Treponema pallidum Screen ELISA

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1 Instrucciones de Uso Treponema pallidum Screen ELISA Inmunoensayo enzimático para la detección cualitativa de anticuerpos Treponema pallidum específicos totales (TAB) en suero o plasma humanos. RE58821 RE x8 10x12x8 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. USO PROPUESTO Inmunoensayo enzimático para la detección cualitativa de anticuerpos Treponema pallidum específicos totales (TAB) en suero o plasma humanos. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS La sífilis (sinónimo: lúes), una enfermedad crónica que ocurre sólo en los seres humanos, es causado por infección con el patógeno Treponema pallidum (T. pallidum). Se transmite principalmente por contacto sexual, pero también hay un riesgo de transmisión al feto vía infección materna durante el embarazo y el riesgo de transmisión por transfusión de sangre. Los anticuerpos pueden ser detectados a las pocas semanas después de la infección por sífilis. El diagnóstico serológico se realiza con dos tipos de ensayos de anticuerpos: no específicos (anti-cardiolipina, anti-rpr) y específicos (anti-treponema). Una de las razones principales para el uso continuado de ensayos no específicos (RPR, VDRL, CMT, etc) se basa en la observación de que en respuesta al tratamiento adecuado (antibiótico), se produce una disminución significativa en el título de los anticuerpos. Ésto se toma como el criterio de un tratamiento adecuado (3,4). Los ensayos específicos se basan en el uso de antígenos treponémicos selectivos. Antes de la era del VIH, se utilizaron los ensayos treponémicos específicos principalmente para confirmar los resultados positivos obtenidos por la prueba de detección no específica. A pesar de que las pruebas treponémicas tradicionales específicas (como MHA-TP y FTA-Abs) son generalmente consideradas fiables para la detección de infecciones pasadas y recurrentes (sin tratamiento), su especificidad es limitada debido a la ausencia de técnicas de cultivo in vitro de T. pallidum (2). El uso de antígenos recombinantes treponémicos en el "Treponema pallidum Screen ELISA" se traduce en una mayor sensibilidad y especificidad diagnóstica para aplicaciones de diagnóstico de rutina. El ensayo de Treponema pallidum Screen se utiliza para el diagnóstico de las infecciones por T. pallidum en instituciones de salud y para la detección en bancos de sangre. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El antígeno T. pallidum es una mezcla de proteínas recombinantes de epítopes inmunodominantes. Estos antígenos son considerados como concluyentes para el diagnóstico en la práctica clínica. Los antígenos se encuentran inmovilizados en los micropocillos. Los anticuerpos específicos de T. pallidum presentes en la muestra y los controles que se agregan a los pocillos se unen a estos antígenos inmovilizados en la placa. Todas las proteínas no unidas se eliminan durante la fase de lavado. A continuación los antígenos de T. pallidum marcados con peroxidasa (por ejemplo el conjugado) se unen a los sitios libres de unión de los anticuerpos T. pallidum que han formado ya un complejo con los antígenos de recubrimiento de la placa. La enzima peroxidasa en el conjugado actuará como el indicador de los anticuerpos humanos de T. pallidum unidos. Un segundo paso de lavado elimina todo el conjugado no unido. El TMB como substrato cromogénico induce una intensidad de color relativo a la cantidad de anticuerpos unidos. No hay una dependencia de la clase de anticuerpos. En consecuencia, todas las clases de inmunoglobulinas serán detectadas, por lo que convirtiendon el ensayo en un verdadero sistema de detección de anticuerpos totales (TAB)". Debido a la sensibilidad del sistema, la gran mayoría de las muestras positivas se traducirá en una señal "fuera del intervalo. 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. Version / 5

3 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos. 9. Evite el contacto con la Solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel. 10. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y encontrados negativos para anti-hiv I/II, HBsAg and anti-hcv. Sin embargo, la presencia de estos u otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación. 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. La placa de microtitulación es estable hasta la fecha de caducidad del juego de reactivos aún cuando la bolsa haya sido abierta, siempre que se vuelva a cerrar herméticamente y se almacene a 2-8 C. 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Suero, Plasma Se deben observar las precauciones usuales para la venipuntura. Es importante preservar la integridad química de la muestra de sangre desde el momento de su toma hasta el ensayo. No emplee muestras fuertemente hemolizadas, lipémicas o ictéricas. Las muestras que presenten turbidez deben centrifugarse antes de ensayar para eliminar cualquier material particulado. Almacenamiento: 2-8 C -20 C Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. Estabilidad: 2 dias > 2 dias Evite congelar y descongelar repetidamente. 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Cantidad Símbolo RE58821 RE x 12 x 8 10 x 12 x 8 MTP 1 x 13 ml 2 x 55 ml ENZCONJ 1 x 1.0 ml 3 x 2.0 ml CONTROL + 1 x 1.0 ml 3 x 2.0 ml CONTROL - 1 x 1.8 ml 5 x 1.8 ml CONTROL CO 1 x 100 ml 5 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml 2 x 55 ml TMB SUBS 1 x 15 ml 2 x 55 ml TMB STOP Componente Placa de Microtitulación Listo para usar. Tiras separables. Recubierto con antígeno recombinante T. pallidum. Conjugado Enzimático Listo para usar. coloreado en rosado. conjugado con HRP. Contenido: antígeno recombinante T. pallidum. Control Positivo Listo para usar. Coloreado en rojo. Contenido: Suero humano, estabilizadores, conservantes, T. pallidum anticuerpos específicos. Control Negativo Listo para usar. Coloreado en Amarillo. Contenido: Suero humano, estabilizadores, conservantes. Control Cut-Off Listo para usar. Coloreado en verde. Contenido: Suero humano, estabilizadores, conservantes, T. pallidum anticuerpos específicos. Solución Buffer de Lavado, Concentrado (10x) Contenido: Solución buffer fosfatada. Solución de Substrato TMB Listo para usar. Contenido: TMB (Tetramethylbenzidine). Solución de Parada TMB Listo para usar. Contenido: 0.5 M H 2SO 4. Version / 5

4 8. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 10; 100; 200; 1000 µl. 2. Vortex 3. Incubadora, 37 C 4. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo 5. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración 6. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia nm) 7. Agua bidestilada o desionizada 8. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro 9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 5. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa. 6. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales. 7. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos. 8. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO Preparación de Componentes El contenido del kit para 96 determinaciones puede ser dividido en 3 ensayos separados. Los volúmenes declarados más abajo son para un ensayo con 4 tiras (32 determinaciones). Diluya / disuelva 30 ml Componente Diluyente Relación Notas Almacenamiento Estabilidad WASHBUF CONC 270 ml agua bidest. 1:10 Para disolver los cristales, temple hasta 37 C. 2-8 C 4 semanas Version / 5

5 11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 1. Pipetee 100 µl de los controles y muestras en los pocillos respectivos de la Placa de Microtitulación. Recomendamos de pipetar los controles positivos (ROJO) y negativos (AMARILLOS) por duplicado, el control cut-off (VERDE) por cuádruplo. 2. Cubre la placa con folio adhesivo. Incube 60 min a 37 C. 3. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 5 x con 300 µl de Solución Buffer de Lavado diluída. Remueva el exceso de la solución golpeando cuidadosamente la placa invertida en una toalla de papel. 4. Pipetee 100 µl de Conjugado Enzimático en cada pocillo. 5. Cubra la placa con folio adhesivo. Incube 30 min a 37 C. 6. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 5 x con 300 µl de Solución Buffer de Lavado diluída. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa the invertida sobre una toalla de papel. 7. Para la adición del Substrato y Solución de Parada utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales. La adición de substrato y solución de paro debe llevarse a cabo en intervalos de tiempo iguales. Evite la formación de burbujas pipeteando con sobrevolumen. 8. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TMB en cada pocillo. 9. Incube 15 min a 37 C. Evite la luz solar directa. 10. Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 µl de Solución de Parada TMB en cada pocillo. Mezcle el contenido brevemente agitando cuidadosamente la placa. El color cambia de azul a amarillo. 11. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: nm) dentro de los 10 min de haber agregado la Solución de Parada. 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados son válidos solamente si el ensayo ha sido realizado de acuerdo a las intrucciones. Además el usuario debe atenerse a las Prácticas de Buen Laboratorio (GLP) u otras normas o leyes comparables. Para la determinación del diagnóstico, el usuario y/o el laboratorio deben de tener un sistema validado de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS El valor de corte está dado por la densidad óptica (DO) del control de corte. El índice de corte (COI) se calcula a partir de la media de densidad óptica de la muestra y el valor de corte. Si la densidad óptica de la muestra está dentro de un intervalo de 20% de todo el valor de corte (Zona gris) la muestra tiene que ser considerada como límite. Las muestras con mayor DOs son positivas, las muestras con DOs inferiores son negativas. El índice de corte (COI) de las muestras puede ser calculado de la siguiente manera: COI = DO Muestra DO Control cut-off 14. INTERPRETACION DE RESULTADOS Método Intervalo Interpretación Los resultados por si solos no deben ser la única < 0.8 negativo razón para un tratamiento terapéutico, sino que Cualitativa deben correlacionarse con observaciones (Índice de corte, COI) dudoso > 1.2 positivo clínicas y ensayos de diagnóstico. Version / 5

