Recomendaciones para la recolección, manejo y envío de muestras para un diagnóstico efectivo de enfermedades virales

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1 Depósito Legal: ppi200802ar Septiembre-Diciembre Recomendaciones para la recolección, manejo y envío de muestras para un diagnóstico efectivo de enfermedades virales Magaly Bracamonte 1, Cesar Obando 1, Manuel Méndez 1, Vilma Cadenas 1, Noris Plaza 2 1 Laboratorio de Virologia, Sanidad Animal INIA-CENIAP Correo electrónico: mbracamonte@inia.gob.ve 2 Unidad de Epidemiología, Sanidad Animal INIA-CENIAP Introducción Aspectos a considerar en la toma de muestras Procedimiento para la toma de muestras Manejo de la muestra Identificación de la muestra Envío de la muestra Pruebas de laboratorio Bibliografía consultada Introducción El diagnóstico metodológico, es una herramienta importante para la identificación del agente etiológico causante de una enfermedad clínica o subclínica que pudiera estar afectando un determinado animal o rebaño. Esta actividad realizada en el Laboratorio de Virología del CENIAP, se antepone al reto de procesar muestras de tejido animal que pudieron ser mal recolectadas comprometiendo, aún más, el proceso diagnóstico. A tales efectos, se hace necesario tomar en cuenta los principios básicos para la obtención de una adecuada muestra de tejido, iniciándose de la selección del animal, y utilizando los criterios de preservación convenientes para garantizar la integridad de los agentes infecciosos que se tratan de identificar. En el caso de los agentes virales se han de garantizar condiciones tales como medios de preservación adecuados, ph y temperatura entre otros, para mantener la viabilidad de los virus y evitar las acciones de los anticuerpos que puedan estar presentes en los tejidos y que al actuar sobre estos organismos dificultan su detección. Aspectos a considerar en la toma de muestras Elección del animal adecuado Deben tomarse las muestras de aquellos animales que reflejen condiciones clínicas características o signos aparentes de la enfermedad (sospecha), evitando aquellos que hubiesen recibido tratamiento sintomático. Calidad de la muestra Se recomienda que las muestras para aislamiento viral sean colectadas lo más cercano al inicio de la enfermedad, regularmente los primeros cinco días de iniciado el proceso, (fase aguda). Las muestras tomadas en fases más Revisores: M.V., M.Sc. Nelson Pérez (INIA) MV. M.Sc. Zoraida Navas (FCV/UCV) 1

2 tardías contienen menor cantidad de virus y requieren trabajos más laboriosos en el laboratorio para lograr identificar el agente viral. Características de la muestra Las muestras de preferencia son: secreciones y fluidos corporales, semen, saliva, secreciones nasales, orina, leche, vesículas, heces y sangre, dependiendo de la clínica presente. Por ejemplo, en animales con problemas respiratorios se toman hisopados nasales; con problemas intestinales, hisopados de materia fecal y con problemas neurológicos liquido espinal, y en el caso de abortos se toma el feto y la placenta, entre otros. En el caso de animales muertos se toman muestras de aquellos tejidos afectados que se observan en la necropsia con alguna alteración macroscópica, de preferencia los tejidos del sistema linfoide tales como bazo, amígdalas, ganglios cercanos a los sitios de lesión, los cuales resultan excelentes para el diagnóstico de las enfermedades virales. Procedimiento para la toma de muestras Al utilizar hisopos para la toma de muestra, es preferible usar los de dacrón, ya que los de algodón contienen residuos de hipoclorito de sodio, que inactivan los virus. Para el transporte se debe emplear un medio adecuado para aislamiento viral con PBS (Buffer Fosfato Salino), suplementado con 0,5% de gelatina, suero o albúmina bovina más antibióticos, existen en la actualidad numerosos medios comerciales. En el caso de tomar muestras de órganos, hacerlo lo más asépticamente posible, con instrumentos estériles, cortes precisos, envasados inmediatamente en frascos limpios e identificados correctamente, y en forma individual (Foto 1 y 2). Foto. 1. Toma de muestra de organo en autopsia. En estos casos, se debe tomar una muestra de órgano que contenga partes del tejido sano y con lesiones visisbles. Para tomar muestras de sangre, cuando se precise una abundante cantidad de suero, 2 se recomienda hacer la extracción de la yugular, por ser una vena de fácil acceso, con una buena corriente de sangre, posteriormente debe limpiarse la zona para evitar residuos que permitan posteriores contaminaciones, también existe la alternativa de la Foto. 2. Diferentes tipos de envase utilizados con la identificación del animal, ubicación de la finca, tipo y nombre del tejido u órgano, soluciones fijadoras o conservantes empleadas según el caso. vena coccígea media y la vena femoral (Fotos 3 y 4). Se necesita como mínimo 2 ml de suero para una prueba, por lo que es necesario recoger aproximadamente 10 ml de sangre en cada tubo vació sin anticoagulante, bien identificado, inclinarlo a temperatura ambiente aproximadamente 37 C por 30 minutos, para que separe un buen coagulo luego envasarlo en frío y enviarlo antes de 8 horas, de ser posible, al laboratorio si demora el envío, congelar a -20 o -30 C hasta su envío. En caso de sospecha de enfermedades vesiculares La muestra de preferencia en este caso es la mucosa lingual, en segundo lugar las muestras de lesiones gingivales, mamarias y nasales que a pesar de poseer sustancias como saponinas y lípidos (anticomplementarias), estas pueden interferir el diagnóstico, sobre todo cuando se utiliza la técnica de fijación de complemento. En tercer lugar, muestras de lesiones podales, las cuales resultan de mala calidad, cosa que ocurre generalmente por contaminación, y por ser el sitio de elección a para la aplicación de tratamientos sintomáticos, ambas condiciones alteran el ph de la muestra, y pueden llegar a inactivar los virus. Dos gramos resultan suficiente cantidad para su procesamiento en el laboratorio. Esta muestra debe ser tomada lo más asépticamente posible, de animales sin tratar, refrigerarse y conservarse en un medio adecuado para su transporte. La obtención de una buena muestra también depende de manipular a los animales adecuadamente (Foto 5).

