOCASITONA BUFFER DE FOSFATOS 10X (PBS) BUFFER DE FOSFATOS 1X (PBS) PARAFORMALDEHIDO AL 1% PBA RPMI 1X RPMI 20X PERCOLL AL 100% PERCOLL AL 75% PERCOLL AL 45%

6 ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS FIGURAS FIGURA 1 1 A) NALT, TEJIDO ASOCIADO A LA NASOFARINGE (ESTRUCTURA HOMÓLOGA AL ANILLO DE WALDEYER), IDENTIFICADO EN ROEDORES, REPRESENTA EL TEJIDO OROFARÍNGEO DE LAS VÍAS RESPIRATORIAS ALTAS. B) ANILLO DE WALDELLER EN EL HUMANO (COMPRENDE LAS AMÍGDALAS LINGUALES, AMIFDALAS PALATINAS Y AMIGDALAS NASOFARÍNGEAS O ADENOIDES) FIGURA 1 2 ACTIVIDAD DE LOS SITIOS INDUCTOR Y EFECTOR FIGURA 1 3 PORCENTAJE DE EXPRESIÓN DE LAS MOLÉCULAS COESTIMULADORAS CD80/86 EN CÉLULAS DENDRÍTICAS Y MACRÓFAGOS DEL NALT, GC Y PN DE RATONES CON 2 Y 3 INMUNIZACIÓNES FIGURA 1 4 EXPRESIÓN DE MPO, MIF, TLR2 Y TLR4 EN CÉLULAS ACTIVADAS DE LA MUCOSA RESPIRATORIA TABLAS Tabla 1 Grupos de inmunización 30 Tabla 2 Esquema de inmunización.31 Tabla 3 Anticuerpos acoplados a fluorocromos empleados en el análisis por Citometría- 36 6

7 ABREVIATURAS MALT Tejido linfoide asociado a mucosas NALT Tejido linfoide asociado a nariz PN Pasajes nasales PAMP s Patrones moleculares asociados a patógenos PRR s Receptores de reconocimiento de patrones APC Célula presentadora de antígeno MHC Complejo principal de histocompatibilidad TCR Receptor de linfocito T CT Toxina de cólera N. fowleri Naegleria fowleri i.n Intranasal SLT Tejido linfoide secundario TLR Receptor tipo Toll LPS Lipopolisacárido 7

8 CpG Sitios CpG CNS Sistema nervioso central HEV Vénulas del endotelio alto SFB Suero fetal bovino PCry1Ac Protoxina Cry1Ac PBA Amortiguador de fosfatos con albúmina PMN Polimorfonucleares MIF Factor inhibidor de la migración 8

9 RESÚMEN El tejido linfoide asociado a la naríz (NALT) y los nódulos linfáticos cervicales (CN) constituyen el tejido linfoide organizado, mientras que los pasajes nasales (NP) (pared, paredes laterales, cornetes, y el techo de la naríz) son el tejido linfoide difuso y ambos tipos de tejido proporcionan protección a la mucosa nasal contra las infecciones por patógenos. Se ha observado que la toxina de cólera empleada como adyuvante mejora la respuesta inmune protectora cuando se administra con un antígeno. En este trabajo determinamos si la inmunización con lisados de N. fowleri más CT y un reto posterior es capaz de activar células dendríticas y macrófagos del epitelio nasal de ratones en el modelo de la meningoencefalitis amebiana primaria. Mediante FACS observamos en ratones control e inmunizados la expresión de moléculas coestimudoras CD80 y CD86; estas moléculas incrementan significativamente su expresión en macrófagos y células dendríticas de ratones inmunizados con respecto a los controles en NALT, CN y NP. Indirectamente estos resultados reflejan un incremento en la captura y presentación de antígenos de N. fowleri y CT a los linfocitos T, ya que en otros trabajos hemos encontrado linfocitos TCD4 activados mediante la detección de la activación de moléculas CD69 y CD25. Esto está relacionado directamente con los altos niveles de anticuerpos IgG e IgA en los sitios local o sistémico, lo que se ha reportado para el mismo protocolo de inmunización en otros trabajos. Los macrófagos son APC, sin embargo su participación en la eliminación del antígeno es muy importante, por esta razón nosotros analizamos por inmunohistoquímica algunos factores que indican la activación de estas células tales como MPO, MIF, TLR2 y TLR4. Cuando se incubaron los cortes de tejido de la cavidad nasal con anti-mpo observamos que un gran número de trofozoítos y células inflamatorias fueron positivas para este anticuerpo, principalmente en el lumen del cornete superior. N. fowleri expresa un proteína de tipo MPO. Las células inflamatorias se observaron fuertemente activadas 9

10 rodeando a los trofozoítos. Para MIF observamos algunas células positivas en la lámina propia del cornete medio. Con respecto a TLR2 y TLR4 solo pocas células se localizaron en la lámina propia de los cornetes para TLR2 y en la lámina propia del septum para TLR4. La enzima MPO es expresada cuando los macrófagos y PMN son activados y como se muestra en el control no se observan células inflamatorias ni en la lámina propia o el lumen de la cavidad nasal. MIF es un factor quimiotáctico para macrófagos y la marca positiva para esta citocina puede estar indicando la migración de macrófagos hacia el lumen de los cornetes para llevar a cabo la posible eliminación de los trofozoítos. Con respecto a TLR2 y TLR4 y se sabe que su función en macrófagos es la de reconocer diacilpilopéptidos y el LPS respectivamente y cuando estos receptores se unen a su ligando inducen un estado de inflamación en el macrófago y aunque la marca de estas moléculas es baja probablemente estas células están participando en la eliminación de N. fowleri una vez que han llegado al sitio de inflamación. Por otra parte, el macrófago cuando se ha activado por la inmunización puede participar tanto en la presentación del antígeno así como en la eliminación de este. Es necesario complementar los estudios para explicar los efectos inmunomoduladores de la inmunización con CT y lisados de N. fowleri en la cavidad nasal del ratón. 10

11 ABSTRACT The nose-associated lymphoid tissue (NALT) and cervical lymph nodes (CN) constitute organized lymphoid tissue; whereas the nasal passages (NP) (wall, side walls, turbinate and the roof of the nose) are the lymphoid tissue diffuse and both types of tissue provide protection to the nasal mucosa against infection by pathogens. It has been shown that cholera toxin used as an adjuvant enhances the protective immune response when administered with an antigen. In this work, we determined whether immunization with lysates of N. fowleri plus CT and subsequent challenge of are capable of activating macrophages and dendritic cells of the nasal epithelium of mice in the model of Primary amoebic Meningoencephalitis. By FACS we observed in immunized and control mice the expression of costimulatory molecules CD80 and CD86; these molecules increase significantly the expression in macrophages and DC of immunized mice with respect at the control, in NALT, CN and PN. Indirectly these results reflect a high uptake, processing and presentation of antigens of N. fowleri and CT to T cells; because of in others works we found activate T-CD4 lymphocytes by the detection of the activation molecules like CD-69 and CD-25. This is related directly with the high levels of antibodies IgG and IgA either local or systemic sites, reported for the same immunization protocol in others works. The macrophages participate as APC, however its role on the elimination of the antigen is very important for this reason we analyzed by immunohistochemistry some factors that indicate the activation of these cells such as MPO, MIF, TLR2 and TLR4. First when we incubated the slices of the nasal cavity with anti-mpo, a great number of trophozoites and inflammatory cells were positive for this antibody, principally in the lumen of the superior turbinate. N. fowleri have a protein like-mpo strongly expressed. The inflammatory cells were observed also strongly activated around of the trophozoites. For MIF we observed some positive cells in the lamina propria in the medium turbinate. Regard TLR-2 and TLR- 4, only few numbers of cells were localized in the lamina propria of the turbinates superior for TLR-2 and the lamina propria of the septum for TLR-4. The MPO enzyme is expressed when macrophages and PMN are activated and as is showed in the control was not observed inflammatory cells neither lamina propria nor lumen of the nasal cavity. MIF is a chemotactic factor for the macrophage and the positive stain for this cytokine could be indicating the migration of macrophages toward the lumen of the turbinates for the possible elimination of the trophozoites. With respect TLR-2 and TLR-4 is known that the function on macrophage is to recognize diacyl-lipopeptide and LPS respectively, when these receptors binds to the ligands, induce an inflammation state in the macrophages, although the label of this molecules is very low probably these cells are participating in the elimination of N. fowleri once they have reached the inflammation site. On the other hand, the macrophage when are activated by the immunization could be participating either presentation of antigen and elimination of this. Are necessary complementary studies to explain the immunomodulator effect of the immunization with CT and lysates of N. fowleri in the nasal cavity of the mice. 11

12 INTRODUCCIÓN EL SISTEMA INMUNITARIO COMÚN DE MUCOSAS. Las mucosas son la primera línea de defensa del organismo contra el ataque y la invasión de agentes infecciosos que causan patologías, estos epitelios previenen la adhesión de patógenos a las superficies del cuerpo, secretando enzimas y péptidos antimicrobianos actuando como mecanismos de defensa innatos que se inician a los pocos minutos de producirse la infección, teniendo una actividad que puede durar varios días. Cuando esta primera defensa es traspasada se convierte en la principal ruta de entrada de patógenos causantes de enfermedades en el huésped, (Janeway, 2003), y únicamente cuando esta defensa es evadida o el agente infeccioso supera la defensa innata se requiere una respuesta adaptativa o inducida. El sistema inmunitario de las mucosas comprende el mayor tamaño del tejido inmunitario del organismo y tiene características singulares que lo diferencian del sistema inmunitario sistémico, como mantener interacciones intimas entre epitelios de mucosas y tejidos linfoides, contiene compartimentos separados de tejido linfoide difuso y estructuras más organizadas (placas de Peyer, folículos linfoides aislados y amígdalas, por mencionar algunos) nombrados sitios inductores donde el antígeno es captado, endocitado, procesado y presentado a los linfocitos T (MacDonald, 2003) denominado como tejido linfoide asociado a mucosas (MALT) que cuenta con mecanismos especializados para cumplir dichas tareas. También se localizan sitios efectores, donde se lleva a cabo la respuesta 12

13 inmunitaria y en el que los linfocitos T activados/de memoria predominan aún en ausencia de infección así como las T efectoras/reguladoras activadas de manera inespecífica que también se encuentran presentes, al igual que un ambiente regulador frente a alimentos y otros antígenos inocuos dado por la acción de macrófagos inhibidores y células dendríticas inductoras de tolerancia (Mowat, 2003). El sistema inmunitario de las mucosas de acuerdo a su organización puede dividirse en tres compartimentos; a) linfocitos intraepiteliales (IEL), b) tejido linfoide difuso (lamina propia, LP) y c) agregados linfoides (Placas de Peyer, PP). Se piensa que el rol que desempeña el MALT como un agregado especializado de tejido linfoide es el de inducir la inmunidad en las diferentes superficies mucosas como el tejido linfoide asociado a intestino (GALT) formado por las placas de Peyer, el apéndice, los nódulos linfáticos mesentéricos, pequeños nódulos linfáticos solitarios y linfocitos intraepiteliales; el tracto respiratorio, formado por el tejido linfoide asociado a bronquios (BALT) el tejido linfoide asociado al tracto genitourinario.y el tejido linfoide asociado a nasofaringe (NALT). 13

14 TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A NARIZ (NALT). El tejido linfoide asociado a nariz (NALT) es una estructura constitutiva del sistema inmunitario nasal, es un tejido clave para las estrategias de defensa local, además de ser un sitio inductor para la vacunación (Debertin et., al. 2003).Estructuralmente se le ha considerado análoga al anillo de Waldeyer en el humano (estructura que comprende las amígdalas linguales, palatinas y nasofaríngeas o adenoides) (Koornstra et al., 1991). Este tejido comprende macrófagos (MØ) y células dendríticas (DCs) además de áreas foliculares e interfoliculares organizadas de linfocitos B. Hay vasos linfáticos que se encuentran en la base de las áreas de los linfocitos B y T, además de encontrarse numerosas vénulas del endotelio alto (HEV) en las áreas de los linfocitos T (Kuper et al., 1989, 1992). A B Figura 1 1 A) NALT, tejido asociado a la nasofaringe (estructura homóloga al anillo de Waldeyer), identificado en roedores, representa el tejido orofaríngeo de las vías respiratorias altas. B) Anillo de Waldeller en el humano (comprende las amígdalas linguales, amifdalas palatinas y amigdalas nasofaríngeas o adenoides). 14

