Brucella IgG ELISA. 12x8

Transcripción

1 Instrucciones de Uso Brucella IgG ELISA Inmunoensayo enzimático (tiras de microtitulación) para la determinación cualitativa y cuantitativa de anticuerpos IgG contra Brucella en suero y plasma humanos. RE x8 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. USO PROPUESTO Inmunoensayo enzimático para la determinación cualitativa y cuantitativa de anticuerpos IgG contra Brucella en suero y plasma humanos. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS La brucelosis es una enfermedad infecciosa provocada por pequeñas bacterias elipsoides gram negativas. Existen cuatro microorganismos diferentes: Br. abortus, Br. melitensis, Br. suis y Br. canis. Las personas se infectan por el contacto con animales infectados o comiendo carne o leche no pasteurizada de animales infectados. Los humanos infectados no son contagiosos. El periodo de incubación puede durar de una a tres semanas, en algunos casos dos meses. Br. abortus y Br. melitensis provocan la enfermedad de Bang, y de manera excepcional la fiebre de Malta. Los síntomas típicos de la enfermedad de Bang producen periódicamente fiebre, esplenomegalia e inflamación de los ganglios linfáticos. En algunos casos se produce una inflamación de las diferentes articulaciones y órganos. La fiebre de Malta está provocada por el tipo epidémico de la brucelosis. La infección casi siempre supone una manifestación clínica. La brucela también puede provocar hepatitis brucelósica. Además, es posible que exista relación entre una infección con brucela y un brote de esclerosis múltiple. Durante una terapia con antibióticos o una infección crónica, la detección de Brucella spec. en sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, esputo u otros líquidos corporales puede ser negativa. Los métodos serológicos, como la aglutinación, la reacción de fijación de complemento, la prueba Coombs anti-brucela y ELISA resultan alternativas adecuadas. Pueden servir de indicador habitual para controlar el estado de los anticuerpos de la infección. Durante los primeros días, la única inmunoglobulina que aparece es la IgM. A medida que la enfermedad avanza, la IgM disminuye cuantitativamente y la IgG prevalece. En la brucelosis crónica. La IgG se puede producir durante periodos prolongados. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El inmunoensayo enzimático sobre fase sólida (ELISA) está basado en el principio del sandwich. Los pocillos están recubiertos con un antígeno. Los anticuerpos específicos de la muestra que se unen a los pocillos recubiertos con el antígeno son detectados por un conjugado enzimático del segundo anticuerpo (E-Ab) específico para el antígeno humano IgG. La intensidad del color desarrollado por la reacción del substrato es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos IgG detectados. Los resultados de las muestras se pueden determinar directamente usando la curva estándar. 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. Evite el contacto con la Solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel. 9. Algunos reactivos contienen azida de sodio (NaN 3 ) como preservativo. En caso de contacto con los ojos o la piel, lávese inmediatamente con agua. La NaN 3 puede reaccionar con el plomo o el cobre de las cañerías formando azidas metálicas explosivas. Cuando elimine los reactivos y para evitar acumulaciones, lave con gran cantidad de agua. 10. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y encontrados negativos para anti-hiv I/II, HBsAg and anti-hcv. Sin embargo, la presencia de estos u V2012_08 1 / 6

3 otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación. 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. La placa de microtitulación es estable hasta la fecha de caducidad del juego de reactivos aún cuando la bolsa haya sido abierta, siempre que se vuelva a cerrar herméticamente y se almacene a 2-8 C. 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Suero, Plasma (EDTA, Heparina) Se deben observar las precauciones usuales para la venipuntura. Es importante preservar la integridad química de la muestra de sangre desde el momento de su toma hasta el ensayo. No emplee muestras fuertemente hemolizadas, lipémicas o ictéricas. Las muestras que presenten turbidez deben centrifugarse antes de ensayar para eliminar cualquier material particulado. Almacenamiento: 2-8 C -20 C Estabilidad: 2 dias > 2 dias 7. MATERIALS SUPPLIED Cantidad Símbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 15 ml ENZCONJ IgG 1 x 4 x 2 ml CAL A-D 1 x 60 ml DILBUF Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. Evite congelar y descongelar repetidamente. Placa de Microtitulación Tiras separables. Revestido con antígenos específicos. Conjugado Enzimático IgG Coloreado en rojo. Listo para usar. Contenido: anti humano IgG, conjugado con peroxidasa, solución buffer proteica, estabilizadores. Estándar A-D 1; 10; 40; 150 U/mL. Listo para usar. Estándar A = Control Negativo Estándar B = Control Cut-Off Estándar C = Control Positivo débil Estándar D = Control Positivo Contenido: IgG anticuerpos contra Brucella, PBS, estabilizadores. Solución Buffer de Dilución Listo para usar. Contenido: PBS Solución buffer, BSA, < 0.1 % NaN x 60 ml WASHBUF CONC Solución Buffer de Lavado, Concentrado (10x) Contenido: PBS Solución buffer, Tween x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP 2 x FOIL 1 x BAG Solución de Substrato TMB Listo para usar. Contenido: TMB Solución de Parada TMB Listo para usar. 0.5 M H 2SO 4. Folio Adhesivo Para cubrir la Placa de Microtitulación durante la incubación. Bolsa de plástico Resellable. Para el almacenamiento de tiras no usadas. 8. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o aparatos similares, < 3 % CV). Volumenes: 5; 50; 100; 500 µl 2. Cilindros calibrados 3. Tubos (1 ml) para la dilución de muestras 4. Micropipeta de 8 canales con depósito para reactivos 5. Botella para la solución de lavado, sistema de lavado de placas de microtitulación automático o semiautomático 6. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia nm) 7. Agua bidestilada o desionizada 8. Toallas de papel, puntas de pipetas y cronómetro V2012_08 2 / 6

4 9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa. 5. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales. 6. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos. 7. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO El contenido del kit para 96 determinaciones puede ser dividido en 3 ensayos separados. Los volúmenes declarados más abajo son para un ensayo con 4 tiras (32 determinaciones). Diluya / disuelva 20 ml Componente Diluyente Relación Notas Almacenamiento Estabilidad WASHBUF CONC 200 ml agua bidest 1:11 Para disolver los cristales, temple hasta 37 C. Mezcle vigorosamente 2-8 C 8 sem Dilución de Muestras Muestra para ser diluído con Relación Notas Suero / Plasma generalmente DILBUF 1:101 p.e. 5 µl µl DILBUF Las muestras cuyas concentraciones son mayores a la del mayor estándar deben ser diluidas. V2012_08 3 / 6

5 11. TEST PROCEDURE 1. Pipetee 100 µl de cada Estándar y muestra diluída en cada pocillo respectivo de la Placa de Microtitulación. En el ensayo cualitativo solo se utiliza el Estándar B. 2. Cubra la placa con un folio adhesivo. Incube 60 min a C. 3. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 3 x con 300 µl de Solución Buffer de Lavado diluída. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 4. Pipetee 100 µl de Conjugado Enzimático en cada pocillo. 5. Cubra la placa con un nuevo folio adhesivo. Incube 30 min a C. 6. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 3 x con 300 µl de Solución Buffer de Lavado diluída. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 7. Para la adición del substrato y solución de parada utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales. La adición de substrato y solución de parada debe llevarse a cabo en intervalos de tiempo iguales. Evite la formación de burbujas pipeteando con sobrevolumen. 8. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TMB en cada pocillo. 9. Incube 20 min a C en la oscuridad (sin el folio adhesivo). 10. Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 µl de Solución de Parada TMB en cada pocillo. Mezcle el contenido brevemente agitando cuidadosamente la placa. El color cambia de azul a amarillo. 11. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: nm) dentro de los 60 min de haber agregado la Solución de Parada. 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados del ensayo sólo son válidos si éste se ha llevado a cabo siguiendo las instrucciones. Además, el usuario debe seguir estrictamente las regulaciones de GLP (Good Laboratory Practice) u otras regulaciones o leyes aplicables. Todos los estándares/controles del juego de reactivos deben encontrarse en los rangos de aceptación indicados en el Certificado de Control de Calidad. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS La evaluación de la prueba se puede realizar ya sea cuantitativa o cualitativa Evaluación Cualitativa El Valor de Corte está dado por la densidad óptica (DO) del Estándar B (Nivel de Corte). El Indice de Corte (COI) se calcula a partir de la media de densidad óptica de la muestra y el Valor de Corte. Si la densidad óptica de la muestra está dentro de un rango de 20 % de todo el Valor de Corte (Zona gris) la muestra tiene que ser considerada como límite. Las muestras con mayor DOs son positivas, las muestras con menos DOs son negativas. El Índice de Corte de las muestras puede ser calculado de la siguiente manera: COI = DO Muestra DO Estándar B Evaluación Cuantitativa La DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en papel semi-logarítmico o empleando un método automático. En caso de usar un programa de computadora para el cálculo, se recomienda los algoritmos Cubic-Spline y Punto a punto, ya que presentan la mayor exactitud en comparación con otros métodos. Para el cálculo de la curva estándar, use las mediciones obtenidas de los estándares (es aconsejable no emplear valores duplicados). La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar. V2012_08 4 / 6

6 Al momento de leer los resultados en el gráfico, tome en cuenta la dilución inicial. Los resultados de muestras diluídas con un factor mayor al inicial, deben ser multiplicados por el factor correspondiente. Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente. Curva de Calibración Típica (Ejemplo. No usar para el cálculo!) Estándar U/mL DO Media A B C D INTERPRETACION DE RESULTADOS Método Intervalo Interpretación < 8 U/mL negativo 8 12 U/mL dudoso > 12 U/mL positivo < 0.8 negativo dudoso Cuantitativa (Curva de Calibración) Cualitativa (Índice de corte, COI) > 1.2 positivo (OD) Brucella IgG ELISA (U/mL) Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico. 15. VALORES ESPERADOS En un estudio interno con individuos aparentemente saludables, se obtuvieron los siguientes resultados: Interpretación Ig Isotipo n positivo dudoso negativo IgG 88 0 % 0 % 100 % 16. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La toma de la muestra tiene un efecto importante en los resultados. Vea TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO para mayores detalles. La azida y el timerosal en concentraciones > 0.1 % interfieren en este ensayo y pueden conducir a falsos resultados. Los siguientes componentes sanguíneos no tienen un efecto Hemoglobina 8.0 mg/ml significativo (+/- 20 % del esperado) en los resultados del Bilirrubina 0.3 mg/ml ensayo en las concentraciones indicadas a continuación: Triglicéridos 5.0 mg/ml 17. PRUEBAS FUNCIONALES Precisión Medio (U/mL) CV (%) Intra-Ensayo Inter-Ensayo Intervalo (U/mL) Dilución en Serie Intervalo (%) Linearidad hasta / Recuperación % % Recuperación después del enriquecimiento (n = 3) Comparación del Sensitividad rel. > 95 % Método versus ELISA Especificidad rel. > 95 % V2012_08 5 / 6

7 18. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Abdollahi A, Morteza A, Khalilzadeh O, Rasoulinejad M, Brucellosis serology in HIV infected patients, J Infect Dis 14(10): (2010) 2. Araj GF, Evaluation of ELISA in the diagnosis of acute and chronic brucellosis in human beings, J Hyg Camb 97: (1986) 3. Aminzadeh Z, Farrokhi B, Zanjani HA, Aliyari F, Baiati Z, Navaei F, Mirzaei J, Screening of household members and contacts of patients with acute brucellosis to detect unrecognized cases, J Inf Dis Immun 2(3): (2010) 4. Cakan G, Bezirci FB, Kacka A, Cesur S, Aksaray S, Tezeren D, Saka D, Ahmed K, Assessment of Diagnostic Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit and Serological Markers in human Brucellosis, Jpn J Infect Dis 61: (2008) 5. Goldstein J, Blay R, Frasch C, Beining PR, Betts M, Hernandez D, Hoffman T, Golding B, Immunogenicity of Brucella abortus and lipopolysaccharide derived from Brucella abortus, in mouse and human: potential as carriers in development of vaccine for AIDS, p , In MZ Atassi (ed.), Advances in experimental medicine and biology, Plenum Publishing Corp., New York (1991) 6. Heydari F, Mozaffari NA, Tukmechi A, Comparison of Standard Seroagglutination Tests and ELISA for Diagnosis of Brucellosis in West Azerbaijan Province, Iran, Res J of Biological Sciences 3(12): (2008) 7. Karsen H, Tekin Koruk S, Duygu F, Yapici K, Kati M, Review of 17 cases of neurobrucellosis: clinical manifestations, diagnosis, and management, Arch Iran Med 15(8): (2012) 8. MacMillan AP, Greiser-Wilke I, Moennig V, Mathias LA, A competition enzyme immunoassay for brucellosis diagnosis, Dtsch Tierarztl Wochenschr 97(2): (1990) 9. Mailles A, Rautureau S, Le Horgne J, Poignet-Leroux B, D Arnoux C, Dennetiere G, Faure M, Lavigne J, Bru J, Garin-Bastuji B, Re-emergence of brucellosis in cattle in France and risk for human health, Euro Surveill. 17(30) (2012) 10. Murrell TG, Matthews BJ, Multiple sclerosis--one manifestation of neurobrucellosis?, Med Hypotheses 33(1): (1990) 11. Otlu S, Sahin M, Atabay HI, Unver A, Serological Investigations of Brucellosis in Cattle, Farmers and Veterinarians in the Kars District of Turkey, Acta Vet BRNO 77: (2008) 12. Rajai M, Naghili B, Pourhassan A, Comparison of ELISA and STA tests in diagnosis of Brucellosis, Iran J Clin Infect Dis 1(3): (2006) 13. Revich B, Tokarevich N, Parkinson AJ, Climate change and zoonotic infections in the Russian Arctic, Int J Circumpolar Health 71: 1-8 (2012) 14. Smith MC, Exclusion of infectious diseases from sheep and goat farms, Vet Clin North Am Food Anim Pract 6: (1990) 15. Vakili Z, Momen Heravi M, Sharif AR, Masoomi M, Sensitivity and specificity of ELISA test in diagnosis of brucellosis, Kowsar Medical Journal 15(2): (2010) 16. Young EJ, Serologic diagnosis of human brucellosis: analysis of 214 cases by agglutination tests and review of the literature, Rev Infect Dis 13: (1991) V2012_08 6 / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /