4. DIL SAMP DILUYENTE DE LAS MUESTRAS: Tampón fosfato con proteínas estabilizadoras y conservantes. Listo para usar.

Transcripción

1 bioelisa HIV-1+2 (rec) LEER CAMBIOS SOMBREADOS 96 tests tests Test de ELISA para la detección de anticuerpos contra HIV-1 y HIV-2 en suero o plasma humano. Sumario Como es conocido actualmente, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) esta causado por dos retrovirus denominados HIV-1 y HIV-2. La detección de anticuerpos específicos en el suero o plasma de individuos infectados es muy importante, especialmente en la medicina transfusional. En los ensayos para HIV-1 de primera generación, se usaban lisados virales derivados de cultivos celulares para la detección de los anticuerpos específicos. Aunque estos ensayos obtuvieron una alta sensibilidad, se podían apreciar problemas de especificidad principalmente debido a reacciones cruzadas con antígenos celulares. Las reacciones inespecíficas se pudieron reducir en los ensayos para HIV-1 de la siguiente generación mediante el uso de antígenos recombinantes. Además, se observó un aumento de la sensibilidad ya que al utilizar tecnología de antígeno recombinante, regiones inmunodominantes de los antígenos seleccionados pueden obtenerse en grandes cantidades. El diagnóstico del HIV se tornó aun más complicado con la detección de un segundo virus causante del SIDA, el HIV-2. Aunque la mayoría de las infecciones especificas del HIV-2 pueden ser localizadas en la región del Oeste Africano, un número creciente de casos confirmados causados por estos virus han sido reportados de países no africanos. Las reacciones serológicas cruzadas entre los antígenos de ambos virus están limitadas, especialmente en lo que se refiere a las proteínas altamente inmunogénicas gag y env. De esta manera, se necesita un antígeno específico de HIV-2 para garantizar el diagnostico efectivo del HIV. Últimamente se ha descubierto en África Central una nueva mutación del HIV-1 denominada subtipo O. Este kit detecta anticuerpos frente al subtipo O del HIV-1. Principio bioelisa HIV-1+2 (rec) es un enzimo inmunoensayo en fase sólida de tercera generación en el que se utilizan antígenos recombinantes altamente purificados, para la detección combinada de anticuerpos contra HIV-1, HIV-2 y HIV-1 subtipo O. Las partes N-terminales inmunodominantes de las proteínas transmembranales gp41 del HIV-1, gp36 del HIV-2, así como el antígeno altamente reactivo del core p24 del HIV-1, se producen mediante tecnología recombinante. Estos antígenos están altamente purificados y se emplean para recubrir las microplacas. Durante la incubación del suero, los anticuerpos específicos contra HIV se unen a los antígenos recombinantes virales. El material no unido a la fase sólida se extrae en el subsiguiente lavado. Los complejos antígeno-anticuerpo formados en la primera incubación, se detectan mediante antígenos recombinantes de HIV-1 y HIV-2 altamente purificados, marcados con la enzima peroxidasa. La actividad de la enzima se determina mediante la adición de una solución sustrato que contiene un cromógeno. Esta solución desarrolla un color azul si la muestra es positiva. El color azul cambia a amarillo después de parar la reacción con ácido sulfúrico. La intensidad del color es proporcional a la concentración de anticuerpos anti-hiv en la muestra. Los pocillos conteniendo muestras negativas, permanecen incoloros. Componentes 1. MCPL MICROPLACA: 12 x 8 pocillos recubiertos con antígenos recombinantes de HIV-1 y de HIV-2. Pocillos con fondo en U. 2. CONJ 51x CONJUGADO CONCENTRADO: Antígenos recombinantes de HIV-1 y de HIV-2 conjugados con peroxidasa. Contiene proteínas estabilizadoras y conservantes. Diluir 1/51 con el diluyente de conjugado antes de usar. 3. DIL CONJ DILUYENTE DEL CONJUGADO: Tampón fosfato con proteínas estabilizadoras y conservantes. 4. DIL SAMP DILUYENTE DE LAS MUESTRAS: Tampón fosfato con proteínas estabilizadoras y conservantes. Listo para usar. 5. WASH SOLN 20x SOLUCIÓN DE LAVADO: Tampón salino concentrado (20x) con aditivos. Diluir 1/20 con agua destilada o desionizada antes de usar. 6. SUBS BUF TAMPÓN SUSTRATO: Tampón citrato-acetato conteniendo peróxido de hidrógeno.

2 7. SOLN TMB CROMÓGENO: Solución de 3,3, 5,5 -Tetrametilbencidina (TMB). Diluir 1/100 con el tampón sustrato antes de utilizar. 8. CONTROL + 1 CONTROL POSITIVO HIV-1: Suero humano diluido e inactivado positivo para anticuerpos anti-hiv-1. Contiene conservantes. Listo para usar. 9. CONTROL + 2 CONTROL POSITIVO HIV-2: Suero humano diluido e inactivado positivo para anticuerpos anti-hiv-2. Contiene conservantes. Listo para usar. 10. CONTROL CONTROL NEGATIVO: Suero humano normal, negativo para anticuerpos anti-hiv-1 y anti-hiv-2. Contiene conservantes. Listo para usar. 11. H 2 SO 4 1N SOLUCIÓN DE PARADA (sólo en el kit de 1 placa): Acido sulfúrico 1N. Listo para usar. 12. SEALS LÁMINAS ADHESIVAS: Para cubrir la placa durante las incubaciones. 13. BAG BOLSA DE PLÁSTICO: Para guardar las tiras sin usar. Precauciones bioelisa HIV-1+2 (rec) es para el diagnóstico IN VITRO. Para uso exclusivo por profesionales. ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO. Todo el material de origen humano utilizado en la preparación de este producto ha sido encontrado negativo a la presencia de anticuerpos de los virus HIV-1/HIV-2 y HCV, así como a la del antígeno de superficie de la hepatitis B, utilizando un método comercial aprobado, excepto cuando deba ser necesariamente positivo. Los controles positivos han sido inactivados por tratamiento térmico. Sin embargo, dado que ningún método puede ofrecer la total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos, este producto debe manejarse con precaución: - No permitir que los reactivos entren en contacto con la piel o los ojos; si esto ocurre, lavar con abundante cantidad de agua. - Usar guantes. - No pipetear ningún reactivo con la boca. - No fumar. - Depositar todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Los restos de muestras, controles, reactivos aspirados y puntas desechables deben recogerse en un recipiente destinado al efecto y autoclavarse una hora a 121 C, o tratarse con hipoclorito sódico a una concentración final del 10%, durante 30 minutos. (Los restos que contengan ácido deben ser neutralizados antes de añadir el hipoclorito sódico). - Algunos reactivos de este kit contienen azida sódica como conservante. La azida sódica puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante. Precauciones de manejo: - Ajustar el lavador al tipo de placa utilizado (fondo en U) para realizar un buen lavado. - No mezclar reactivos procedentes de diferentes lotes. - No usar los reactivos una vez hayan caducado. - No utilice el reactivo si observa algún cambio de apariencia en cualquier componente incluido en el kit. - Deben extremarse las precauciones para evitar contaminaciones microbianas y contaminación cruzada entre los reactivos. - Utilizar una nueva punta desechable para pipetear cada muestra o reactivo. - Es muy importante preparar la solución de sustrato-tmb menos de 1 hora antes de ser empleada. Mantenerla en un recipiente bien tapado y al abrigo de la luz. - Restos de jabones y/o agentes oxidantes en los recipientes utilizados para la preparación de la solución sustrato-tmb, pueden interferir en la reacción. En caso de que se utilicen recipientes de vidrio, es conveniente lavarlos con ácido sulfúrico o clorhídrico 1N, enjuagarlos bien con agua destilada y secarlos antes de usarlos. Usar preferiblemente material plástico desechable.

3 Conservación y estabilidad Los componentes permanecerán inalterados hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conservan entre 2-8 C. La bolsa que contiene la microplaca debe llevarse a temperatura ambiente antes de abrirla para evitar condensación en los pocillos. Una vez abierta la bolsa, la microplaca es estable por 5 semanas guardada a 2-8 C en la bolsa de plástico bien cerrada, con la bolsita de silicagel. La solución de lavado, una vez diluida, es estable durante 7 días a temperatura ambiente y durante 30 días si se conserva entre 2-8 C. El conjugado, una vez diluido debe ser utilizado dentro de 3 horas. Guardar el cromógeno al abrigo de la luz. La solución sustrato-tmb una vez preparada es estable por 60 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Si se aprecia un color azul, descarte la solución y prepárela de nuevo. Presentaciones disponibles - Kit de 1 placa (96 tests), REF Contiene: 1 placa, 1 x 0,4 ml conjugado concentrado, 1 x 20 ml diluyente del conjugado, 1 x 30 ml diluyente de muestra, 1 x 50 ml solución de lavado, 1 x 30 ml tampón sustrato, 1 x 1 ml cromógeno, 1 x 12 ml solución de parada, 1 x 0,8 ml control negativo, 1 x 0,8 ml control positivo de HIV-1, 1 x 0,6 ml control positivo de HIV- 2, 1 bolsa de plástico y hojas adhesivas. - Kit de 5 placas (5 x 96 tests), REF Contiene: 5 placas, 1 x 1,5 ml conjugado concentrado, 1 x 80 ml diluyente del conjugado, 1 x 80 ml diluyente de muestra, 2 x 100 ml solución de lavado, 1 x 100 ml tampón sustrato, 1 x 1 ml cromógeno, 1 x 4,0 ml control negativo, 1 x 3,0 ml control positivo de HIV-1, 1 x 2,0 ml control positivo de HIV-2, 1 bolsa de plástico y hojas adhesivas. Material necesario no incluido - Agua destilada o desionizada. - Pipetas multicanal y micropipetas (50 µl, 100 µl) y puntas desechables. - Incubador a 37 C ± 1 C. - Cronómetro. - Lector de microplacas con filtro de 450 nm. Recomendable filtro de referencia de 620 ó 630 nm. - Sistema de lavado manual o automático. - Solución de parada (kit de 5 placas): ácido sulfúrico 1N. También puede emplearse ácido sulfúrico 2N ó 4N. Recolección de la muestra Usar suero fresco o plasma (EDTA). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Las muestras pueden ser conservadas durante 3 días entre 2-8 C. Si es por un período de tiempo más largo las muestras deben ser congeladas (-20 C). Debe evitarse congelar y descongelar las muestras repetidamente. Partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. Los sueros o plasmas no deben ser inactivados por calor, ya que puede conducir a resultados incorrectos. Procesamiento automático Esta prueba permite su uso de modo automático o semi-automático en diferentes instrumentos. Es muy importante validar cualquier sistema automático para demostrar que los resultados obtenidos para las muestras son equivalentes a los obtenidos empleándose el ensayo manual. Se recomienda que el usuario valide periódicamente el instrumento. Si encuentra cualquier dificultad en la programación y ajuste de los procesadores automáticos de Biokit, por favor contacte con su distribuidor. PROCEDIMIENTO (Ver esquema del procedimiento) Operaciones previas Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (20-25 C) antes de empezar el ensayo. Homogeneizar suavemente los reactivos líquidos antes de usarlos. Diluir la solución de lavado concentrada 1/20 con agua destilada o desionizada. Por ejemplo: 50 ml de solución concentrada en 950 ml de agua. La solución de lavado concentrada (20x) puede presentar cristales después de almacenarse a 2-8 C por largo tiempo. Los cristales deben disolverse mediante calentamiento a 37 C antes de utilizar la solución. Diluir el conjugado concentrado con el diluyente de conjugado de acuerdo con la tabla 1. Mezclar bien. Es recomendable diluir el conjugado 10 minutos antes de su uso. TABLA 1 Tiras requeridas Diluyente del conjugado ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Conjugado concentrado µl

4 Realización de la prueba 1. Determinar el número total de pocillos necesarios para el ensayo. Además de las muestras, debe reservarse 1 pocillo para el blanco del sustrato, 3 para el control negativo, 2 para el control positivo de HIV-1 y 1 pocillo para el control positivo de HIV Dispensar 100 µl de diluyente de muestras en todos los pocillos a excepción del blanco. Dispensar 50 µl de suero o plasma de las muestras en los pocillos correspondientes. Dispensar 50 µl de control negativo, 50 µl de control positivo de HIV-1 y 50 µl de control positivo de HIV-2 en los pocillos correspondientes. 3. Cubrir la placa con la lámina adhesiva, mezclar suavemente e incubar durante 60 minutos a 37 C. 4. Quitar y desechar la lámina adhesiva. Aspirar el contenido de los pocillos y llenarlos completamente (aproximadamente 300 µl) con solución de lavado diluida. Repetir el proceso de aspiración lavado 4 veces más. Asegurarse de que cada columna de pocillos esté en remojo al menos 15 segundos antes del nuevo ciclo de aspiración. Después del último lavado golpear la placa invertida sobre un papel absorbente para eliminar cualquier exceso de líquido en los pocillos. 5. Añadir 100 µl de conjugado diluido en cada pocillo excepto el blanco. 6. Cubrir la placa con una lámina adhesiva e incubar a 37 C durante 30 minutos. 7. Durante los últimos minutos de esta incubación, preparar la solución sustrato-cromógeno. El tampón sustrato y el cromógeno (TMB) deben estar a temperatura ambiente antes de preparar la solución de trabajo. Preparar el volumen necesario según la tabla 2. Mezclar suavemente. La solución final debe ser incolora; descartar en caso de que se vuelva azul. TABLA 2 Tiras requeridas Tampón sustrato ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Cromógeno (TMB) µl Quitar y desechar la lámina adhesiva. Aspirar y lavar según el procedimiento descrito en el paso Añadir 100 µl de sustrato-tmb a todos los pocillos, incluso el banco. 10. Incubar durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (20-25 C). 11. Añadir 100 µl de solución de parada a cada pocillo, guardando la misma secuencia y con los mismos intervalos observados en la adición del sustrato-tmb. 12. Ajustar el cero del lector con el pocillo del blanco y leer la absorbancia de cada uno de los pocillos a 450 nm, en el plazo máximo de 30 minutos. Se recomienda utilizar filtro de referencia de nm. Control de calidad Los resultados de un ensayo son válidos si se cumplen los siguientes criterios: 1. Blanco del sustrato: El valor de absorbancia debe ser inferior o igual a 0, Media del control negativo (CNx): Calcular el promedio de los valores de absorbancia obtenidos para el control negativo. Cada uno de los valores individuales obtenidos debe ser igual o mayor a 0,5 veces CNx e igual o inferior a 1,5 veces CNx. Si alguno de los valores no entra dentro de los límites debe descartarse y recalcularse la media. Si son dos los valores fuera de límites, la prueba deberá repetirse. La media de los valores de absorbancia de los controles negativos debe estar por debajo de 0,150 después de restar el blanco. CNx < 0,150

5 3. Media del control positivo HIV-1 (CPx): La media de los valores de absorbancia del control positivo después de restar el blanco debe ser mayor o igual que la media de los controles negativos más 0,700. CPx CNx + 0, Control positivo HIV-2: La absorbancia después de restar el blanco debe ser mayor que el valor umbral. Si es menor, el ensayo es inválido y la prueba deberá repetirse. Resultados 1. Calcular el valor umbral sumando 0,250 a la media del control negativo. Valor umbral = CNx + 0,250 Ejemplo: CNx = 0,045 Valor umbral = 0, ,250 = 0, Dividir la absorbancia de la muestra por el valor umbral. Positivo: relación absorbancia/valor umbral 1,0 Negativo: relación absorbancia/valor umbral < 0,9 Dudoso: relación absorbancia/valor umbral 0,9 < 1,0 Interpretación de resultados Un resultado positivo para de anticuerpos anti-hiv indica que el individuo puede desarrollar el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). La sangre de esta persona probablemente contiene el virus (HIV) y no debe ser utilizada para transfusiones o manufactura de productos inyectables. Aunque un resultado positivo signifique infección por HIV-1 o HIV-2, sólo se podrá hacer el diagnóstico de SIDA clínicamente, cuando la persona cumpla la definición establecida por el Centers for Disease Control (CDC), Atlanta, USA. Limitaciones del procedimiento Toda muestra que haya dado un resultado positivo o dudoso debe analizarse de nuevo por duplicado. Si el resultado es repetidamente positivo o dudoso, debería analizarse con otros métodos. Se recomienda probar las muestras repetidamente reactivas con un test adicional de confirmación como por ejemplo, inmunofluorescencia, (IFA) o Western blot. Para el correcto funcionamiento del kit debe seguirse estrictamente las instrucciones descritas. Cualquier desviación puede dar origen a resultados aberrantes. Como en todos los inmunoensayos muy sensibles, existe la posibilidad de resultados positivos que no se repiten. Un resultado negativo no excluye la posibilidad de infección por HIV. Resultados esperados El número de resultados positivos depende de la incidencia de la enfermedad en el área geográfica y el tipo de población estudiada. En el mundo, la incidencia de HIV en población mayor de 15 años varía desde 0,1% en Australia, Nueva Zelanda y Asia Pacífico, 0,3% en la Europa Occidental, África del norte y Oriente Medio, 0,5% en Europa del Este, Asia central y Latinoamérica, 0,6% en América del Norte y Sudeste Asiático, hasta el 9% en África subsahariana. En un mismo país la incidencia varía enormemente según el tipo de población estudiada. En Europa occidental la prevalencia de anticuerpos frente a HIV en población de banco de sangre varía entre 0 y 5 casos por cada donaciones, mientras que la incidencia en presos, prostitutas y drogadictos puede superar fácilmente el 20% en estas poblaciones de riesgo. Características funcionales Evaluaciones Sensibilidad Para evaluación de la sensibilidad se probaron varios paneles comerciales e internos. - Paneles de seroconversión: NABI anti-hiv-1 seroconversion panel SVO y BBI anti-hiv-1 PRB904, PRB910, PRB923, PRB924, PRB922 y PRB930. La detección más precoz del bioelisa HIV-1+2 (rec) fue en el día 15 para el panel SVO , día 92 para el PRB904, día 26 para el PRB910, día 47 para el PRB923, día 33 para el PRB924, día 4 para el PRB922, y día 7 para el PRB930. En comparación, las detecciones más precoces fueron en los días 13, 92, 26, 47, 33, 4, 0 y 7 respectivamente para el Método comercial A y 15, 20, 92, 26, 84, > 40, > 11 y > 10 para el Método B.

6 - Otros paneles: BBI anti-hiv low titre performance panel (PRB106) y anti-hiv 1/2 Combo performance panel (PRZ203), 11 muestras de donantes de sangre positivas por Western blot. También se incluyó el worldwide HIV-1 performance panel, WWRB301 para evaluar la reactividad a HIV-1 del subtipo O. El kit detectó todas las 11 muestras de donantes como positivas. De las 15 muestras del low titre performance panel (PRB106), el kit detectó todas las 14 positivas por el Método comercial A, de las cuales 9 son positivas y 5 son indeterminadas por Western blot. De las 15 muestras del anti-hiv-1/2 Combo performance panel (PRB203), el kit detectó las 14 que son también positivas por el Método A y por Western blot. El kit detectó también muestras de HIV-1 subtipo O del Worldwide HIV-1 performance panel WWRB Todas las muestras de un panel interno de 25 sueros caracterizados como positivos de títulos variados con otros tests de tercera generación y Western Blot fueron reactivas, con una sensibilidad del 100%. Especificidad - En una evaluación de especificidad se analizaron 5065 muestras de suero y plasma de donantes de sangre sanos. De estas, 3 presentaron resultado inicialmente reactivo y solamente 1 fue repetidamente positiva. Por tanto, la especificidad en el cribado fue del 99,94% y la especificidad final del 99,98%. - En otro estudio se probaron 250 muestras en comparación con otros métodos comerciales de tercera generación para detección de anticuerpos frente a HIV. De las muestras, 140 eran de donantes sanos, 90 eran positivas de anti-hcv y 20 eran positivas de anticuerpos anti-nucleares (ANA). Todos los resultados fueron negativos con el bioelisa, obteniéndose una especificidad del 100%. - En otra evaluación se probaron 192 muestras de donantes de sangre, de las cuales 1 presentó resultado positivo pero no se confirmó. La especificidad obtenida fue del 99,5%. Precisión Reproducibilidad intra-ensayo: Seis concentraciones diferentes de un control positivo se probaron en 20 replicados. Los coeficientes de variación obtenidos para las absorbancias variaron del 2,7% al 8,9%. Reproducibilidad inter-ensayo: Los coeficientes de variación obtenidos para 6 muestras probadas en diferentes ensayos variaron del 6,1% al 14,5%. Interferencias Con el objeto de estudiar posibles interferencias se han analizado muestras con riesgo potencial de producir reacciones cruzadas. Tales muestras incluían sueros positivos anticuerpos antinucleares (ANA) y de hepatitis C. No se han observado evidencias de interferencias.

7 bioelisa: Guía de problemas Problema Posibles causas Solución 1. Controles fuera de validación. 1a. Temperatura, incubación o pipeteo incorrecto. Comprobar procedimiento. 1b. Preparación incorrecta de reactivos, error en las diluciones. Reactivos no mezclados correctamente. Comprobar procedimiento. 2. Sin color o poco color al final del ensayo. 1c. Contaminación cruzada entre controles. 1d. Filtro de lectura incorrecto. 1e. Interferencia en el camino óptico. 1f. Se han utilizado componentes de lotes diferentes. Pipetear cuidadosamente. No intercambiar los tapones de los viales. Comprobar que el filtro de lectura sea de 450 nm. Si no se usa filtro de referencia de 620 o 630 nm, las absorbancias aumentan aproximadamente 50 miliunidades. Comprobar el lector. Limpiar o secar el fondo de los pocillos. Comprobar que no haya burbujas de aire. Repetir la lectura. No utilizar componentes de lotes diferentes puesto que están ajustados para cada lote en particular. 1g. Reactivos caducados. Comprobar la caducidad del kit y de sus componentes. Utilizar el conjugado diluido antes de su caducidad. No utilizar un kit caducado. 2a. Uno o más reactivos no añadidos o añadidos en secuencia equivocada. 2b. Conjugado inactivo: dilución incorrecta o mala conservación. 2c. Microplaca inactiva: conservación incorrecta. 2d. Sustrato inactivo: conservación o dilución incorrecta, el contenedor utilizado afecta la estabilidad del sustrato, contaminación cruzada con la solución de parada. Comprobar el procedimiento. Comprobar si ha habido contaminación, comprobar el procedimiento. Repetir el ensayo. Mantener siempre las tiras no utilizadas en la bolsa de plástico bien cerrada, con el desecante dentro. Repetir el ensayo. Utilizar siempre una dilución fresca de TMB en tampón sustrato. Usar contenedores desechables o lavados con ácido o etanol y enjuagados con agua desionizada. Comprobar el procedimiento.

8 bioelisa: Guía de problemas Problema Posibles causas Solución 3. Demasiado color en todos los pocillos de la microplaca. 3a. Sustrato contaminado, oxidado o preparado incorrectamente. Comprobar que el sustrato preparado sea incoloro. Mezclar bien el TMB con el tampón sustrato. Utilizar viales o contenedores desechables o lavados con solución ácida o etanol. 4. Reproducibilidad pobre o elevado número de muestras reactivas que no se repiten. 3b. Reactivos contaminados o preparados incorrectamente. 3c. Solución de lavado (1x) contaminada. 3d. Lavado insuficiente o no consistente: llenado o aspiración insuficiente o no uniforme, número de ciclos de lavado insuficiente. Lavador contaminado. Comprobar contaminación (aspecto turbio). Comprobar diluciones. Comprobar la calidad del agua destilada/desionizada utilizada para preparar la dilución. Comprobar el lavador. Llenar los pocillos hasta el tope y aspirar completamente. Incrementar el número de ciclos de lavado. Golpear la placa invertida contra papel absorbente. Repetir el ensayo. 3e. Se ha utilizado solución de lavado de otro kit. Utilizar sólo la solución de lavado del kit. 4a. Problemas de lavado. Ver apartados 3c, 3d, 3e. 4b. Pipetas mal calibradas o Utilizar pipetas calibradas con puntas mal encajadas. puntas bien ajustadas. Técnica de pipeteo Pipetear cuidadosamente sin incorrecta. burbujas ni salpicaduras. 4c. Reactivos y muestra no a temperatura ambiente o no correctamente mezclados antes de usar. 4d. Corrientes de aire sobre la microplaca durante las incubaciones. 4e. Demasiado tiempo en la adición de muestras y/o reactivos. Inconsistencia en los intervalos de tiempo, burbujas de aire. 4f. Interferencia en el camino óptico. Atemperar muestras y reactivos y mezclarlos bien antes de utilizarlos. Mantener la microplaca protegida de las corrientes de aire. Desarrollar una técnica uniforme y reproducible. Ver 1e.