15 Existe una gran similitud estructural entre el NALT y las Placas de Peyer, ambos contienen células M y zonas donde se encuentran organizados linfocitos B y T (Heritage et al., 1997). La importancia del NALT radica muy probablemente en su proximidad a la lámina propia nasal, aunque también es probable que esta estructura no sea la única que participe en la estimulación de los precursores mucosos efectores de las vías aéreas, mas sin embargo lo anterior fortalece la idea de que el NALT es un tejido importante en el que se pueden estudiar procesos inmunológicos que se deriven de la administración de antígenos que se inoculen por vía intranasal (Csencsits et al., 1999). El NALT se ha considerado como un compartimento inductor donde se inicia la respuesta inmunitaria y cuya función principal es proporcionar un sistema de defensa en las vías aéreas superiores (Csencsits et al., 1999, Boyaka et al., 2000) además de ser el sitio donde ocurre el cambio de isotipo de IgM a IgA. Las células plasmáticas productoras de esta inmunoglobulina migran hacia la lámina propia donde descansa el tejido organizado conocido como pasajes nasales (PN), que cumplen una función efectora donde se lleva a cabo la producción de IgA secretora (siga), que se encuentra en el moco nasal (Shikina et al., 2004), por tal razón se le confiere gran importancia a este tejido ya que es el encargado de generar inmunidad mucosal contra antígenos inhalados siendo capaz de diseminar células efectoras a distintos sitios mucosales. 15

16 PASAJES NASALES Son pocos los estudios que se han realizado acerca del NALT y a pesar de su importante participación inmunológica dentro del tejido nasal no se tienen conocimientos suficientes de las poblaciones linfocitarias así como de sus funciones y fenotipos, aunque existen pocos estudios que se han dirigido a caracterizar las poblaciones de linfocitos que se encuentran en el tejido difuso del sitio efector que rodea al NALT, denominado pasajes nasales (PN). Los PN abarcan estructuras como el tracto nasal y otras estructuras de la nariz tales como los cornetes nasales, tabique y paredes laterales, además de linfocitos de estructuras linfoides menos organizadas a lo largo del ducto lagrimal, lámina propia y el epitelio nasal. El NALT y los PN son considerados como los sitios inductor y efector respectivamente de la respuesta inmunitaria en la mucosa nasal (Fig. 2), que presentan importantes diferencias fenotípicas y funcionales entre sí (Rodríguez, 2007), lo que hace importante a este tejido ya que es el lugar donde se genera la inmunidad en contra de antígenos inhalados, como sucede en el caso de la amiba de vida libre Naegleria fowleri que ingresa por esta vía causando una enfermedad fatal del sistema nervioso central (SNC). 16

17 Figura 1 2 Interacción entre los sitios inductor y efector Naegleria fowleri La amiba de vida libre (AVL) N. fowleri, puede invadir al ser humano y animales, el trofozoíto es el estadio invasivo. Este protozoario es el agente causal de una enfermedad hasta la fecha mortal del SNC denominada meningoencefalitis amebiana primaria (MEAP), que se caracteriza por ser aguda y fulminante (Jarolim et al., 2000), causando la muerte del huésped en un lapso de 3 a 7 días después de que aparecen los primeros 17

18 síntomas (Schuster y Visvesvara, 2004). La inhalación de agua, conteniendo amibas, pone en contacto a estos microorganismos con el neuroepitelio olfatorio, constituyéndose de esta manera la ruta de diseminación de las amibas a otras partes del encéfalo y del espacio subaracnoideo vascular (Martínez, 1985; Martínez y Visvesvara, 1997). MODELO DE INFECCION EN RATON Para llevar a cabo el estudio del NALT existe un modelo de infección establecido de la meningoencefalitis amebiana primaria, enfermedad del SNC aguda y mortal en el 98% de los casos, la cuál es causada por la amiba de vida libre Naegleria fowleri que logra infectar a través del epitelio olfatorio atravesándolo y llegando a la lámina propia para después invadir el cerebro causando la muerte del huésped por una severa inflamación en un lapso no mayor a los 7 días posteriores a la aparición de los primeros síntomas. Al inocular ratones por vía i.n con trofozoítos de este protozoario se produce una meningitis muy similar a la que se presenta en los humanos (Rojas- Hernández et al., 2004) y al coadministrar extractos totales de Naegleria fowleri más toxina de cólera y posteriormente estos mismos son retados con trofozoítos vivos se ha observado que hay un 100% de protección de los ratones. Por lo que es importante el uso de este modelo de infección ya que nos permite explicar los procesos inmunológicos que se presentan cuando realizamos una inmunización intranasal coadministrando un adyuvante mucosal como la toxina de cólera y así estos conocimientos nos permitan desarrollar estrategías de vacunación en contra de este y otros microorganismos que infectan a través de esta ruta. 18

19 Por otra parte, a partir del conocimiento de estos procesos se ha podido caracterizar la participación de linfocitos T y B en el transcurso de la enfermedad, así como la producción de citocinas y liberación de Ab por parte de las células plasmáticas en respuesta a la invasión de los trozoítos, sin embargo, aún no se conocen los mecanismos que actúan de inicio en el intento por combatir la infección como lo son el reconocimiento, endocitosis, procesamiento y presentación de Ag por parte de las APC s a los linfocitos T. CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENO Cuando un agente patógeno atraviesa las barreras mucosa y por ende comienza a replicarse en el tejido del huésped este es reconocido inmediatamente por células del sistema fagocítico mononuclear, como los macrófagos residentes del tejido y los neutrófilos, que aunque estos segundos son circulantes, son los primeros fagocitos en llegar al sitio de la infección. Si esta respuesta resulta ser ineficiente para combatir la infección y lleva luchando para eliminar el patógeno algunas horas más del tiempo habitual que requiere para su eliminación, entonces se inicia un segundo tipo de respuesta, la respuesta adaptativa. Para este efecto, entonces las células fagocíticas que participan en la eliminación del patógeno durante la respuesta innata ahora cumplen una segunda función endocitando, procesando y presentando el antígeno pasando de ser células fagocíticas a APC s. a través de sus moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC-I/II) a las células efectoras primarias maduras, los linfocitos T vírgenes, que reconocen el antígeno a través 19

20 de sus receptores específicos (TCR) lo que se conoce como la primera señal, con la que se inicia la respuesta inmunitaria adaptativa. Las DCs y los MØ forman parte del sistema inmunitario innato, son células presentadoras de antígeno profesionales que tienen una participación crucial al inicio de las respuestas innata y adaptativa. Estas células responden de forma inmediata al encontrarse con el patógeno, al que reconocen a través de los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP s) mediante sus receptores de reconocimiento para estos patógenos (PRR s), destruyéndolo así y evitando la diseminación de la infección liberando citocinas proinflamatorias (IL-1, 6, 8, 12, TNFα), y quimioatrayentes que reclutan más MØ y DC s al sitio de infección. Los PRR s más estudiados son los de tipo Toll (TLR s), que reconocen Ag específicos de bacterias, protozoarios y virus, que actúan como ligandos que estimulan a las APC s al ser reconocidos por estos receptores como el lipopolisacárido (LPS) y CpG. De esta manera se inicia entonces el proceso de maduración de las APC s, que se caracteriza por la sobrexpresión de moléculas coestimuladoras como B7.1 y B7.2 (CD80/CD86). Estas moléculas coestimuladoras son una serie de glucoproteínas que se encuentran en la superficie de las APC s y cumplen una función decisiva en la activación de la respuesta inmunitaria al hacer sinápsis con sus respectivos ligandos ubicados en la superficie de los linfocitos T (CD28/CTLA-4) (Guerrero et., al., 2005). 20

21 Cada APC realiza su función de acuerdo al tipo de antígeno con el que se encuentre, los linfocitos B internalizan de forma eficiente antígenos específicos por endocitosis mediada por el receptor del antígeno unido a sus inmunoglubulinas de superficie, los MØ se especializan en capturar material particulado (Janeway, 2003) y las DCs se especializan en la iniciación de una respuesta inmunitaria primaria y son las responsables de inducir tolerancia evitando que el sistema inmunitario inicie una respuesta de ataque contra componentes propios del organismo además de que permiten el establecimiento de la memoria inmunológica (Banchereau, et.,al 2000). Después de haber endocitado el Ag, las AP s migran al tejido linfoide secundario (SLT) para presentar el antígeno unido a sus moléculas del MHC y activar a los linfocitos T, los cuáles según el péptido que reconocerán se pueden diferenciar en T H1, T H2 o T reg. CÉLULAS DENDRÍTICAS (DC s). Está demostrado que las DC s mucosales se originan en médula ósea. El movimiento de las subpoblaciones intraepiteliales de las vías aéreas es muy rápido, siendo el orden de 2 a 3 días comparado con los 7-10 de las poblaciones del pulmón y con los 21 días de las poblaciones epidérmicas, lo que puede estar relacionado con los niveles diferentes de estimulación antigénica en los diferentes sitios (Holt et al., 1994), que puede acelerarse debido a la presencia de estímulo inflamatorio agudo, como la presencia de bacterias, virus o proteínas antigénicas (McWilliam et al., 1994; Schon-Hegrad et al., 1991; McWilliam et al., 1996; Möller et al., 1996). 21

22 En los sitios no linfoides, las DC s actúan como centinelas, captando y presentando el antígeno (Ag) que ingresa a ese sitio y llevándolo al SLT, lo que las convierte en potentes iniciadoras de la respuesta inmunológica primaria, característica que está resaltada por la capacidad que tiene la célula de suprimir su capacidad de captar Ag una vez que han sido activadas, lo que las diferencia claramente de los MØ. Las DC s se encuentran en todos los tejidos excepto en el SNC, particularmente se encuentran en mayores proporciones en las mucosas. En los tejidos se encuentran en estado inmaduro con gran capacidad fagocítica y baja expresión de moléculas coestimuladoras CD80/CD86, además de expresar bajos niveles de moléculas del MHC de clase II. Al tener contacto con el Ag, las DC s llevan a cabo un proceso de maduración, en el que se incrementa la expresión de CD80/CD86, así como la expresión de Ag unido a MHC de clase II, durante este proceso las DC s migran hacia el STL (ganglios linfáticos, bazo, MALT), donde se lleva a cabo la presentación del Ag que transportan a los linfocitos T. Actualmente se sabe que las células dendríticas son las responsables de inducir tolerancia o inmunidad; diversas subpoblaciones de DC s están programadas para inducir inmunidad (CD11c+ CD8-) y otras para inducir tolerancia (CD11c+ CD8+), e incluso existen las que tienen la capacidad de inducir ambas respuestas (Shortman y Heath, 2001). 22

23 ANTECEDENTES Existen trabajos donde se reporta la importante función del moco en la eliminación de los trofozoítos durante las 8 primeras horas de infección mediante el proceso de recambio de mucosidad, donde se observaron acontecimientos importantes como el de los trofozoítos haciendo contacto con el epitelio olfatorio y algunos otros atravesándolo e invadiendo la lámina propia, posteriormente se observó como de ahí migran al bulbo olfatorio pasando primero por la placa cribosa, para llegar al bulbo olfatorio y finalmente invadir el encéfalo (Rojas, 2004) Rojas en el 2004 reportó que existe protección del 100% contra N. fowleri cuando se inmunizaron ratones en cuatro ocasiones con extracto amebiano más toxina de cólera (CT) y posteriormente se retaron con amibas vivas. Mientras que los controles no sobrevivieron al reto. Al observar este comportamiento en el modelo de protección se pensó que podía existir una participación de anticuerpos en la protección, y para demostrarlo inmunizaron ratones en cuatro ocasiones con extractos de N. fowleri más CT los cuáles se retaron y de los que se hicieron cortes histológicos empleando la técnica de inmunohistoquímica, con lo que observaron que existía una gran secreción de anticuerpos de tipo IgA e IgG y que rodeaban a los trofozoítos que de igual manera estas inmunoglobulinas se encontraron presentes en el epitelio Con estos resultados se comprobó que los anticuerpos desempeñaban un papel importante en la protección contra la infección por Naegelria fowleri para lo que 23

24 posteriormete se determinaron citocinas séricas en ratones BALB/c knockout para STAT/6, ratones que son incapaces de montar una respuesta tipo TH 2, los cuáles fueron igualmente inmunizados con extractos amebianos pero ahora empleando como adyuvante la proteína Cry1Ac. Estos ratones mostraron un 100% de protección al reto con amibas vivas, mientras que los knockout no sobrevivieron al reto (Carrasco, 2010). Con respecto a las citocinas séricas se observó que los niveles de la IL-4 en ratones sanos estaban elevados, mientras que para los knockout fueron casi inperseptibles, mientras que el IFN-gamma y la IL-12 en los ratones knockout estaban elevadas y en los ratones sanos estaban muy bajos lo que nos dice que estos ratones knockout, montaron una respuesta TH 1 que no fue suficiente para conferir protección frente a la infección, lo que nos habla de que para que exista protección en este modelo de infección es necesario que se monte una respuesta tipo TH 2. Rodríguez 2009, reporta que inmunizando ratones vía i.n con Cry1Ac se observan niveles significativos en las respuestas celulares específicas de IgA e IgG, principalmente en el sitio efector (PN), este incremento solo se observa en las mucosas y no en los niveles en suero, de igual manera está reportado que la inducción de inmunidad con trofozoítos de N. fowleri por la misma ruta de infección, provoca un incremento en áreas con metaplasia en el epitelio olfatorio, seguido de la secreción de IgA que se incrementa en las áreas metaplásicas y que se ha identificado interactuando con los trofozoítos en el lumen nasal (Jarillo et al., 2008). 24

25 JUSTIFICACIÓN. Debido a que la cavidad nasal es la ruta de entrada de una gran cantidad de microorganismos que son causantes de diferentes enfermedades en el ser humano, es importante el desarrollo de estrategias de inmunización que activen diferentes factores del sistema inmunitario de mucosas. En nuestro laboratorio hemos demostrado que cuando se inmunizan ratones por la ruta intranasal con extractos totales de N. fowleri coadministrados con la toxina del cólera se logra un 100% de protección contra la infección con esta amiba. Además, de que aumentan los niveles de los anticuerpos IgG, IgM, IgA e IL-4 y descienden los niveles de IFN-γ e IL-12. Pero se desconoce como son capturados y presentados los antígenos de N. fowleri a los linfocitos T-CD4 y si esta presentación ocurre en el NALT. Por lo tanto en este trabajo se pretende analizar el papel de los MØ y las DC s en el modelo de protección contra N. fowleri. 25

26 HIPÓTESIS La inmunización intranasal de ratones BALB/c con extractos de N. fowleri coadministrados con CT induce la activación de las poblaciones de macrófagos y células dendríticas en el NALT, PN y GC del ratón, así como la expresión de factores y moléculas inflamatorias como MPO, MIF, TLR2 y TLR4. 26

27 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Determinar el efecto en la activación de células dendríticas y macrófagos como producto de la inmunización intranasal con toxina de cólera y extracto total de Naegleria fowleri en el modelo de la meningitis, en ratones BALB/c. OBJETIVOS PARTICULARES Detectar por citometría de flujo las poblaciones de macrófagos y células dendríticas del NALT, GC y PN empleando anticuerpos CD11c y CD11b al igual que la activación empleando anticuerpos CD80 y CD86 Determinar por inmunohistoquímica si la inmunización induce la expresión de MPO, MIF, TLR2 y TLR4 en la mucosa nasal. 27

28 MATERIAL Y MÉTODO RECURSOS BIOLÓGICOS Ratones Para el presente estudio se emplearan ratones (Mus musculus) machos de la cepa BALB/c de entre seis y ocho semanas de edad. Toxina de cólera (CT) Louis MO.). Se empleará toxina de cólera comercial (C8052-2MG Sigma Chemical Co., Sto Amibas Se utilizaran trofozoítos de la especie Naegleria fowleri de la cepa ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, Va). 28

29 BIOENSAYOS PRELIMINARES CULTIVO AMEBIANO Las amibas se cultivarán axénicamente en cajas Corning de 72cm 2 con 30ml de medio de cultivo Bactocasitona al 2% (DIFCO), suplementado con SFB al 10% (GIBCO) mantenidas en incubación a 37 REACTIVACIÓN DE LA VIRULENCIA Se realizará empleando 3 ratones anestesiados con éter, a los que se les inocularán por vía i.n 2X10 5 trofozoítos de N. fowleri a cada ratón, empleando una micropipeta. Se mantendrán en observación hasta el término de la enfermedad y muerte, para posteriormente extraer la masa encefálica para recuperar las amibas las que se cultivaran de nueva cuenta en medio axénico y efectuar otros 2 pases por ratón. OBTENCIÓN DEL EXTRACTO TOTAL DE AMIBAS Las amibas se cosechan en la fase logarítmica de crecimiento, se lavan por centrifugación en solución amortiguadora de fosfatos (PBS IX) a 3000rpm, a 10 C por 10m.A la pastilla celular obtenida se le agrega 1ml de Peroxihidroximercuribenzoico (PHMB) 5mM como inhibidor de proteasas. Posteriormente las amibas se lisaran sometiéndolas a un ciclo de sonicación de 10s a 100W de amplitud. La concentración de 29