6 Negativo: No se detectaron anticuerpos contra T. pallidum. Equívoco: No es posible una interpretación clara. En tal caso, se recomienda confirmar los resultados de las muestras ensayandolas una vez más por duplicado. En el caso de que el resultado se repite una vez más equívoco, una segunda muestra debe ser ensayada y juzgada por un cambio en el resultado. Positivo: Anticuerpos específicos contra T. pallidum detectados. 15. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La toma de la muestra y almcenamiento tiene un efecto importante en los resultados. Vea TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO para mayores detalles. Los siguientes componentes substancias no tienen un efecto significativo en los resultados hasta las concentraciones declaradas. 16. PRUEBAS FUNCIONALES Especificidad Analítica (Reactividad Cruzada) No se hallaron reactividades cruzadas con: Hemoglobina Bilirrubina Triglicéridos Precisión COI CV (%) Muestra Intra-Ensayo Inter-Ensayo Inter-Lote Especificidad clínica 100% (n = 728) Sensibilidad clínica 99% (n = 160) 0.07 mg/ml 1.25 mg/ml 5.70 mg/ml H.pylori, TORCH, EBV, Sarampión, parvovirus, borreliosis, anticuerpos ds-dna, ANA-ANCA, anticuerpos autoinmunes y Suero de Mujeres embarazadas. 17. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Report of a WHO Scientific group (1982). Treponemal infections. Technical Report Series Fieldsteel A.H., Cox D.L., Moeckli R.A. (1981). Cultivation of virulent Treponema pallidum in tissue culture. Infect. Immun. 32: Baker - Zander S.A., Roddy R.E. (1986). IgG and IgM antibody reactivity to antigens of Treponema pallidum after treatment of syphilis. Sex.Trans.Dis. 13 (4): Schroeter A.L., Lucas J.B. (1972). Treatment for early syphilis and reactivity of serologic tests. JAMA 221 (5): Farshy C., Hunter E. (1984). Double-Conjugate Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Immunoglobulins G and M against Treponema pallidum, J. Clin, Microbiol. 20(6): Lee. J., Larsen S. (1986). Detection of Immunoglobulin M in Cerebrospinal Fluid from Syphilis Patients by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, J. Clin, Microbiol. 24(5): Norris S. J. (1993). Polypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their Structural, Functional, and Immunologic Roles, Microbiological Reviews 57(3): Ito F., Larsen S. (1992). Specific Immonofluorescent Staining of Pathogenic Treponemes with a Monoclonal Antibody. J. Clin, Microbiol. 30(2): Larsen S, Steiner B. (1995). Laboratory Diagnosis and Interpretation of Tests for Syphilis, Clinical Microbiology Reviews. 8(1): Zrein M., Maure I. (1995). Recombinant Antigen-Based Enzyme Immunoassay for the Screening of Treponema pallidum Antibodies in Blood Bank Routine. J.Clin.Microbiol. 33(2): Young H., Moyes A. (1998). Novel Recombinant-Antigen Enzyme Immunoassay for Serological Diagnosis of Syphilis. J.Clin.Microbiol. 36 (4): Ijsselmuiden O., Schouls L. (1998). Sensitivity and Specificity of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using the Recombinant DNA-Derived Treponema pallidum Protein TmpA for Serodiagnosis of Syphilis and the Potential Use of TmpA for Assessing the Effect of Antibiotic Therapy, J.Clin.Micobiol. 27(1): Notenboom R., Meddens M. (2006). Evaluation of Trep-Sure; a new first-line enzyme immunoassay for the detection of total anti-treponemal antibodies. Int. J. STD&AIDS. 17(S1): 15 Version / 5

7 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /