Bioinformática Máster en Biotecnología

Transcripción

1 Bioinformática Máster en Biotecnología Dr. José L. Oliver Dr. Michael Hackenberg

2 De ~nada a ~todo Biología Molecular: un gen una proteína un gen un laboratorio un gen una tesis Genómica : un genoma una tesis Antes se estudiaba el efecto de un gen ignorando así al 99.99% restante Ahora tenemos datos de todos los genes Qué hacer con ellos? Cómo derivar nuevo conocimiento? Es necesario un nuevo enfoque, un cambio de paradigma 2001 If you can t do Bioinformatics, you can t do Biology J.D. Tisdall, Beginning Perl for Bioinformatics, 2003

3 Qué es la Bioinformática? Biología Molecular Genómica Secuencias de genes y proteínas Estructuras 3D Expresión génica (microarrays) Interacción entre proteínas (interactoma) Secuenciación masiva Genómica personalizada Bases de datos Conocimiento biológico Programas Computación Algorítmica Salud Biotecnología Medio ambiente Genómica comparada Evolución

4 bioinformática informática médica usuarios informática en salud pública bases de datos algoritmos desarrolladores infrastructura

5 Grandes proyectos genómicos: Genoma Humano 1000 Genomas ENCODE

6 El Proyecto Genoma Humano Sus objetivos fueron: Identificar los aprox genes en el genoma humano Determinar la secuencia de los 3.2 Gbp de nucleótidos que componen el genoma haploide y almacenar esta información en bases de datos Mejorar el software para analizar estos datos Transferencia de tecnología al sector privado Abordar los aspectos éticos, legales y sociales (ELSI) que pudiera provocar el proyecto

7 El Proyecto Genoma Humano Fue una iniciativa internacional lanzada en la década de los 90 del pasado siglo para mapear y secuenciar el conjunto de genes del ser humano (genoma) Completado en 2003 con la publicación de la secuencia de referencia del genoma humano

8 Secuenciación masiva 454 Pyrosequencing (PS) Illumina Reversible Termination (RT) SOLID Sequencing by Ligation (SBL)

9 Secuenciación masiva SANGER SECUENCIACIÓN MASIVA Di-deoxy terminator Roche 454 GS FLX (PS) Illumina HiSeq 2000 (RT) SOLID V4 (SBL) Salida por proceso 1.6 Mb 600 Mb 200 GB 100 GB Tiempo/Proceso 1h 10 h 9 d 11 d Longitud media reads 800 pbs 400 pb 100 pb 75 pb Salida por día 38.4 Mb 1.44 GB 22.2 GB 9 GB Usos frecuentes - Secuenciación de novo Captura de exones Resecuenciación Captura de exones Metagenómica Resecuenciación Captura de exones Metagenómica

10 Secuenciación de moléculas únicas: nanoporos David Deamer made this sketch in 1989 when the idea for nanopore sequencing came to him

11 MinION nanopore: a miniaturised single-molecule analysis system, designed for single use and to work through the USB port of a laptop or desktop computer Vídeo demostrativo MinION

12 Secuenciación de DNA mediante nanoporos de proteínas Proyecto financiado por los NIH: el nanoporo lo suministra una proteína, la alfa-hemolisina (ahl) Una de las hebras del DNA atraviesa este nanoporo, movida por un motor molecular de polimerasa Los nucleótidos se van identificando por un laser a medida que atraviesan el nanoporo Conectando miles o millones de estos nanoporos, se espera secuenciar un genoma completo en 10 minutos! Importancia para el diagnóstico/pronóstico del cáncer y otras enfermedades

13 PacBio Sequencing with the PacBio RS II system based on single molecule, real-time (SMRT) technology: Long reads: Depending upon starting library, half of the data are in reads >14,000 base pairs long with the longest reads over 40,000 base pairs. High accuracy: Perform de novo assembly of genomes and detect variants with greater than % accuracy. Sequence individual molecules with 99% accuracy at greater than Sanger lengths. High sensitivity: Detect minor variants that are present at a frequency less than 0.1%.

14 Secuenciación masiva APLICACIONES Re-secuenciación Regulación Epigenómica SNVs y CNVs Inserciones y deleciones Expresión génica ARNs pequeños Metilación del ADN Histonas TFBSs

15 El proyecto 1000 Genomas pretende la caracterización de la variación genética en el genoma humano

16 Trio project: whole-genome shotgun sequencing at high coverage (average 42 X) of two families (one Yoruba from Ibadan, Nigeria (YRI); one of European ancestry in Utah (CEU)), each including two parents and one daughter. Low-coverage project: whole-genome shotgun sequencing at low coverage (2 6 X) of 59 unrelated individuals from YRI, 60 unrelated individuals fromceu, 30 unrelated Han Chinese individuals in Beijing (CHB) and 30 unrelated Japanese individuals in Tokyo (JPT). Exon project: targeted capture of 8,140 exons from 906 randomly selected genes (total of 1.4 Mb) followed by sequencing at high coverage (average >50 X) in 697 individuals from 7 populations of African (YRI, Luhya inwebuye, Kenya (LWK)), European (CEU, Toscani in Italia (TSI)) and East Asian (CHB, JPT, Chinese in Denver, Colorado (CHD)) ancestry.