3 En el caso de muestras de animales sospechosos a rabia, se prefieren muestras de cerebro (corteza, cuernos de Amón) y cerebelo, extremando las medidas de bioseguridad, evitando contacto con la piel. La mejor forma es enviar la cabeza completa, bien refrigerada, envuelta en bolsas plásticas pero no congelada, si se trata de animales pequeños, se recomienda enviar el cuerpo completo para ser procesado en el laboratorio. Antes de las 48 horas de haberla tomado. Para sospecha de encefalitis equina, se efectúan exámenes serológicos con sangre de equinos sospechosos con síntomas y no vacunados, en el caso de animales con más de 90 días de haber sido vacunados, enviar sueros pareados para seroconversión. Donde sea necesario el aislamiento viral: enviar sangre de equinos con viremia en los primeros cinco días de enfermedad, equinos asintomáticos pero que estén en contacto con los anteriores y animales con signos neurológicos. En el caso de animales que hubiesen muerto en fase aguda de la enfermedad, con signos neurológicos o que estuviesen en contacto con los sacrificados las muestras de elección serían: cerebro, hígado y bazo. Manejo de la muestra Para lograr buenos resultados en el aislamiento viral, donde se precisa mantener la partícula viral viva, las muestras deben ser tomadas en la fase inicial de enfermedad lo más asépticamente posible mantenerlas frescas y enviarlas rápidamente al laboratorio para ser procesadas, conservándolas durante su envío en refrigeración en Foto 3. Abordaje de la vena yugular Foto 4. Toma de sangre de la vena caudal en animales adultos para volúmenes de sangre menores Foto 5. Una buena sujeción e inmovilización del animal a fin de examinar las lesiones en lengua y poder extraer una buena muestra para estudios Inmunohistopatológicos y virales. 3 1 o 2 ml de PBS con doble concentración de antibióticos o en suero fisiológico estéril. Los trozos de ór- ganos de necropsia (pulmón, riñón, bazo, ganglios mesentéricos, fetos) se pueden enviar en envases con suero fisiológico-glicerinado al 50% v/v en congelación o refrigeración con abundante hielo. En caso de que sea necesario trabajar la muestra en el laboratorio para técnicas donde se precise detección del virión, o de sus componentes estructurales no se necesita del virus vivo, sino conservar su estabilidad, esto facilita la realización del proceso. Además, debemos recordar que la conservación de los virus depende mucho de su estructura, virus con capa son más lábiles (Ejemplo: virus respiratorio sincicial) y los virus desnudos se mantienen viables por años congelados a -20 C (Ejemplo,. rotavirus), en general ellos deben mantenerse entre 40 C y -80 C. En todo animal en el que se sospeche enfermedad viral, debido a la afinidad de estos por los linfocitos, se le debe tomar además de los órganos o secreciones una muestra de sangre completa con anticoagulante citrato, EDTA, oxalatos, heparina y además muestras de suero (mínimo 2 ml de suero para cada prueba). Se deben extremar los cuidados en el material a utilizar para la toma de muestra: la mayoría de las alteraciones de la sangre en el laboratorio resultan por hemólisis, generalmente producida por jeringas, agujas de pequeño calibre que producen mucha fricción, tubos húmedos o calientes, movimientos muy bruscos durante la toma de sangre o en el transporte, contaminación bacteriana de la muestra, temperaturas muy extremas (Fotos 6 y 7). Identificación de la muestra Todas las muestras deben enviarse correctamente identificadas y acompañadas por un formulario de remisión de muestras, con todos los datos epidemioló-