30 proteínas obtenidas como resultado de la sonicación se evaluará por la técnica de Bradford, y posteriormente se obtendrá un patrón de proteínas mediante electroforésis SDS-PAGE. INMUNIZACIONES Los ratones se separaran en grupos según el tratamiento por administrar, y los grupos se formaran de la siguiente manera: Tabla 4 Grupos de inmunización 1 2 SANOS INMUNIZADOS CON EXTRACTO TOTAL DE N. fowleri (100µg)+CT(1µg) Los pertenecientes al grupo 2 recibirán 3 inmunizaciones con las mismas dosis iniciales y un día posterior a la última inmunización se retan con trofozoítos de N. fowleri vivos y se sacrifican 24 horas después. 30

31 Tabla 5 Esquema de inmunización Numero de inmunización OBTENCIÓN DEL NALT. El tejido del NALT se obtendrá removiendo el paladar blando, tal como se describe en Rodriguez et al., Los ratones anestesiados con éter se desangrarán y serán decapitados, se removerá la mandíbula inferior y la lengua. Se separará con mucho cuidado el paladar. Se lavará la muestra con medio RPMI OBTENCIÓN DE CÉLULAS DEL NALT El paladar del ratón, conteniendo el NALT, se colocará en una caja de Petri con 10 ml de medio RPMI-1640 se realizará un raspado suave con una espátula para separar el NALT del paladar. El NALT se disgregará con el embolo de una jeringa y se recuperará la suspensión celular, la cual se filtrará en tela de organza de cm con una abertura de 0.1mm y se colocará en tubos cónicos de 15 ml. La suspensión celular se centrifugará por 10 min a 1500 rpm a 4 C al cabo de los cuáles se desechará el sobrenadante y se 31

32 resuspenderá la pastilla en 1 ml de medio RPMI Finalmente se ajustarán a 10 6 células por mililitro mediante el conteo de linfocitos en una cámara de Neubauer. OBTENCIÓN DE LOS PASAJES NASALES Los linfocitos de los NP se obtendrán de la porción de la cavidad nasal que queda después de la disección del NALT y que comprende las fosas nasales, septum y paredes laterales. Una vez retirado el NALT, se disgregarán estos componentes haciendo cortes con tijeras en una caja de Petri con 3 ml de medio RPMI-1640 con 1320 unidades/mg de colagenasa. Después de disgregar el tejido, se transferirán a tubos cónicos de 15 ml y se incubarán durante 30 min a 37 C. Después de la incubación las células se lavarán y resuspenderán en 10 ml de medio de cultivo. Las células se pondrán en un gradiente de densidad de Percoll, preparado con soluciones de 4ml de Percoll de 40% y de 75%. Después se centrifugará a 2000 rpm durante 25 min (a temperatura ambiente) las APC s nasales se recuperarán de la interface (zona) entre las soluciones de Percoll al 40% y 75%.Una vez obtenido el paquete celular, se realizarán las mismas tinciones empleadas para las APC s de NALT. TINCIÓN DE APC S 32

33 Las células recuperadas tanto de NALT como de PN deberán someterse a un procedimiento de tinción con fluorocromos conjugados anti-ratón para posteriormente ser analizadas por citometría, en donde emplearemos CD11b, CD11c, CD103, CD86, y CD80. Los anticuerpos de diluirán previamente 1:100 con buffer de fosfatos con albúmina sérica bovina ph 7.4 (PBA) (10 mg/ml) y se colocarán 10 l por cada millón de células, incubarán en obscuridad a 4 C por 30 min, al término de ese tiempo se lavarán con PBA y se desechará con cuidado el sobrenadante, al paquete celular se le agregará 400 l de paraformaldehído al 1% y se guardará en oscuridad a 4º C hasta su análisis por Citometría de flujo en las siguientes 24 horas usando citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences). Los datos se analizaron usando el WinMDI 2.9. INMUNOHISTOQUÍMICA Inclusión de muestras en parafina Se obtendrán los pasajes nasales de los ratones, sin NALT y sin piel y se colocan por separado en tubos Corning de 50 ml con Paraformaldehído al 4% durante 24 horas. Posteriormente se lavaran con agua corriente y se les agregará EDTA al 8%, durante 8 días, cambiando este cada 24 horas. Transcurrido este tiempo se lavaran nuevamente con agua corriente para eliminar el exceso y se colocarán en OH 70%, mínimo un día, después se colocarán en OH 80% durante 2hrs., posteriormente en OH 96% por dos horas y por último en butanol durante 24 horas o una noches para después incluir en parafina 33

34 (paraplast) en donde no deben permanecer por más de 8 horas y como mínimo deben permanecer 4 horas. Inmunohistoquímica Con los tejidos incluídos en parafina como se describió anteriormente se realizarán cortes histológicos de entre 5 y 7 m, los cuales ya montados en portaobjetos previamente tratados con solución Poly L Lisyne se desparafinan mediante incubación a 50 0 C durante 30 mins., para posteriormente almacenarse a temperatura ambiente. Se seleccionan las laminillas con los cortes y se deparafinan colocándose en xilol durante 20 minutos y posteriormente 5 minutos en cada alcohol para hidratación en el siguiente orden: Xilol, OH 100%, OH 96%, OH 80%, OH 70%; PBS 1X. Después se lavaran con Tween 20 al 0.05% en PBS y agua destilada, se agrega una solución 1% H 2 O 2 en PBS para bloquear la peroxidasa endógena y se incuban en obscuridad durante 40 minutos. Transcurrido el tiempo se retirará el peróxido de hidrógeno, se lavan con PBS- Tween al 0.05% después se bloquearán con leche al 6% y se incubará en refrigeración durante 40 minutos. 34

35 Durante este tiempo de espera se preparará el primer anticuerpo que se aplicará sobre los cortes en una proporción de 1:1000 (Goat polyclonal IgG antimif, antitlr2 y antitlr4). Las laminillas se colocarán en una cámara húmeda en refrigeración y se incubarán durante 24 horas, ya con el anticuerpo. Después de este tiempo las laminillas se lavarán con PBS-Tween al 0.05% en un coopling, para después agregar el anticuerpo peroxidado, se incubará durante 3 horas en refrigeración y se revelará con DAB 1:5, se incubará durante 10 mins. aproximadamente y se lavan con PBS-Tween al 0.05% y agua corriente para después contrateñir con hematoxilina de Harris al 20%, e incubar durante 5 mins y por último se lavará con agua corriente. 35