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19 El proyecto ENCODE La Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) surge de una colaboración internacional iniciada en 2003 y financiada por el National Human Genome Research Institute (NHGRI). El objetivo de ENCODE es elaborar un catálogo exhaustivo de todos los elementos funcionales en el genoma humano, incluyendo tanto ARNs como proteínas, asi como aquellos elementos reguladores que controlan el tipo celular y el momento del desarrollo en que un gen es activo. La cuestión es: la suma de los exones de los aprox genes humanos no llegan al 2% del genoma para que sirve el 98% restante? es ADN basura?

20 Algunas de las técnicas utilizadas en ENCODE RNA-seq. Aislamiento y secuenciación masiva de ARN CAGE. Captura y secuenciación masiva de los caps metilados en los extremos 5 del ARN. Estos caps suelen formarse en los sitios de inicio de la transcripción RNA-PET. Captura simultánea de ARNs con caps metilados y cola de poly-a, es decir ARNs completos, seguida de la secuenciación de un trozo en cada extremo. ChIP-seq. Inmunoprecipitación de las proteínas unidas a la cromatina y secuenciación de las secuencias de ADN asociadas. Se suelen usar anticuerpos frente a factores de transcripción, proteínas no-histonas que se unen a la cromatina, o bien histonas modificadas por metilación, acetilación, etc.

21 DNase-seq. La enzima DNasa I corta preferencialmente regiones de la cromatina unidas a proteínas no-histonas y que corresponden a regiones de cromatina abierta. Los puntos de corte se secuencian, obteniéndose así un listado de sitios hipersensibles a DNasa I que corresponden a sitios de cromatina activa. FAIRE-seq. (Formaldehyde assisted isolation of regulatory elements). Permite aislar regiones genómicas libres de nucleosomas. RRBS (Reduced representation bisulphite sequencing). El tratamiento del ADN con bisulfito convierte las citosinas no-metiladas en uracilo, mientras que no afecta a las citosinas metiladas. Se usan enzimas de restricción que cortan alrededor de los dinucleótidos CpG, con lo que se limita el análisis a aquellas regiones ricas en CpG (islas CpG).

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24 Principales hallazgos de ENCODE La mayor parte del genoma (80.4%) se puede asociar con al menos una función en alguno de los 147 tipos celulares analizados. Puesto que puede haber hasta tipos celulares, este porcentaje podría llegar a ser mucho más alto! Los elementos específicos de primates están sometidos a selección natural deben ser funcionales Se han descubierto enhancers y promotores Muchas de los elementos funcionales encontrados se localizan en las regiones no-codificadoras de proteínas (fuera de los genes) Los SNPs asociados con enfermedades mediante GWAS abundan en las regiones no-codificadoras y residen en zonas funcionales identificadas por ENCODE. Muchas enfermedades se asocian con un determinado factor de transcripción que varía entre tipos celulares.

25 Felix Muerdter & Alexander Stark, Nature 512, (28 August 2014) Más de 1600 nuevos conjuntos de datos, lo que hace un total de 3300 entre ENCODE y modencode

26 Cautelas sobre el proyecto ENCODE (extraidas de las publicaciones de 2014): although they are extremely data-rich, the papers expose how data sets that are created to catalogue all functional elements under standardized conditions are not sufficient for understanding the regulation of transcription, chromatin biology and enhancer function, nor the evolution of these mechanisms. Según Dan Graur esto quiere decir que: Not every piece of chewing gum attached to the soles of your shoes is functional. Moreover, the function of the sole of your shoe to which the chewing gum stuck is NOT to bind chewing gum.

27 Los programas y bases de datos que utilizaremos funcionan en servidores web: Bases de datos públicas en línea: EBI, NCBI El software se ejecuta en servidores remotos de acceso público: Formularios Web: Copiar/pegar datos Resultados Ventajas: Datos actualizados on-line Acceso a software profesional permanentemente actualizado por sus propios autores No tendremos que instalar ningún programa ni base de datos en nuestra máquina local, todo lo haremos a través de un navegador web Podremos acceder a las prácticas del curso desde cualquier ordenador (Windows, Linux, Mac ) con acceso a Internet

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