INFORME ANUAL DEL PROYECTO INTRODUCCIÓN Las enfermedades con origen en el suelo son la principal fuente de pérdidas en los cultivos hortícolas en el

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1 INFORME ANUAL DEL PROYECTO INTRODUCCIÓN Las enfermedades con origen en el suelo son la principal fuente de pérdidas en los cultivos hortícolas en el mundo (Entwistle, 1990). El control de estas enfermedades principalmente se lleva a cabo con fumigantes de suelo o fungicidas, ya que se carece de fuentes de resistencia genética, sin embargo estos agroquímicos no son eficientes debido a el problema de su difusión limitada en el suelo y su acción temporal. Esta situación abre perspectivas para probar otras alternativas que en conjunto puedan establecer el manejo integrado del problema. En su proceso evolutivo las plantas en general han desarrollado mecanismos de defensa que involucran entre otras cosas, las síntesis de compuestos con propiedades antifúngicas, los cuales potencialmente pueden ser usados para combatir hongos en humanos, animales y plantas cultivadas (Rai y Mares, 2003). Particularmente en el caso de hongos fitopatógenos habitantes de suelo existe información muy limitada; Maruzzella y Balter (1959) encontraron acción inhibitoria in vitro de los aceites esenciales de: orégano contra Fusarium oxysporum fsp conglutinans; de tomillo contra F. oxysporum fsp lycopersici y cebolla contra Verticillium alboatrum; Grainge y Ahmed (1988) reportan para el caso de Sclerotium rolfsii efecto inhibitorio con extractos de Azadirachta indica, Curcuma domestica, C. zedoaria, Cymbopogon sp, Erygeron linifolius y Lepidium virginicum; Pandey y Duvey (1994) obtuvieron buenos resultados en el control de la secadera o damping-off del tomate causado por Pythium aphanidermatum y P. devaryanum con aceites esenciales de Hyptis suaveolens, Muralla koenigii y Ocimum canum; Bowers y Locke (2000, 2003)) encontraron que los extractos de chile-mostaza. cassia y el aceite esencial de clavo suprimen el desarrollo de Fusarium oxysporum en melón; estos mismos extractos más el aceite de canela controlaron a Phytophthora nicotianae en plantas de vinca (Catharanthus roseus) en invernadero. En el Estado de Morelos, México el hongo Sclerotium rolfsii se ha convertido en un problema importante en el cultivo de la cebolla ya que se encuentra ampliamente distribuido y causa pérdidas de consideración (Montes- Belmont et al., 2002). Este hongo causa el tizón sureño en cebolla, frijol y otras hortalizas en el Estado de Morelos y además se encuentra presente en varios Estados de la República como Veracruz, Sinaloa, Sonora, Oaxaca, Guerrero, Tabasco, Guanajuato y Puebla. Una alternativa de control para el tizón sureño ha sido la aplicación de extractos de origen

2 natural. Se conocen algunas propiedades antifúngicas que tienen ciertas plantas como son Parthenium hysterophorus, Lepidium virginicum (L.), Cymbopogon sp., Azadirachta indica (Neem) y Zingiber officinale contra S. rolfsii aislado de cacahuate (Grainge y Ahmed, 1988). Extractos acuosos de alfalfa, pimienta y epazote así como combinaciones entre ellas, suprimen la germinación de esclerocios de S. rolfsii en suelo en cultivo de cebolla (González, 2004). En el presente trabajo se probó el efecto de principios activos (metabolitos) de plantas antifúngicas sobre el desarrollo de S. rolfsii in vitro. MATERIALES Y MÉTODOS El trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Fitopatología del CEPROBI. En el cuadro 1 se presentan los aislamientos de Sclerotium rolfsii que fueron usados en todo el trabajo. Como metabolitos a probar se usaron narangin obtenido de Citrus sinensis, geraniol de Geranium sp, eugenol de Pimenta dioica, timol de Thymus vulgaris, borneol de Eucaliptus globulus, carvacrol de Origanum vulgare, linalol de Ocimum basilicum, mentol, de Mentha piperita, citral de Cymbopogon citratus, citronelol de Citrus maxima, y cíneol de Eucaliptus globulus. Cada metabolito fue agregado a medio de cultivo PDA en concentraciones de 5, 3, 1, 0.1, 0.05, y 0.01 % a temperaturas de aproximadamente 45 o C y después vaciado en cajas Petri. Una vez solidificado el medio se transfirieron discos de 5 mm de diámetro de cada aislamiento del hongo (usando 4 repeticiones por aislamiento y por concentración) y se incubaron a 35 o C durante 10 días. Al final de este periodo se registró el número de repeticiones por tratamiento en los que el hongo creció y el número en las que no creció. Con los tratamientos y en las concentraciones en los que no hubo crecimiento en ninguna repetición se hicieron pruebas de combinaciones por pares usando la mitad de la concentración de cada producto siguiendo el procedimiento descrito antes y registrando los mismos datos. Finalmente se hicieron combinaciones de tres en tres de los productos que

3 dieron resultados en las pruebas de combinaciones de dos en dos, siguiendo los mismos pasos ya descritos. Cuadro 1.- Aislamientos de Sclerotium rolfsii de la colección de Fitopatógenos del Laboratorio de Fitopatología del CEPROBI. Número de aislamiento Hospedero Orígen 1 Cilantro Yautepec, Morelos 2 Lenteja Yautepec, Morelos 4 Tabaco Yautepec, Morelos 5 Pajarito Yautepec, Morelos 11 Cebolla Xalostoc Morelos 12 Frijol Yautepec, Morelos 16 Chile Veracruz I 18 Cebolla Guanajuato 20 Cebolla Puebla II 24 Pasto (143) North Carolina EUA 25 Tabaco (156) North Carolina EUA 27 Manzano (1094) California EUA X-1 Frijol Xalostoc Morelos X-2 Frijol Xalostoc Morelos X-4 Frijol Xalostoc Morelos X-5 Frijol Xalostoc Morelos X-6 Frijol Xalostoc Morelos X-8 Frijol Xalostoc Morelos X-9 Frijol Xalostoc Morelos X-11 Frijol Xalostoc Morelos X-15 Frijol Xalostoc Morelos RESULTADOS Y DISCUSIÓN Efecto de metabolitos antifúngicos sobre el crecimiento micelial de Sclerotium rolfsii. De todos los productos probados únicamente el naringin no tuvo efecto inhibitorio, todos los demás productos impidieron el crecimiento durante los 15 días que se mantuvo la incubación de los tratamientos (Cuadros 2, 3 y 4). El producto que tuvo la inhibición total a la dosis más baja fue el carvacrol al 0.01, en tanto que los que requieren la dosis más alta fueron el cineol, el mentol y el linalol que sólo fueron eficientes al 5 %, la mayoría de los

4 productos (geraniol, eugenol, timol y citronelol) fueron efectivos a la concentración de 0.05 %, en tanto que otro grupo (borneol y citral) fue eficiente a dosis de 0.1 %..En cuanto a la respuesta de los diferentes aislamientos esta fue variable hubo algunos como el X-3 que en general tuvo una sensibilidad mayor a las dosis más bajas y otros como el X-9 tuvo resistencia a los productos en las dosis más bajas, lo que nos indica la necesidad de probar un grupo de aislamientos para tener una mayor certeza sobre la respuesta ya que la respuesta no es uniforme y está determinada genéticamente. Cuadro 2. Efecto* de naringin, geraniol, eugenol y timol sobre el crecimiento micelial de Sclerotium rolfsii. CEPA NARINGININ GERANIOL EUGENOL TIMOL X X X X /4 + X /4 + X / X /4 + X / / / /4 2/ / / /4 *+ crecimiento en todas las repeticiones. sin crecimiento en ninguna repetición 1/4 crecimento en el 25 % de las cajas 2/4 crecimiento en el 50 % de las cajas

5 Cuadro 3. Efecto* de borneol, carvacrol, linalol y mentol sobre el crecimiento micelial de Sclerotium rolfsii. BORNEOL CARVACROL LINALOL MENTOL / / / / /4 2/ /3 + 2/4 1/4 3/ / /4 2/4-3/4 + 2/4 + 2/ / /3-3/4 + 2/ /4 + 2/ /4 + 1/4 + 1/3 + 2/4 2/4 + 1/4 3/4 + 3/ /4 1/ /4 1/ /4 *+ crecimiento en todas las repeticiones. sin crecimiento en ninguna repetición 1/4 crecimento en el 25 % de las cajas 2/4 crecimiento en el 50 % de las cajas 3/4 crecimiento en el 75 % de las cajas.

6 Cuadro 4. Efecto* del citral, citronelol y cineol sobre el crecimiento micelial de Sclerotium rolfsii. CITRAL CITRONELOL CINEOL / / / /4 + 2/ /4 2/ / / *+ crecimiento en todas las repeticiones. sin crecimiento en ninguna repetición 1/4 crecimento en el 25 % de las cajas 2/4 crecimiento en el 50 % de las cajas 3/4 crecimiento en el 75 % de las cajas. Efecto de combinaciones de metabolitos antifúngicos sobre el crecimiento micelial de Sclerotium rolfsii. De acuerdo con los resultados de la primera parte del trabajo se probaron los productos que dieron resultados de inhibición del crecimiento micelial y en dosis 50 % menor a la que dio los mejores resultados. Los resultados se muestran en los cuadros 5 y 6; de un total de 45 combinaciones probadas 20 resultaron con 100 % de inhibición sobre los aislamientos probados (10). Esto indica que a pesar de haber sido usadas cada una de las substancias en la mitad de las dosis que fueron efectivas, al combinarse entre si se presenta el efecto inhibitorio al 100 %, lo que nos lleva a la

7 presencia de una respuesta de carácter sinérgico. El producto que más combinaciones inhibitorias al 100 % tuvo fue el timol con 8 productos (geraniol, eugenol, borneol, carvacrol, linalol, mentol y citral) seguido del geraniol con 7 productos (eugenol, timol, borneol, carvacrol, linalol, mentol, citronelol y citral) y el eugenol con 5 (geraniol, timol, borneol, carvacrol y citral). Los productos que tuvieron la menor frecuencia de efecto sinérgico en sus combinaciones fueron el mentol con solo tres combinaciones (geraniol, timol y citral) de nueve probadas al igual que el borneol (geraniol, eugenol y timol) y el linalol con sólo dos de nueve probadas (geraniol y timol). Estas combinaciones permiten que el carvacrol se pueda usar a % o sea a 50 ppm y el eugenol y timol a 250 ppm lo que nos puede permitir que en aplicaciones al suelo las concentraiones necesarias para tener un buen efecto pudieran no ser muy elevadas. Actualmente se están probando combinaciones de los productos de tres en tres en la búsqueda de dosis todavía menores. También quedan pendientes las pruebas para aplicar los productos a suelos infestados de Sclerotium rolfsii para ver si aplicados al suelo se conserva el efecto pero usando dosis más elevadas por el posible efecto de las partículas del suelo, esto será parte de las actividades del Los resultados aquí presentados serán enviados al Congreso Latinoamericano de Fitopatología que se celebrará en mayo de este año en Cancún, Quintana Roo.

8 Cuadro 5. Efecto de combinaciones de metabolitos sobre el crecimiento micelial de Sclerotium rolfsii. Porcentaje de repeticiones con crecimiento. COMPUESTOS AISLAMIENTOS X1 X5 X6 X GER EUG GER0.025 TIM GER BOR GER CAR GER LIN GER MEN GER CITRAL GER CITRO GER CIN EUG TIM EUG BOR EUG CAR EUG LIN EUG MEN EUG CITRAL EUG CITRO EUG CIN TIM BOR TIM CAR TIM LIN TIM MEN TIM CITRAL TIM CITRO TIM CIN

9 Cuadro 6. Efecto de combinaciones de metabolitos sobre el crecimiento micelial de Sclerotium rolfsii. Porcentaje de repeticiones con crecimiento. COMPUESTOS AISLAMIENTOS X1 X5 X6 X BOR 0.05 CAR BOR 0.05 LIN BOR 0.05 MEN BOR 0.05 CITRAL BOR 0.05 CITRO BOR 0.05 CIN CAR LIN CAR 0.05 MEN CAR CITRAL CAR CITRO CAR CIN LIN 0.1 MEN LIN 0.1 CITRAL LIN 0.1 CITRO LIN 0.1 CIN MEN 0.1 CITRAL MEN 0.1 CITRO MEN 0.1 CIN CITRAL 0.05 CITRO CITRAL 0.05 CIN TESTIGO CITRO CIN