36 RESULTADOS OBTENCIÓN DE CÉLULAS DE NALT, PASAJES NASALES (PN) Y GANGLIOS CERVICALES(GC). La suspensión celular obtenida del NALT, la recuperada de los ganglios cervicales, así como los linfocitos de los pasajes nasales, los cuáles se recuperaron de la porción de la cavidad nasal que quedó después del aislamiento del NALT, fueron obtenidos de acuerdo a los procedimientos previamente descritos y los linfocitos obtenidos de NALT, NP Y GC se marcaron con los anticuerpos acoplados a fluorocromos mencionados en la figura 4 para localizar los diferentes tipos celulares y moléculas coestimuladoas, se analizaron por citometría de flujo (FACSCalibur BD Biosciences) y posteriormente los datos se analizaron usando el programa WinMDI 2.9. Tabla 6 Anticuerpos acoplados a fluorocromos empleados en el análisis por citometría Anticuerpo- Célula fluorocromo CD11b-FITC CD11c-APC CD80-PE CD86-Cy5PE Macrófagos Dendríticas M. Coestimuladoras M. Coestimuladoras. 36

37 CITOMETRÍA DE FLUJO Para determinar el efecto de la inmunización sobre las poblaciones de macrófagos y células dendríticas de los diferentes compartimentos inmunes (NALT, GC y PN) se analizaron los marcadores de activación CD80 y CD86. Se observa claramente un aumento significativo de su expresión con dos y tres inmunizaciones con respecto al grupo control tanto en el NALT como en los GC y los PN (Fig. 3). A continuación detallamos los resultados. La expresión de CD86 en los ratones con dos inmunizaciones fue igual para los dos tipos celulares en los tejidos del NALT y los GC, mientras que en los PN la expresión de esta molécula fue significativamente mayor (Fig. 3C), con respecto a la expresión en NALT y GC y con respecto a los controles, en donde se observa que se expresa por casi tres veces más. Con respecto a los macrófagos en la tercera inmunización la expresión de CD86 es muy similar en los tres tipos de tejido, aunque se puede observar que decae ligeramente en el GC (FIg. 3B1). Por el contrario, mientras que el porcentaje de expresión de CD86 se observa considerablemente incrementado con respecto a la 2ª y 3ª inmunización podemos ver que la expresión de CD80 se incrementa con respecto del control durante la 2ª inmunización, más sin embargo, entre la 2ª y 3ª inmunización el incremento solo resultó ser significativo para la expresión en GC y PN (Fig.3E1), mientras que para el NALT no se observan diferencias. Referente a las células dendríticas, el incremento en la expresión de ambas moléculas se observa significativamente mayor en términos generales, con respecto a los controles. Podemos observar que la expresión de CD86 durante la 2ª inmunización está muy por arriba con respecto a lo que se observa en sus respectivos controles en los tres tejidos, 37

38 más sin embargo esta expresión se encuentra ligeramente por debajo de la que se muestra en la segunda inmunización en los macrófagos de los PN (Fig 3C1), mientras que esta expresión en el NALT y los GC se observa muy similar a lo que vemos en los macrófagos. Durante la tercera inmunización la expresión de CD86 en las células dendríticas parece alcanzar el mismo porcentaje que los macrófagos en el NALT (Fig. 3 A2) y se observa ligeramente por debajo de los mismos en los PN (Fig. 3C2), más sin embargo esta expresión sufre una caída relevante en los GC, que se encuentra hasta ligeramente por debajo de lo expresado durante la segunda inmunización (Fig. 3B2). Por otra parte, CD80 se incrementa significativamente con respecto de los controles y de la 2ª inmunización y este fenómeno observamos que se manifiesta en los tres tejidos estudiados, en el NALT y los PN está ligeramente por debajo de la expresión en macrófagos, mientras que en el GC este decaimiento es significativo. En general, con estos resultados observamos que hay un incremento significativo en las expresión de CD80 y CD86, en la segunda y tercera inmunización con respecto a los grupos controles y la tercera inmunización resulta ser la que induce una mejor expresión para ambas moléculas en los dos tipos celulares y en los tres diferentes tipos de tejido analizados. 38

39 CD86 CONTROL 2 INMUNIZACIÓN 3 INMUNIZACIÓN CD80 A) I II D) I II NALT Porcentaje de expresión B) C) I I II II E) F) I I II II GC PN Macrófagos Dendríticas Macrófagos Dendríticas Figura 1 3 Porcentaje de expresión de las moléculas coestimuladoras CD80/86 en células dendríticas y macrófagos del NALT, GC y PN de ratones con 2 y 3 inmunizaciónes(*incremento significativo con respecto de los controles, **Incremento significativo con respecto de los controles y de la 2ª inmunización, * Incremento significativo del mismo tipo celular en los tres diferentes tejidos) INMUNOHISTOQUÍMICA 39

40 En la cavidad nasal de los animales tanto de experimentación como controles se han descrito en trabajos previos, cinco tipos de epitelio: estratificado escamoso, de transición, metaplásico y epitelio respiratorio y olfatorio. En los ratones no inmunizados los tipos de epitelio que se observan son: epitelio plano estratificado que delimita el vestíbulo, mientras que en el área respiratoria observamos un epitelio cilíndrico ciliado pseudoestratificado (respiratorio) y en la región posterior de la nariz un epitelio cilíndrico (olfatorio). Los epitelios respiratorio y olfatorio así como los elementos de la lámina propia, incluyendo las glándulas de Bowman, presentan características normales (Fig. 4). No se observan transformaciones de epitelio normal olfatorio a un epitelio de tipo respiratorio (epitelio metaplásico), la lámina propia presenta eventualmente células inflamatorias positivas para MIF y se puede observar una fuerte reacción inflamatoria en el lumen de los cornetes medios. En los tres grupos de ratones inmunizados y retados se pueden observar células inflamatorias que se localizan en el epitelio respiratorio (Fig. 4F), así como se observan algunas otras cercanas a las gándulas seromucosas de la lámina propia (Fig. 4F, G, J y K) que resultaron ser positivas para MIF. En los cortes de los ratones inmunizados, retados y marcados con anti-mpo se pueden observar células activadas que son positivas para MPO y que se encuentran rodeando los trofozoítos en el lumen del cornete superior (Fig. 4E), a partir de la segunda inmunización. Para MIF observamos a partir de la tercera inmunización algunas células positivas en la lámina propia del cornete medio (Fig. 4F-J) que muy probablemente pudiera tratarse de macrófagos que se dirigen al epitelio y así ponerse en contacto con el antígeno y reclutar otros macrófagos. Son pocas las células que expresan TLR2 y TLR4 y se encontraron en la lámina propia de los cornetes y del septum respectivamente a partir de la segunda inmunización.. Los datos indican que los ratones inmunizados con lisados más CT muestran la máxima protección contra la infección por N. fowleri porque los trofozoítos son eliminados 40

41 en la cavidad nasal en lugar de penetrar el epitelio, por lo que no observamos rastros de parásitos en el lumen de la cavidad nasal, salvo lo que ocurre en la marca para MPO, en donde claramente se observa como se está conteniendo la invasión de los trofozoítos por parte de células fagocíticas. Figura 1 4 Expresión de MPO, MIF, TLR2 y TLR4 en células activadas de la mucosa respiratoria, a partir de la 2 y tercera inmunización. DISCUSIÓN En el presente estudio determinamos si la inmunización con lisados de N. fowleri más CT y un reto posterior es capaz de activar células dendríticas y macrófagos de la mucosa olfatoria de ratones, en el modelo de la meningitis causada por Naegleria fowleri. 41

42 La importancia de nuestro trabajo radica en el entendimiento de los aspectos celulares que ocurren en los sitios inductor y efector de la mucosa nasal en respuesta a desordenes inflamatorios ocasionados por la invasión de patógenos, así como la activación celular y expresión de moléculas y factores propios de la inflamación Mediante FACS observamos que en ratones control e inmunizados la expresión de moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 se encuentran en bajas cantidades. El porcentaje de expresión de CD86 en los macrófagos se observa que es ligeramente mayor que CD80 en los tres diferentes tejidos analizados, se ha reportado que la actividad coestimulatoria de este complejo CD80/86 pudiera tener diferencias funcionales y actuar cada molécula de manera independiente, en respuesta al tipo de antígeno presentado y al adyuvante empleado (FloA et al., 2000), a pesar de que CD80 y CD86 forman un complejo que por mucho tiempo se ha considerado que actúa en tándem, lo que nos habla de que posiblemente CD86 al expresarse en cantidades mayores funcione como un regulador positivo durante la presentación en la activación del linfocito T a través de su unión a CD28 en la segunda y tercera inmunización, propiciando que la coestimulación sea más fuerte. Por el contrario otros estudios indican que CD80 puede regular negativamente la activación de los linfocitos T y que por lo tanto, con los resultados obtenidos en donde observamos que el porcentaje en la expresión de esta molécula es menor pudiéramos pensar que aún no se requiere que se suprima por completo la actividad de ninguna de las dos moléculas por lo que se justifica su menor porcentaje de expresión (Vasu C et al., 203) y que por el contrario, en este momento (segunda y tercera inmunizaciones) se lleva a cabo la máxima activación del macrófago. El porcentaje de expresión de CD80 nos sugiere que seguramente esta molécula se expresa de acuerdo a un mecanismo que tiene como principal función la de regular la expresión de citocinas que participan en la inflamación (Nolan A., et al., 2009) y como resultado de la inmunización observamos que la inflamación se encuentra controlada debido a la menor expresión de CD80. Como ya es bien sabido los macrófagos conforman una de las poblaciones más pleiotrópicas del sistema inmune, son efectores de la respuesta innata y están involucrados en el inicio y la regulación de las respuestas adaptativas (Duque-Correa y Rojas-López, 42

43 2007). Si a este proceso sumamos los efectos moduladores de la CT entonces observamos que la expresión de sus moléculas coestimuladoras se incrementa, gracias a que esta toxina tiene potentes efectos adyuvantes sistémicos y mucosales que ya son bien conocidos y probados en diferentes modelos de inmunización intranasal, intragástrica, rectal y oral en diferentes organismos, además de que se ha utilizado coadministrada, conjugada o como proteína de fusión con diferentes agentes patógenos (Lavelle EdC., et al., 2004), es un potente adyuvante que mejora la respuesta de tipo TH2 cuando es administrada sola y es capaz de mezclar un tipo de respuesta TH1/TH2 cuando es coadministrada con un antígeno (Lavelle EdC, et al., 2003), también se ha demostrado que CT puede promover la generación de T reg contra antígenos circulantes. Empleada en bajas dosis induce una respuesta sistémica de anticuerpos y cuando es coadministrada con antígeno de N. fowleri incrementa la secreción de IL-10 e IL-5, mejorando también la respuesta de IgA mucosal y de IgG sérica contra este antígeno (Jarillo-Luna et al., 2008). Respecto a las células dendríticas sabemos que en las inmaduras, la expresión de ambas moléculas puede ser inducida por una gran cantidad de factores tales como LPS, entrecruzamiento del receptor de B y la señalización de CD40, por el contrario, las DC s maduras expresan cantidades elevadas de estas moléculas. Debido a que ambas moléculas se unen a CD28 que se expresa constitutivamente en los linfocitos T, y se regula negativamente inmediatamente después de la activación, suponemos que la disminución en su expresión en las células dendríticas de los GC pudiera presentarse como un proceso de regulación de la coestimulación durante la tercera inmunización, o bien, que como producto de la inmunización, este tipo celular estuviera llevando a cabo la presentación de antígeno en otro sitio inductor, como podría serlo el NALT. Por otro lado, la señalización a través de CD28 pudiera estar disminuyendo la fuerza o la duración de la señalización con el TCR y así estar regulando la presentación de antígeno en este sitio. Existen reportes de que CD86 se expresa en menor medida al igual que otras moléculas coestimuladoras tales como OX40 y receptores de quimiocina tales como CCR5, CD40 y moléculas de adhesión intercelular como ICAM-1 (Lavelle EdC., et 43