PRACTICO Nº 2 ENZIMOLOGÍA I

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1 PRACTICO Nº 2 ENZIMOLOGÍA I I. - INTRODUCCIÓN La mayoría de las reacciones químicas que ocurren en los sistemas vivos, si siguieran sus propios mecanismos, ocurrirían demasiado lentas. Se requiere de catalizadores para que estas reacciones transcurran a velocidades que realmente sean útiles para la célula. En los sistemas biológicos, los catalizadores de dichas reacciones químicas son las enzimas. Qué es catálisis? Qué es lo que hace la catálisis? Para entenderlo, consideremos una reacción química simple: A + B C + D Si la reacción ocurre sin interferencia, eventualmente, parecerá como si se detuviera. Lo que sucede realmente es que tanto la reacción directa como la inversa están ocurriendo en el mismo grado. Esto es lo que conocemos como equilibrio químico y podemos expresar su constante de equilibrio: Keq = [ C] [ D] [ A] [ B] Esta constante es característica de la reacción. Un catalizador aumenta la velocidad a la que la reacción se acerca al equilibrio, pero no altera la naturaleza del estado de equilibrio. Otra propiedad importante de los catalizadores es que son muy efectivos en cantidades muy pequeñas, con respecto a las cantidades a catalizar. La Cinética Enzimática, es una rama especializada de la cinética química, que está basada en la teoría cinética de la materia. En esta teoría, se ve que una solución está hecha de un grupo de moléculas y que cada una de ellas se mueve a una velocidad particular. En este movimiento, ellas chocan entre sí, cada colisión involucra una cierta cantidad de energía. Si la colisión no involucra suficiente energía, la reacción no ocurre. Si la energía es suficiente, las moléculas se combinan para formar un intermediario activado, estableciendo un estado de transición. La energía mínima que se requiere para la formación de este intermediario es la Energía de Activación. Esto lo podemos representar mediante: A B* C Esta reacción la podemos graficar de la siguiente manera: Energía libre... B* Donde B* es el estado de transición Sustrato A Producto C Progreso de la Reacción

2 En una reacción catalizada por una enzima, esta actúa agregando pasos a la reacción, de manera que la energía de activación requerida sea menor:.. Energía libre Sustrato A ES Producto C Donde ES es la unión de la enzima con el sustrato Progreso de la Reacción Note que en las reacciones catalizadas por enzimas, al reaccionante se le llama sustrato. El cambio de Energía libre ó ΔG, es la diferencia de energía libre que se produce entre el estado inicial (sustrato) y el producto final. Si se observa en los gráficos anteriores, el cambio de energía libre es la distancia entre el estado energético del sustrato y la del producto. Note que, con o sin enzima, los niveles de energía libre inicial y final son los mismos y el ΔG es el mismo, por lo que la termodinámica de la reacción no ha cambiado. La Actividad enzimática de una enzima se determina midiendo la cantidad de producto formado (o de sustrato consumido) por unidad de tiempo. La Comisión de Enzimas de la Unión internacional de Bioquímíca ha definido la unidad de enzima como: la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 μmol (micro mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas

3 En la figura anterior se puede observar la típica evolución de una curva obtenida en un ensayo enzimático. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida que avanza la reacción, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reacción), lo que se manifiesta en forma de curva asintótica. Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el período inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. La mayoría de los estudios de cinética enzimática se centran en el período inicial, es decir, en la zona lineal de la reacción enzimática. Sin embargo, también es posible medir toda la curva de la reacción y ajustar estos datos a una ecuación no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimáticas es denominada análisis de la curva de progreso. Método de análisis Como ya se ha visto, las enzimas son proteínas que en los sistemas vivos se encuentran mezcladas entre sí y con muchas otras especies moleculares. Sin embargo, es posible detectarlas y determinarlas con exactitud por las reacciones que catalizan, para lo cual es necesario conocer el o los sustratos que utilizan y el o los productos de sus reacciones, además de poseer los métodos analíticos para medirlos. También se deben considerar todos los controles experimentales, de manera de descartar cualquier otro artefacto experimental de la reacción que pueda hacer aparecer producto o desaparecer sustrato de forma inespecífica. Los controles más importantes son: a. Blanco Sustrato: Es una mezcla de reacción semejante a la mezcla en la que se detecta la actividad enzimática, pero en ella se reemplaza la solución que contiene al sustrato por un volumen equivalente de su solvente. Este volumen puede ser reemplazado por agua o el buffer de la reacción. b. Blanco Enzima: También corresponde a una mezcla semejante a la mezcla en la que se detecta la actividad enzimática, pero en ella se reemplaza la solución que contiene a la enzima por un volumen equivalente de su solvente. Este blanco es importante cuando el sustrato es inestable y se puede obtener producto en ausencia de la enzima. c. Tiempo Cero: Este control contiene todos los componentes necesarios para la detección de la actividad enzimática. Consiste en que la reacción es detenida en el momento mismo en que se inicia (tiempo cero). Por lo general una reacción enzimática se inicia con la adición de la enzima o bien con la de su sustrato. El método analítico para determinar la cantidad de producto formado será a través de un espectrofotómetro. El espectrofotómetro permite determinar la absorción de la luz a determinadazas longitudes de onda, la cual está directamente relacionada con la concentración de los productos.

4 II.- PARTE EXPERIMENTAL 1. Material de estudio Entre las enzimas que se han conocido desde muy antiguo, se encuentran aquellas que hidrolizan la sacarosa. En 1860, Berthelot purificó una enzima procedente de la levadura y que hidrolizaba la sacarosa, la llamó Ferment inversif. más recientemente se le ha llamado: invertasa, sucrasa, sacarasa y O-fructofuranosidasa. El sustrato de esta enzima es la sacarosa y se obtiene como productos glucosa y fructosa. En esta sesión experimental, se usará el procedimiento de análisis a tiempo fijo, que consiste en detener la reacción usando el reactivo 3,5-DNS (ácido 3,5-dínitrosalicílíco) y medir el poder reductor de los productos. 2. Preparación de soluciones Prepare las siguientes soluciones: a) 100 ml de una solución de sacarosa 0,6 M a partir de una solución de sacarosa al 1 M. Desarrollo de los cálculos: b) 50 ml de glucosa y fructosa 0,005 M a partir de una solución de glucosa y fructosa al 1M Desarrollo de los cálculos:

5 Curva de Calibración (ó Curva Estándar) Objetivo: Desarrollar una curva de calibración que permita relacionar la cantidad de producto obtenido con la Absorbancia. Procedimiento: 1) Desarrolle el siguiente protocolo: Reactivos Glucosa y Fructosa 0,005 M Sacarosa 0,6 M H 2 O destilada 3,5-DNS TUBOS Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5-0,2 ml 0,4 ml 0,8 ml 1,2 ml 1,5 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 2,0 ml 1,8 ml 1,6 ml 1,2 ml 0,8 ml 0,5 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño termorregulado a 100ºC. 3) Enfríe los tubos. 4) Determine la Absorbancia de cada tubo, leyendo en espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda 5) Anote las lecturas en la siguiente tabla: CURVA DE CALIBRACIÓN Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5 Cantidad de glucosa y fructosa (μmol) Absorbancia 6) Realice un gráfico (curva de calibración), Absorbancia versus concentración de producto

6 Curva de Progreso. Objetivo: Determinar el progreso de la reacción en el tiempo. Procedimiento: 1) Desarrolle el siguiente protocolo RECUERDE: desde que agrega la enzima debe controlar el tiempo. Luego de cumplido, para detener la reacción agregue 2 ml de 3,5 DNS Reactivos Buffer Acetato 0,1 M ph: 4,7 Sacarosa 0,6 M Invertasa Controlar Tiempo 3,5-DNS Blanco ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml - 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml - 0 min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 12 min 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño termorregulado a 100ºC. 3) Enfríe los tubos. 4) Seleccione en el espectrofotómetro una longitud de onda de 540 nm. Ajuste a cero el equipo utilizando el tubo blanco 5) Mida las absorbancias de los otros tubos ( del 1 al 7) y anote las lecturas en la siguiente tabla: Tiempo min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 12 min Absorbancia 6) Con los datos anteriores y con la curva de calibración, complete la siguiente tabla: Tiempo min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 12 min Cantidad de producto (µmol) 7) Realice un gráfico Tiempo versus concentración de producto.