Introducción a los Cultivos Celulares

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Julio Revuelta Parra
hace 8 años
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1 Introducción a los Cultivos Celulares

2 Un poco de historia : Primeros ensayos de sobrevida de células fuera de organismos enteros (Roux, Haberlandt, etc.) 1912: Burrows y Carrel establecen las primeras líneas celulares. Desarrollan técnicas asépticas de trabajo y material específico

3 Un poco de historia : Se establecen líneas celulares de diversos órganos animales : Se replican virus sobre células cultivadas Se producen las primeras vacunas virales en cultivos celulares Se definen las condiciones para congelar células en nitrógeno líquido (Alan Parks, 1949) Se establece la línea HeLa (1ª de origen humano, 1952) Se desarrollan los primeros medios de cultivo químicamente definidos Se cultivan las primeras células de insectos

4 Un poco de historia 1960 s: Se desarrollan las técnicas de hibridización en cultivos 1970 s: Los cultivos celulares se incorporan a la ingeniería genética Desarrollo de grandes reactores de cultivos en suspensión Reciente: Modificación genética controlada de células Desarrollo de medios de cultivo libres de suero Desarrollo de medios de cultivo libres de componentes animales

5 Cultivos celulares Propagación de células fuera del organismo de origen Pueden ser de origen vegetal o animal, y dentro de éstas, pueden provenir de distintos tejidos de vertebrados o invertebrados Los cultivos celulares producen clones, por lo que todas las células de un cultivo poseen el mismo genotipo, excepto que se produzcan mutaciones durante el proceso

6 Para qué cultivar células in vitro? Investigación Comprender la fisiología celular Toxicología, virología, etc. Ingeniería de tejidos Piel, hígado Hueso y cartílago Producción de biológicos Anticuerpos monoclonales Hormonas (FSH) Enzimas Vacunas virales (polio, aftosa, parvo, moquillo, etc.)

7 Ventajas Un solo tipo bien definido de células en cada cultivo Fácil de manipular, condiciones controladas Establecimiento de líneas internacionales de fácil acceso Alternativa al uso de animales Sistema para estudiar principios fisiológicos Chequeo posterior en un número reducido de animales Pueden obtenerse grandes cantidades de células Permite trabajar en pequeña, media y gran escala Las células pueden mantenerse congeladas por largos períodos de tiempo con mínima pérdida de viabilidad

8 Sin embargo... Cuidado que no son animales enteros Las células no están organizados en verdaderos tejidos No hay interrelación con otros tejidos El comportamiento es distinto a la organización tridimensional El entorno es distinto Las condiciones de crecimiento son distintas Las conclusiones de los ensayos deben ser debidamente acotadas

9 Componentes de un cultivo CÉLULAS

10 Tipos de cultivo Cultivo primario: células, tejidos u órganos tomados directamente de un animal. Cultivo de órganos, explantes: mantenimiento de órganos o parte de órganos in vitro. Cultivo de tejidos: mantenimiento de tejidos in vitro. Cultivo de células: mantenimiento de células dispersas. Líneas celulares: células mantenidas por subcultivos sucesivos comenzando por un cultivo primario. Cultivos continuos: células que han logrado sobrevivir a muchos subcultivos. Expectativa de vida infinita.

11 Líneas celulares continuas: algunos ejemplos BHK: Fibroblastos de riñón de hamster sirio dorado CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico MDCK: Epitelio de riñón canino (Cocker Spaniel) CHO: Epitelio de ovario de hamster chino VERO: Fibroblastos de riñón de mono verde africano HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano MDBK: Epitelio de riñón de bovino adulto HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana FHBE: Endotelio de corazón fetal bovino Etc., etc., etc.

12 Colecciones internacionales más importantes Sigla Nombre u organismo Ciudad, país Nº de cultivos ATCC American Type Culture Collection Minassas, USA 800 DSMZ Human and Animal Cell Cultures Braunschweig, Alemania 500 ECACC European Collection of Cell Cultures Salisbury, Wiltshire, UK 1000 GEIMM Istituto Giannina Gaslini Genova, Italia 2300 Fuente:

13 Banco de células español El Banco Nacional de Líneas Celulares se configura como una estructura en red con varios nodos coordinados por un central, que tendrá como objetivo garantizar en todo el territorio nacional la disponibilidad de líneas de células troncales humanas embrionarias y adultas para la investigación biomédica. El Banco de Líneas Celulares está adscrito a la Subdirección General de Investigación en Terapia Celular y Medicina Regenerativa del Instituto de Salud Carlos III, Link a la Web del Banco Nacional de Células: s/terapia/terapia_bancocelular.jsp