4 Foto 6. Tubos de muestras sanguineas con indeseables grados de hemólisis (leve, Tubo izquierdo; fuerte, tubo derecho). gicos (edad de los animales, grupo etáreo, vacunas aplicadas, signos clínicos, etc.) que pudieran orientar adecuadamente al técnico de laboratorio a conducir las pruebas internas oportuna y eficazmente, para poder brindar resultados certeros en corto tiempo, facilitando la solución de los problemas en el campo. Esta información (extra) nunca esta de más, y puede brindar datos relevantes para enriquecer el estudio en el laboratorio y orienten a un mejor y más preciso diagnóstico (Fotos 8 y 9). Envío de la muestra Los mejores resultados se obtienen de muestras que llegan al laboratorio dentro de 6 a 12 horas luego de la recolección, deben ser transportadas en tubos o envases plásticos de preferencia, para evitar roturas que derramen el contenido, identificados con marcador de tinta permanente y en bolsas plásticas con cierre hermético en cavas refrigeradas. Foto 7. Tubos conteniendo suero sanguineo (Izquierdo, muestra ideal; derecha, poca cantidad y muestras de contaminación. Si las muestras se van a enviar por una empresa de correo, es recomendable programar la toma de las muestras para que el momento del envió no coincida con días feriados o con fines de semana ya que en muchas ocasiones las ofertas de servicios pueden alterarse por la disponibilidad de los reactivos o por la acumulación de muestras en el laboratorio, falta continua y oportuna de cultivos celulares, animales de laboratorio u otros sustratos necesarios para tal fin. Todos estos factores se deben de tener en cuenta a la hora del envío de las muestras y acordar previamente con los responsables del laboratorio para no perder tiempo ni la muestra (Foto 10). 4 Pruebas de laboratorio Siguiendo todas las recomendaciones anteriores el laboratorio de diagnóstico estará en capacidad de realizar de forma oportuna y confiable: Foto 8. La identificaión de los envases es importante. En la toma de sangre es importante considerar el tipo de envase, si lleva o no anticoagulante, cuando se desea la obtención plasma o suero sanguíneo. Pruebas indirectas Efectivas para el estudio serológico clásico, donde se requieren 2 muestras de sangre, una en la etapa aguda de la infección y otra en la convalecencia, con 2 a 4 semanas de intervalo, y de este modo poder observar una efectiva seroconversión; esto es lo que se conoce como Estudio Serológico Pareado. El mismo detecta un aumento de los títulos de anticuerpos entre ambas tomas de sangre para inferir contacto viral. También existe la alternativa de lograr con muestras de sangre de animales enfermos y sanos de la misma finca, demostrar infección reciente (IgM) o antigua (IgG), o más aún evaluar una efectiva respuesta vacunal, midiendo los niveles de anticuerpos correspondientes, en muestras de sangre de un animal vacunado contra una determinada enfermedad. Todas estas pruebas tienen como fundamento la detección de anticuerpos específicos, algunas de ellas son: ELISA para detección de anticuerpos, seroneutralización, fijación de complemento, inmunodifusión en gel de agar, entre otras. Foto 10. Se deben tomar las preecauciones para el transporte de las muestras de sea de manera refrigerada y así evitar las posibilidades de deterioro durante esta etapa. Foto 9. Se debe tomar toda la información necesaria para ayudar completar el diagnóstico. Pruebas directas Tienen como fundamento evidenciar la presencia de la partícula viral específica, mediante el aislamiento del agente viral, utilizando diferentes medios como cultivo celular, glóbulos blan-

5 cos, huevos embrionados entre otras, o la detección del antígeno viral, mediante diversas pruebas como inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, ELISA de captura de antígeno, detección del ácido nucleico viral por PCR, permitiendo de esta manera un diagnóstico eficaz y la oportunidad de un tratamiento para los animales. Bibliografía consultada Alonso, A Manual de Diagnóstico de las Enfermedades Vesiculares. Serie de manuales didácticos Nº 15. OPS-OMS. 50p. Boletín Técnico Agropecuario Enfermedades comunes de la ganadería de doble propósito en los llanos centrales de Venezuela. Edición especial Fundación INLACA- DPA. 26p. Crespo, M El diagnóstico viral por el laboratorio. Colombia medica. 31: Harlow Ed.& Lane David Antibodies A Laboratory Manual. Cold Sprin Harborm Laboratory. USA. Merchant,L.A Bacteriología y Virología Veterinaria, 3 a edición. 864p. Tizard,I.R Inmunología Veterinaria, 6 ta edición. Mc Graw Hill. 5