Electrophoretic analysis of differential expresión pattern of esterases isoforms in different Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) tick strains.

Transcripción

1 ANALISIS ELECTROFORÉTICO DE LA EXPRESION DIFERENCIAL DE ISOFORMAS CON ACTIVIDAD DE ESTERASAS EN AISLAMIENTOS DE Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) RESISTENTES A PESTICIDAS. Electrophoretic analysis of differential expresión pattern of esterases isoforms in different Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) tick strains. Domínguez-García, D.I. 1, Rosario-Cruz, R. 2, Almazán García C. 3, García Vázquez, Z D.I. 2, Saltijeral Oaxaca, J.A. 1 y Rodriguez-Vivas R.I Facultad de Ciencias Biológicas, UAM, México, DF. 2 CENID-PAVET INIFAP, Cuernavaca, Morelos. 3 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UAT, Cd. Victoria, Tamaulipas. 4 Dpto. de Parasitología FMVZ.-UADY. Correo electronico: deliadomgar@yahoo.com.mx Palabras clave: Garrapatas, Boophilus microplus, Resistencia, esterasas. Introducción Boophilus microplus (canestrini), representa un grave problema en regiones tropicales y subtropicales de México (Estrada-Peña et al., 2006), es un ectoparásito económicamente significativo porque desempeñan un importante papel como vector en la transmisión los patógenos Babesia Bovis, Babesia bigemina y Anaplasma marginale que causan babesiosis y anaplasmosis (Peter et al., 2005) enfermedades que pueden dan lugar a pérdidas en la producción de leche y carne además de la restricción en el comercio del ganado (Graff et al., 2004). La mejor táctica para controlar a B. microplus es el uso de garrapaticidas, sin embargo, su uso ha tenido eficacia limitada y su empleo continuo ha originado la selección de individuos resistentes en las poblaciones de garrapatas (Graf et al., 2004), que han desarrollado resistencia a las diferentes clases de acaricidas incluyendo compuestos organoclorados, (DDT), piretroides, organofosforados y amidinas (George et al., 2004). Esta capacidad de adaptación es el resultado, de la selección natural de enzimas metabólicas multigénicas como el citocromo P450, glutatio-s-transferasas y carboxilesterasas (Ranson et al., 2001; Li et al., 2003) altamente especializadas en los procesos de detoxificación de compuestos bióticos y xenobióticos (Devonshire y Field 1991). En B. microplus Miller et al., (1999) reportaron la presencia de dos patrones de resistencia a piretroides, uno relacionado a insensibilidad en el sitio blanco y otro a un mecanismo de detoxificación por enzimas metabólicas, posiblemente involucrando secuestro o un aumento en la tasa de hidrólisis del insecticida (Jamroz et al., 2000). En el caso de cepas resistentes a organofosforados mediante análisis bioquímicos se demostró que también las principales enzimas involucradas son las estresas (Zhou et al., 2002). La resistencia a la mayoría de los organofosforados involucra secuestro o hidrólisis del ixodicida en los tejidos del artrópodo, lo que explica la sobreproducción de enzimas con actividad de esterasas en cepas resistentes (Dary, et al., 1990; Devonshire et al., 1991). Esta sobreproducción de esterasas se explica como el resultado de dos mecanismos; el primero implica la amplificación del gen de la esterasa y el segundo su regulación (Rooker et al., 1996). En cepas de garrapatas resistentes a piretroides y a organofosforados, se ha 739

2 detectado un incremento de la actividad de esterasas (Rosario-Cruz, et al., 2000; Rosario et al., 2005). Diferentes estudios han descrito el polimorfismo de secuencias de aminoácidos del canal de sodio asociado a resistencia knockdown (kdr) en Anopheles gambiae, Bemisia tabaci, Blattella germanica, Boophilus microplus, (Soderlund y Knipple, 2003; Diabate et al., 2003; Park et al., 2000; Lee et al., 2000). Estas mutaciones han sido postuladas como las que confieren la resistencia a los piretroides en insectos (Jamroz et al., 1998). Es posible que este mismo fenómeno, pueda presentarse en los genes que codifican para las esterasas, dada la presencia de varias isoformas en Boophilus microplus resistentes a organofosforados. Materiales y Método Material biológico. Las cepas de garrapatas Boophilus microplus utilizadas fueron obtenidas de colonias mantenidas en el Centro de Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria SENASICA-SAGARPA en Jiutepec, Morelos, México. Las cepas utilizadas para este estudio fueron: Susceptible obtenida en el municipio de Coahuayutla en el estado de Guerrero (1997); Tempoal resistente a OC y OF de Tempoal, Veracruz (1986); Tuxpan resistente a OF de Tuxpan, Veracruz (1982), Mora resistente a OF y PS de Emiliano Zapata, Tabasco (1993) y Aldama resistente a OF y PS de Aldama, Tamaulipas (1994). Prueba de paquete de larvas. Para los ensayos toxicológicos se utilizaron larvas de 10 días de edad, y a cada una de las cepas se les realizó la prueba de paquete de larvas (PPL) (Stone y HaydocK, 1962) la cual se utilizó para determinar la resistencia a coumafos, clorfenvinfos y diazinon. Se realizaron diluciones del pesticida en tricloroetileno y aceite de olivo (2:1. vol:vol). Esta formulación se aplicó sobre papeles filtro de 7.5 por 8.5 cm que posteriormente se dejaron secar por 2 horas. Aproximadamente 100 larvas de Boophilus microplus se colocaron dentro de los paquetes impregnados con coumafos, clorfenvinfos y diazinon, Posteriormente los paquetes se colocaron en la incubadora a una temperatura de 27 C, 85 86% de humedad relativa y un fotoperíodo 12:12 L:O por 24 horas. Cuantificación de proteínas. Para la obtención de los extractos protéicos de larvas, en morteros de porcelana, previamente esterilizados y congelados a -70 o C se maceraron 500 mg de larvas de 10 días de edad, de cada una de las cepas. El macerado de las larvas fue resuspendido en 600 l de solución salina de fosfatos (SSF) ph 7.2. La muestra se conservó en alícuotas de 200 l del extracto larvario en viales de poliestireno y se mantuvieron a -20 o C hasta su análisis. La concentración de proteína total se estimó por la lectura de una dilución 1:10 de cada uno de los extractos crudos de larvas de cada una de las cepas de garrapatas, empleando el método Bradford (1976) del kit comercial Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hércules, Ca.), el cual está basado en medir la absorbancia de los extractos en solución en un espectrofotómetro (Cintra 5 uv-vis) a una longitud de onda de 595 nm. Análisis enzimático. Mediante un ensayo espectrofotométrico se cuantificó la actividad de esterasas (AE) presentes en los extractos de larvas de cada cepa, con base en la densidad óptica de cada reacción de las cepas analizadas en un espectrofotómetro Milton Roy 601 (Milton Roy, Analytical product division), mezclando 50 g de proteína del extracto larval en cada tubo de reacción (1 ml), se utilizó como sustrato alfa-naftil acetato al 740

3 0.01% y Fast Garnet 0.1 mg en 100 ml de SSF conteniendo tritón al 1%. La reacción se inició con la adición de los extractos y la absorbancia se midió inmediatamente con un filtro de 538 nanómetros con lecturas a intervalos de un minuto a partir del minuto 1 y durante 5 minutos, también se midió un blanco con la mezcla en ausencia del extracto de larvas con el fin de evaluar la hidrólisis espontánea del reactivo utilizado como sustrato. La actividad específica expresada en U ( moles del sustrato hidrolizado por minuto por mg. de proteína) se calculó de acuerdo a la siguiente formula (Dary et al. 1990): AE = (absorbacia corregida X volumen del ensayo)/(t) ( mm )(D) * mm = litro mmol -1 cm -1 a 538 nm (coeficiente de extinción molar para -naftil acetato). T= Tiempo del ensayo en minutos. D= diámetro de la celda en cm Análisis electroforético. Los extractos proteicos fueron analizados en un gel de poliacrilamidas conteniendo anfolinas en un rango de ph y se corrió utilizando acido acético 0.02 normal como anolíto e hidróxido de sodio al 0.02 normal como catolíto. Se colocaron 50 µg de proteína en cada carril de cada una de las cepas de garrapatas. Los geles fueron teñidos para detectar la actividad de esterasas utilizando alfa-naftil acetato como sustrato y Fast Garnet como revelador. Análisis estadístico. Los resultados del bioensayo, (porcentajes de supervivencia larval) fueron correlacionados con los resultados de la actividad de esterasas (U/L). Las correlaciones fueron determinadas usando el programa estadístico SPSS para obtener el coeficiente de correlación de Pearson (SPSS lnc. 1999). Resultados La actividad de esterasas expresada en UI y calculadas a partir de la hidrólisis del alfa-naftil acetato, fueron para la cepa Susceptible UI, Tempoal UI, Aldama UI, Tuxpan UI y Mora UI. Los coeficientes de correlación de Pearson entre los índices de resistencia (IR) y la actividad especifica de esterasas a cada uno de los organofosforados fueron, para clorfenvinfos r= 0.80 seguida por el coumafos con r= 0.70 y para el diazinon r= 0.47, de los cuales solo se encontraron diferencias significativas para el caso de clorfenvinfos (P<0.05) (ver Cuadro 1). Dos observaciones importantes se desprenden del comportamiento electroforético de las isoformas de esta familia de enzimas, una de ellas es la sobreexpresión de las líneas resistentes de garrapatas con respecto de la cepa susceptible, la cual no mostró una actividad incrementada de esterasas, y por otro lado, cada una de las isoformas con actividad incrementada, muestra una marcada diferencia en la actividad relativa en cada una de las líneas de garrapatas cuando se analizan con anfolinas con un ph de 3-5, la banda se separada en una serie de ocho mas en forma de escalera con un ph dentro del rango 4.5 a 5 (ver figura 1). Discusión y Conclusiones En la actividad de esterasas existen diferencias en una banda de aproximadamente 67 KDa cuando estas se separan y se renaturalizan en geles de poliacrilamida (Rosario et al., 1997), se ha encontrado sobreproducida en cepas de garrapatas B. microplus resistentes analizadas en electroforesis de doble dimensión, encontrándose que la banda tiene un punto 741

4 isoeléctrico aproximado de 4.5, cuando se analiza utilizando anfolinas de ph (Rosario et al., 2000). El análisis comparativo en este estudio, demostró que las diferentes cepas de garrapatas resistentes poseen un polimorfismo en la expresión de la actividad de esterasas encontrándose diferencias de varias de las isoformas con actividad de esterasas, así como un marcado incremento comparada con la cepa susceptible, lo cual sugiere que el mecanismo de resistencia a la familia de los organofosforados, mediado por esterasas, posee dos componentes moleculares importantes, el primero es la actividad total incrementada de las esterasas, y segundo, la expresión diferencial de cada una de las isoformas de esta familia de enzimas, que pudiera deberse a alteraciones en la secuencia de los genes que afecten la avidez de la enzima por el sustrato ó probablemente a la duplicación de genes, para lo cual se necesitan estudios mas profundos con el fin de determinar los mecanismos moleculares que expliquen estas diferencias en la actividad de cada una de las isoformas. Cuadro 1. Actividad específica, índices de resistencia y coeficientes de correlación para los diferentes compuestos organofosforados en cada una de las líneas de Boophilus microplus analizadas. Cepa Coumafos r=0.70 Clorfenvinfos r=0.80 Diazinon r=0.47 UI IR UI IR UI IR. Tempoal Aldama Tuxpan Mora Susceptible UI=Unidades internacionales, IR=Índice de resistencia, r=coeficiente de correlación de Pearson. pi marcador TL TX MO AL SS Figura 1. Isoelectroenfoque de las diferentes isoformas de enzimas con actividad de esterasa utilizando anfolinas en un rango de 3 5 unidades de ph en geles de poliacrilamida. 742

5 Agradecimientos Este estudio fue parcialmente financiado por los proyectos y de CONACYT-SAGARPA Y SEP-CONACYT respectivamente bajo la responsabilidad de la Dra. Consuelo Almazán. Agradecemos también al Consejo Nacional de Ciencia y tecnología, el soporte financiero de la estudiante Delia Inés Domínguez García inscrita en el programa doctoral de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma Metropolitana. Literatura Citada Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Analyt. Biochem. 72, Dary, O., Georghiou, G.P., Parson, E. and Pasteur, N. (1990). Microplate adaptation of Gomori s assay for quantitative determination of general esterase activity in single insects. J. Econ. Entomol. 83, Devonshire A.L. and Field L.M. (1991). Gene amplification and insecticide resistance. Annu Rev Entomol. 36: Diabate A, T. Baldet, Ch. Chandre, D.K. Roch, K. Pierre, G.T. Robert, S. Federic, G. Pierre, H. Janet and H.J. Marc (2003). KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J. Med. Entomol. 40: Estrada-Peña A, García Z and Sanchez H.F. (2006). The distribution and ecological preferences of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) in Mexico. Exp Appl Acarol. 38(4): George J.E, Pound JM and Davey RB. (2004). Chemical control of ticks on cattle and the resistance of these parasites to acaricides.parasitology.129 Suppl:S Graf J.F, Gogolewski R, Leach-Bing N, Sabatini G.A, Molento M.B, Bordin E.L.and Arantes G.J Tick control: an industry point of view. Parasitol. 129:S427-S442. Jamroz RC, Guerrero FD, Kammlah DM, Kunz SE. (1998). Role of the kdr and super-kdr sodium channel mutations in pyrethroid resistance: correlation of allelic frequency to resistance level in wild and laboratory populations of horn flies (Haematobia irritans). Insect Biochem Mol Biol. Dec. 28 (12): Jamroz RC, Guerrero FD, Pruett JH, Oehler DD y Miller RJ. (2000). Molecular and biochemical survey of acaricide resistance mechanisms in larvae from Mexican strains of the southern cattle tick Boophilus microplus. J. insect Physiol., 46: Lee, S.H, K.S. Yoon, M.S. Williamson, S. J. Goodson, M.T.Lee, J. D. Edman, A. L. Devonshire and J.M. Clark. (2000). Molecular analisis of kdr-like resistance in permethrin-resistan strains of head lice, Pediculus capitis. Pestic. Biochem. Physiol. 66: Li A.Y, Davey R.B, Miller R.J, George J.E. (2003). Resistance to coumaphos and diazinon in Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and evidence for the involvement of an oxidative detoxification mechanism.. J Med Entomol. 40(4): Miller RJ, Davey RB y George JE. (1999). Characterization of pyrethroid resistance and susceptibility to coumaphos in Mexican Boophilus microplus (Acari:Ixodidae). J. Med. Entomol. 36: Miller, R.J; Li, A.Y; Davey, RB. and George J.E. (2006). The use for the determination of the mechanisms of acaricida resistance in the southern cattle tick, Boophilus 743

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