14 Componentes de un cultivo SOPORTE CELULAS

15 Soporte Líquido: Células en suspensión

16 Bioreactores

17 Soporte Sólido: Células adheridas a superficies plásticas, membranas, polímeros, vidrio etc.

18 Otros soportes de Cultivo

19 Soporte Titulación de virus en microplacas con tinción final

20 Soporte Superficies cubiertas con sustancias que favorecen el crecimiento celular

21 Microcarriers

22 Extraído de From Space to the Clinical Bedside En Internet: slsd.jsc.nasa.gov/bso/resources/ lectures/nplecturemechculture.pdf

23 Componentes de un cultivo SOPORTE FASE GASEOSA CELULAS

24 Fase gaseosa La concentración de oxígeno necesaria depende de los requisitos de las células La concentración de dióxido de carbono depende de la capacidad buffer del medio de cultivo Usualmente el equilibrio dióxido de carbono (en la fase gaseosa) - bicarbonato (en la fase líquida) actúa como buffer del cultivo

25 Componentes de un cultivo SOPORTE FASE GASEOSA CELULAS Materiales

26 Medios de cultivo celulares CUALIDADES: Específico para la célula a cultivar Nutritivo ph adecuado Capacidad buffer Isotónico Estéril

27 Componentes de los medios de cultivo Agua Sales Glucosa Ácidos grasos Vitaminas Suero Péptidos Micro y oligoelementos Aminoácidos esenciales Factores de crecimiento Otro regulador de ph Indicador de ph Antiespumante Antibióticos?

28 Organización de un subcultivo El objetivo de un subcultivo (pasaje) es mantener las células en condiciones de replicación normal. En el subcultivo se renueva el medio de cultivo y se lleva la relación células/medio/superficie de soporte, a la inicial. Las células adheridas a soportes sólidos deben ser primero despegadas de este soporte y separadas enzimáticamente (tripsina). Luego se resuspenden, se tiñen con colorante vital (Azul Tripan) y se cuentan en cámara de Neubauer. Si se parte de un cultivo de células en suspensión directamente se procede a contar las células.

29 Organización de un sub-cultivo Una vez conocida la concentración de células en el material de origen, se definen las condiciones del subcultivo deseado y se realiza el pasaje. Ejemplo Material de origen: 2x10 6 cél/ml Destino: tres botellas de 175 cm 2 con una concentración inicial de cél/cm 2 Necesidad: 3 x 175 x = 1.8x10 7 células 1.8x10 7 células / 2x10 6 cél/ml = 9 ml ( 3 ml / botella )

30 Factores críticos Suero: Ventajas: Gran aporte de nutrientes básicos, proteínas, factores de crecimiento, hormonas, promotores de adhesión, inhibidores enzimáticos, etc. Desventajas: Composición indefinida, variabilidad entre lotes, interferente en procesos de purificación de proteínas, interferente en procesos de multiplicación viral, vehículo de entrada de contaminaciones, etc.

31 Factores críticos Temperatura de cultivo: depende del origen de las células. Mamíferos: 37ºC, peces e insectos: 18-22ºC, aves: 38.5ºC, etc. Contaminaciones: gran complicación en los laboratorios de cultivos celulares, principalmente a escala industrial. Pueden ser por levaduras, hongos miceliares, virus, bacterias, micoplasmas, otras células, etc.

32 Factores críticos no biológicos Orden Limpieza Higiene personal Vigilancia microscópica Estudio adecuado de los problemas Análisis de problemas potenciales Trazabilidad de los cultivos Protocolización exhaustiva

33 Equipamiento Además del equipamiento usual de cualquier laboratorio, se requiere: Microscopio invertido Cámara de conteo de células Flujo laminar de características adecuadas al trabajo a desarrollar Sistema de filtración esterilizante de soluciones, líquidos y medios de cultivo Material de soporte estéril Espacio frío de 4, -20, -75 y 196ºC Estufas de cultivo con o sin atmósfera de CO2

34 Componentes de un cultivo SOPORTE FASE GASEOSA CELULAS Catálogo Materiales

35 Medios de cultivo Medios para Cultivo Celular Hyclone, pinche aquí Biochrom, pinche aquí.

36 Agitación (pinche sobre imagen)

37 Cabinas de flujo laminar (pinche sobre imagen)

38 Incubadores de CO2 (pinche sobre imagen)

39 Manejo de líquidos (pinche sobre imagen)

40 SOPORTE FASE GASEOSA CELULAS Catálogo Materiales Aplicaciones actuales

41 Hibridomas: producción Anticuerpos Monoclonales (pinche sobre imagen)

42 Celulas Madre (Stem Cells) (pinche sobre imagen)

43 Fertilización In Vitro (pinche sobre imagen)

44 Soporte técnico (pinche sobre imagen) Manuales Protocolos Referencias Guías de ususario Artículos técnicos

45 Nuestras marcas

46 Seminarios conmemorativos del Centenario de las técnicas de Cultivo Celular Seminarios conmemorativos del Centenario de Cultivos Celulares (pinche para ver el programa)

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